Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

Advances on pathogenesis and prevention of enterotoxemia of alpacas

Se revisan las investigaciones recientes realizadas por nuestro grupo de investigadores sobre enterotoxemia de las alpacas en el Perú. Estudios microbiológicos y moleculares demostraron que la mayoría de las cepas aisladas fueron de Clostridium perfringens y estas contienen únicamente el gen cpa de la toxina α(C. perfringens genotipo A) y solamente el 0.4% tienen genes cpa y cpb de las toxinas αy β(genotipo C). En análisis paralelo, se encontró que el 8.5% de los genotipos A contenían, adicionalmente, el gen cpb2, pero ninguna cepa tenía el gen cpe de la enterotoxina. Estos resultados evidencian que las exotoxinas secretadas, y no las endotoxinas (cpe), serían los probables factores de virulencia clostridiales en la enterotoxemia de la alpaca. Adicionalmente, en el análisis histopatológico de intestinos infectados, el 30.6% de las muestras presentó abundantes estructuras parasitarias inmaduras correspondientes a Eimeria macusaniensis, afectando la mucosa y epitelio de las glándulas crípticas intestinales, sugiriendo a las infecciones coccidiales como uno de los posibles factores desencadenantes o predisponentes de la enterotoxemia. Estos resultados microbiológicos permitieron diseñar, preparar y mejorar una vacuna convencional inactivada que contiene, mayoritariamente, componentes bacterianos y exotoxinas A, Aβ2 y C aislados de casos fatales de la enfermedad. Desde su introducción en una empresa alpaquera del sur peruano en 2001, la vacuna ha logrado reducir progresivamente los índices de mortalidad por enterotoxemia de 19.5% (2000, sin vacuna) hasta alcanzar tasas menores al 5% en 2006.

The results of our recent research work on enterotoxemia in Peruvian alpacas are presented. Microbiological and molecular analyses found that the majority of the isolates corresponded to Clostridium perfringens and contained the cpa coding gene for αtoxin (A genotype) while 0.4% contained both the cpa and cpb genes of the αand βtoxins (C genotype). A parallel study revealed that 8.5% of the genotype A isolates also had cpb2, but the cpe (enterotoxin) gene was absent in all cases. These results highly suggest that the exotoxins secreted by C. perfringens are the virulent factors in enterotoxemia, rather than the endogenous enterotoxin. Additionally, an histopathological study of intestinal samples from fatal cases showed that 30.6% had abundant immature structures of Eimeria macusaniensis affecting deep mucosa and cryptic gland epithelia, primarily in the jejune and ileum, suggesting that eimeriosis is likely a triggering or predisposing factor for the development of enterotoxemia. The microbiological studies allowed the design and progressive improvement of an inactivated enterotoxemia vaccine containing primarily the bacterial component plus exotoxins of types A, Aβ2 and C isolated from natural fatal cases of the disease. During six years of field tests in southern Peru, the vaccine has steadily reduced specific neonatal mortality rates due to enterotoxemia from 19.5% (2000, without vaccine) to less than 5% in 2006.

Neonatal enteric complex in andean alpacas

Se revisan avances de investigaciones sobre los principales agentes causales de morbilidad y mortalidad en alpacas neonatales asociadas a procesos entéricos en el sur peruano. Análisis microbiológicos confirman al Clostridium perfringens tipo A como el agente prevalente en fatalidades asociadas con enterotoxemia e identifican por primera vez la presencia del gen secundario β2. El análisis in vitro argumenta la existencia de cepas con tres perfiles en la actividad fosfolipídica (alta, mediana y baja), mostrando que las cepas de medianas y altas producciones fueron capaces de producir lesiones intestinales en conejos pero incapaces de producir similares lesiones en crías de alpacas. Estudios histopatológicos revelan la coexistencia de Clostridium y E. macusaniensis en lesiones de enteritis hemorrágica en muestras intestinales de crías muertas por enterotoxemia, sugiriendo a las infecciones coccidiales como posibles agentes desencadenantes de fatalidades conocidas como enterotoxemia. Por otro lado, estudios realizados en hisopados clínicos o contenidos intestinales han identificado molecularmente cepas de E. coli patogénicas (enteropatogénicas y enterohemorrágicas). Adicionalmente, en casos clínicos de diarreas neonatales, mediante inmunofluorescencia directa y PCR, se ha detectado Giardia intestinalis coexistiendo con cepas de E. coli enteropatogénicas, así como un coronavirus similar al virus bovino. Estos patógenos son potenciales causantes de procesos diarreicos en animales incluyendo a poblaciones humanas.

Advances in research on the major causative agents of morbidity and mortality in newborn alpacas associated with enteric processes in southern Peru were reviewed. Microbiology and molecular analyses performed on intestinal samples from enterotoxemia fatalities confirmed the predominance of C. perfringens type A carrying only the gene coding for the major α exotoxin and identifiying for the first time the presence of the novel β2 toxin gene. In vitro studies have yielded three profiles for phospholipase activity (high, medium and low) with biological activity when high and medium strains were inoculated intraintestinally in mice and rabbits, but did not induce intestinal pathology in an alpaca cria. A detailed histopathological investigation has reveled that within necrotizing hemorrhagic enteritis Clostridium coexist with massive presence of Eimeria macusaniensis suggesting that primary parasite tissue destruction may well predispose overgrowth of clostridium and toxin production, triggering enteric fatalities. Additionally, studies on diarrheas intestinal swabs and/or intestinal contents identified Escherichia coli pathogenic strains (enteropathogenic and enterohemorrhagic). The immunofluorescent direct test and PCR revealed the presence of Giardia intestinalis coexisting with mostly enteropathogenic and enterohemorrhagic E. coli strains, as well as with a virus similar to bovine coronavirus. These microbes are potentially diarrheagenic pathogens and a possible infection source for Andean people.

Molecular genotyping and subtyping of clostridium perfringens isolated from fatal enterotoxemia in alpacas

A pesar de que la enterotoxemia causada por el Clostridium perfringens ocasiona elevadas tasas de mortalidad neonatal en alpacas, muy poco se conoce acerca de las toxinas que participan en la patogénesis de la enfermedad. El presente estudio reporta resultados de análisis moleculares de 47 cepas de C. perfringens aislados de casos mortales de enterotoxemia en alpacas, basados en la amplificación de los genes cpa, cpb, etx y iap codificantes de las toxinas α, β, g, e Ǯ (genotipificación), así como la detección de genes secundarios codificantes de la enterotoxina (cpe) y toxina β2 (subtipificación). El ADN bacteriano de las 47 cepas fue sometido a prueba de PCR múltiple evidenciando que 46/47 (97.9%) de los aislamientos correspondieron al genotipo A y de estos, 13/46 (28.3%) contenían adicionalmente el gen β2 (subtipo cpe-vocpb2+vo), mientras que las restantes 33 muestras (71.7%) fueron negativas para ambos genes secundarios (subtipo cpe-vocpb2-vo). Solo una de las 47 (2.1%) muestras correspondió al genotipo C y positivo al gen CPE (subtipo cpe+vocpb2-vo). Estos resultados sugieren la posible participación de la toxina alfa y beta2 en los casos de enterotoxemia de las alpacas, pero excluyen a la enterotoxina.

Although enterotoxemia produced by Clostridium perfringens causes elevated neonatal mortality in the alpaca, scarce information exists on the virulence factors (toxins) which play an important role in the pathogenesis of the disease. The objective of this study was to genotype and subtype C. perfringens isolates from enterotoxemia induced mortalities based on the presence of genes cpa, cpb, etx and iap which encode the toxins α, β, g, and Ǯ, and the genes cpe and cpb2 which encode the enterotoxin (cpe) and β2- toxins, respectively. A total of 47 C. perfringens isolates were obtained from the small intestine of neonatal alpaca mortalities which presented clinical signs, as well as gross and histological injuries typical of enterotoxemia. The results showed that 46/47 (97.9%) of the isolates were genotype A, 13 of these 46 (28.3%) also had cpb2 (genotype A, subtype cpe-cpb2+), while the remaining 33 (71.3%) were negative for both cpe and cpb2 genes (genotype A, subtype cpe-cpb2 -) and only 1/47 (2.1%) had the cpa, cpb y cpe genes (genotype C, subtype cpe+cpb2-). The results indicate that both the alpha and beta2 toxins likely play an important role in enterotoxemia aetiology, but excluded participation of the enterotoxin

Genotypification, in vitro toxigenic evaluation, and antibiotic sensitivity of escherichia coli strains isolated from diarrheic and fatal cases in neonatal alpacas

Se analizaron 27 hisopos diarreicos rectales y 24 contenidos patológicos del intestino de 51 alpacas de 1 a 7 semanas de edad para aislar y genotificar Escherichia coli, y caracterizar su sensibilidad antimicrobiana. Los aislamientos de E. coli fueron genotipificados por PCR múltiple para detectar genes de virulencia: stx1 y stx2 (shigatoxina 1 y 2), eae (intimina) y bfp (Bundle-Forming Pili), lt (toxina termolábil), sta y stb (toxina termoestable A y B), presentes en E. coli enterohemorrágica (EHEC), enteropatógena (EPEC) y enterotoxigénica (ETEC). Paralelamente, cepas positivas a stx1 o stx2 fueron analizadas en células Vero para detectar efectos verocitotóxicos. Posteriormente, todas las cepas aisladas fueron evaluadas para determinar su sensibilidad antimicrobiana a ocho antibióticos frecuentemente utilizados en ganaderías alpaqueras altoandinas. Los análisis microbiológicos y moleculares determinaron aislamientos de E. coli potencialmente patógenas en 19/27 (70.4%) de los hisopados clínicos y en 11/24 (45.8%) de los contenidos analizados. En crías padeciendo diarreas clínicas, se identificaron 18/19 (94.7%) cepas EPEC y la restante EHEC positiva al gen stx2 de baja actividad verocitotóxica (1:16). Once de las cepas EPEC contenían ambos genes eae y bfp y las siete restantes solamente el gen eae. De las crías muertas con antecedentes diarreicos, en 6/11 (54.5%) se aislaron cepas EPEC positivos al gen eae, mientras que las cinco restantes (45.5%) fueron EHEC. Tres de las 5 EHEC tenían el gen stx1 (dos con alta actividad verocitotóxica), la cuarta presentó el gen stx2 expresando alta actividad verocitotóxica, pero en el quinto aislado, positivo a ambos genes stx1 y stx2, no pudo evaluarse la actividad verocitotóxica. El 80% del total de E. coli (patogénicas y no patogénicas) aisladas en el estudio demostraron resistencia a la neomicina, y el 25% a la oxitetraciclina. Los resultados evidencian que las alpacas albergan cepas de E. coli potencialmente patógenas y probablemente causantes de patologías intestinales en crías de alpacas andinas.

Clinical rectal diarrheic swabs (n=27) and pathological intestinal contents (n=24) from 51 alpacas between 1 to 7 weeks of age were used to isolate and genotype Escherichia coli, and to test for antimicrobial sensibility. All the E. coli isolates, confirmed by the API system, were genotyped by Multiplex PCR to determine the presence of virulence genes: stx1 and stx2 (shigatoxin 1 and 2), eae (intimin), bfp (Bundle-Forming Pili), lt (heat-labile toxin), sta and stb (heat-stable toxin A and B), in enterohemorrhagic (EHEC), enteropathogenic (EPEC) or enterotoxigenic (ETEC) E. coli strains. Positive stx1 and stx2 strains were tested on Vero cells for verocytotoxicity, and all isolates were tested for antimicrobial sensibility to the eight most frequent used antibiotics in Andean livestock. Microbiological and molecular analysis revealed the presence of pathogenic E. coli strains in 19/27 (70.4%) of the clinical diarrhea cases and 11/24 (45.8%) of the pathological intestinal content samples. In crias suffering from diarrhea, 94.7% (18/19) of the pathogenic isolates were EPEC strains while the remaining was stx2 EHEC with a low expression of verocytoxic activity (1:16). Eleven of the 18 EPEC were positive for both eae and bfp, while the remaining seven were eae positive only. Six of the 11 (54.5%) isolates from intestinal contents were EPEC eae positive only, while the remaining five (45.5%) were EHEC isolates. Three of the 5 EHEC isolates tested positive to stx1 with two expressing high verocytotoxicity, while the fourth tested positive for stx2 with similar high expression of verocytotoxicity, and the fifth was positive for both stx1 and stx2 genes but could not be evaluated the verocytotoxicity. Eighty percent of the pathogenic and non-pathogenic E. coli strains showed resistance to neomycin, and 25% to oxytetracycline. These results indicate that alpacas harbor potentially pathogenic E. coli strains that might cause clinical and fatal intestinal disorders in young animals.

Eimeriosis in young alpacas: prevalence and risk factors

Se analizaron 478 muestras fecales de crías (1-90 días de edad), aparentemente saludables, en el Centro de Investigación y Producción (CIP - La Raya) de la Universidad Nacional del Altiplano, Puno. Las muestras fueron procesadas mediante la técnica de sedimentación y flotación (solución saturada de azúcar) buscando ooquistes y por el método de McMaster para determinar la carga parasitaria (ooquistes por gramo de heces- OPGH). En 418/478 (87.5%) de las muestras se detectaron ooquistes de Eimeria spp (24,017 OPGH, IC 7,534; rango: 50-1´202,400), preferentemente E. lamae (60.4%), E. macusaniensis (50.4%), E. alpacae (45.6%), E. punoensis (30%) y E. ivitaensis (6.24%). La infección parasitaria se incrementó con la edad. Inicialmente se encontró en el 50% de 24 muestras de 1-30 días de edad (17,216 OPGH), y luego de 93% de 82 crías de 31-45 días (28,501 OPGH), 85% de 144 crías de 46-60 días (34,731 OPGH), 94% de 183 crías de 61-75 días (16,564 OPGH) y 80% de 45 crías de 76-90 días (17,376 OPGH). Las infecciones por E. lamae se detectaron muy tempranamente (41% en muestras de 1-30 días) alcanzando tasas de 66.7% (46-60 días), mientras que E. macusaniensis se inicia en el 4.2% de crías de 1-30 días y alcanza la máxima infección (65.6%) en el grupo de 61-75 días. En el 28.2 y 28.2% de las muestras positivas se detectaron infecciones dobles y triples, respectivamente, y en el 11.2% se encontró cuatro especies de Eimeria. En las asociaciones dobles predominó la coexistencia de E. lamae y E. alpacae y de E. lamae y E. macusaniensis.; en las asociaciones triples predominaron E. alpacae, E. lamae y E. macusaniensis y en las cuádruples se encontró E. punoensis, E. alpacae, E. lamae y E. macusaniensis. El análisis de regresión logística multivariada mostró que los rangos de edad de 1-30 días (OR=0.19, IC 95%: 0.08-0.48), 61 a 75 días (OR=2.49, IC95%: 1.22-5.04) y la separación de las crías (OR=0.2, IC95%: 0.08-0.48) estuvieron asociados a la infección de Eimeria spp.

A total of 478 fecal samples taken from healthy alpaca crias aged 1-90 days at Centro de Investigación y Producción (CIP - La Raya), Universidad Nacional del Altiplano, Puno, were processed by the sedimentation and flotation technique in saturated sugar solution to detect oocysts and by the McMaster method to determine oocysts per gram (OPG) of fecal sample. Eimeria spp were present in 418 (87.5%) of the samples with a mean of 24,017 OPG (CI of 7,534 and range 50-1,202,400). The most frequent species were E. lamae (60.4%), E. macusaniensis (50.4%), E. alpacae (45.6%), E. punoensis (30%), and E. ivitaensis (6.24%). Parasite load increased with age, 50% of 24 samples at 1-30 days were positive with an average load of 17,216 OPG, at 31-45 days 93% of 82 (28,501 OPG), at 46-60 days 85% of 144 (34,731 OPG), at 61-75 days 94% of 183 (6,564 OPG) and at 76-90 days 80% of 45 with 17,376 OPG. E. lamae comprised 41% of all coccidian oocysts at 1-30 days and the highest rate of infection (66.7%) was reached at 46-60 days, whereas E. macusaniensis was present in only 4.2% of crias at 1-30 days, but peaked (65.6%) at 61-75 days. Double, triple, and quadruple infections were found in 28.2, 28.2, and 11.2% of positive samples respectively. The coexistence of E. lamae with E. alpacae and, E. lamae with E. macusaniensi infection were common in double infections, whereas E. lamae, E. alpacae and E. macusaniensis were mainly found in triple infections, and E. lamae, E. alpacae, E. punoensis and E. macusaniensis in quadruple infections. The multivariate logistic regression analysis showed that the age range of 1-30 days (OR=1.19, CI 95%: 0.08-0.48), 61-75 days (OR=2.49, CI 95%: 1.22-5.04) and separation of offsprings (OR=0.2, CI 95%: 0.08-0.48) were associated with Eimeria spp infection.

Protective effect of a clostridium polyvalent vaccine on neonatal mortality in alpacas

El estudio analiza el efecto beneficioso de una vacuna multivalente a base de componentes bacterianos y toxinas inactivadas (anacultivo) en la prevención de la enterotoxemia en alpacas. La vacuna múltiple, conteniendo mayoritariamente (60%) cepas de Clostridium perfringens tipos A y Aβ2, fue introducida en el año 2001 en una unidad de producción alpaquera en el distrito de Ñuñoa (Melgar, Puno) y utilizada durante seis años consecutivos. El efecto de la vacuna fue analizado comparando las tasas de mortalidad neonatal total y específica por enterotoxemia en el año 2000 con las mortalidades presentadas durante los seis años de vacunación (2001-2006). El estudio contempló vacunar a todas las hembras preñadas y a todas las crías en el primer año (2001) y solamente a las crías en los años siguientes; sin embargo, en el 2003 se vacunó solamente a las madres gestantes. La mortalidad se calculó en base a los reportes administrativos mensuales de mortalidad de crías preparados por el personal sanitario y veterinario responsable de la unidad de producción. Los diagnósticos causales de muertes fueron basados por observaciones de campo y en algunos casos confirmados por análisis de laboratorio. La introducción de la vacuna redujo la mortalidad total de 37.4% (año 2000, sin vacuna) a 25.2, 23.7, 9.4, 12.1, 15.1 y 14.3% en los años 2001 a 2006, y la mortalidad neonatal debido a enterotoxemia de 19.5% (año 2000, sin vacuna) a 7.2, 9.1, 1.0, 0.3, 2.1 y 3.9% para los años 2001 a 2006. El anacultivo (bacteria y exotoxinas inactivadas) polivalente redujo significativamente las tasas de mortalidad neonatal general y específica debido a enterotoxemia.

This paper analyse the beneficial effect of a multivalent vaccine in reducing mortality rates due to enterotoxemia in alpaca crias. The programme was implemented in 2001 and ran for six consecutive years (2001-2006) in a cooperative farm in southern Peru (Nuñoa, Puno) using a multiple anaculture (bacterine and toxoid) containing predominantly (60%) two subtypes of Clostridium perfringens (A and Aβ2). During these six years, different vaccination protocols were used including inoculating both mothers and crias in the first year and either mothers (2003) or only crias (2002, 2004-2006). The impact of the vaccination was evaluated by comparing total and specific neonatal mortality rates due to enterotoxemia relative to the same rates recorded for the year prior to initiation of the programme (2000). A reduction in total neonatal mortality was recorded from 33.4% in 2000 with no vaccination, to 25.2, 23.7, 9.4, 12.1, 15.1, and 14.3% in years 2001 to 2006. The vaccine equally reduced the mortality associated with enterotoxemia from 19.5% (2000) to 7.2, 9.1, 1.0, 0.3, 2.1, and 3.9% for 2001 through 2006. The polyvalent anaculture (bacterine and toxoid) significantly reduced total mortality rate as well as neonatal mortality rate due to enterotoxemia.

Field tests to evaluate colostrum quality in alpaca

Las concentraciones de inmunoglobulinas (Igs) calostrales en la mayoría de especies productivas determinan los niveles de Igs en sus crías, y las fallas en la transferencia pasiva ocasionan susceptibilidades a infecciones en el recién nacido. El presente estudio evaluó dos pruebas de campo (grado de viscosidad visual y uso de refractómetro) para determinar la calidad del calostro de la alpaca en 77 muestras. Asimismo, se determinó la concentración de Igs mediante una prueba de inmunodifusión radial en 26 muestras de calostro y en 77 muestras de suero sanguíneo de crías obtenidas entre las 36 a 48 horas del nacimiento. Las muestras de calostro se analizaron visualmente para determinar grados de viscosidad (1 a 5), y con el refractómetro de azúcar Brix para determinar sólidos totales. El 60% de las muestras calostrales presentó grados de 2-5 de viscosidad y lecturas promedio de 37.3% por el refractómetro de Brix, encontrándose una correlación altamente significativa entre viscosidad y lecturas por el refractómetro Brix (p<0.0001; r2 = 0.69). El IgG sérico en crías fue de 2679 ± 603 mg/dL y de IgG calostral fue de 28 337 ± 5593 mg/dL, encontrándose un solo animal con fallas de transferencia pasiva (valores séricos: 750 mg/dL). Las concentraciones de IgG calostrales tienen una correlación significativa con las lecturas del refractómetro (p<0.0007), no así con las concentraciones de IgG séricas de las crías (p=0.15). Similarmente, la correlación entre las lecturas de refractometría Brix y los valores séricos de IgG de crías fue baja (p=0.338). La alta correlación entre la escala del % Brix y las IgG calostrales muestran que el refractómetro de azúcar mide correctamente los niveles de IgG, por lo que sería un buen indicador de la calidad del calostro en condiciones de campo. Sin embargo, la baja correlación entre la escala de Brix y las IgG séricas de crías limita el valor de la utilización del refractómetro para predecir el estatus de transferencia pasiva en los neonatos.

In the majority of livestock species, the concentration of maternal immunoglobulin (Ig) in colostrum determines the Ig level in their offspring, and the failure of passive transfer of maternal immunoglobulins results in their susceptibility to disease. This study evaluates two methods (visual assessment and Brix refratometry) for determining alpaca colostrum quality in the field. Evaluations of 26 fresh colostrum samples from 77 alpaca mothers were compared with the results obtained by radial immunodiffusion assay for 77 blood serum samples from 36-48 hours old offspring, and 26 colostrum samples. The colostrum was collected from the dams immediately postpartum and pre-suckling and blood was taken from the crias by jugular venipuncture. Grades of calostral viscosity were assessed visually, with 60% at 2-5, and total calostral solids measured by Brix sugar refractometry averaged 37.3%. The radial immunodiffusion test yielded newborn IgG serum levels of 2679 ± 603.4 mg/dL and colostral IgG levels of 28337± 5593 mg/dL, and only one animal registered failure of immune transfer with serum levels of 750 mg/dL. Results obtained by visual assessment of the colostrum coincide with those obtained by refractometry (p=0.0007), but differ from the serum IgG concentrations in the newborn animals (p=0.15), as do the Brix refractometry readings (p=0.338). Due to the lack of low IgG levels in the colostrum samples, it was impossible to determine if a relationship exists between observed viscosity and colostral IgG concentration. Nonetheless, the positive correlation (p<0.001) between viscosity and Brix refractometry readings point to the need for further research.

Viral and bacterial coexistence in acute pneumonia in neonatal alpacas

A pesar que las neumonías agudas son una de las principales causas de muerte neonatal en alpacas, poco se conoce sobre agentes etiológicos responsables de estos procesos. Muestras de neumonías fatales de 24 neonatos de 5 a 39 días de edad fueron analizadas mediante estudios patológicos, virológicos (inmunofluorescencia directa) y bacteriológicos para identificar virus [parainfluenza 3 (PI-3), respiratorio sincitial bovino (BRSV)] y bacterias [Pasteurella multocida (PM), Mannheimia haemolytica (MH)], buscando posible asociación virus-bacteria en procesos neumónicos. Histopatológicamente, las lesiones se agruparon en tres tipos: 1) Severa y difusa bronconeumonía fibrino-necrotizante supurativa (n=3); 2) Leve a moderada y difusa bronconeumonía supurativa (n=10); y 3) Moderada a severa y difusa congestión y edema pulmonar (n=11). En 22/24 de los casos se identificaron agentes virales y se aislaron bacterias. En 8/22 casos se identificaron/aislaron agentes únicos (5 virus y 3 bacterias), en 10 de 22 casos fueron positivos para infecciones duales [BRSV y bacteria (n=7), PI3 y bacteria (n=2) y ambas bacterias (n=1)] y en los cuatro restantes se identificaron tres patógenos simultáneamente [BRSV, PI3 y bacteria (n=3); y PI3 más las dos bacterias (n=1)]. La prueba de inmunofluorescencia detectó 19/22 positivos a antígenos virales. En 13/19 de estos casos se identificó al BRSV y en 9/19 al virus PI-3 (ambos virus estuvieron presentes en tres casos). En 16/22 casos se lograron aislar bacterias, 11 de los cuales fueron positivos a P. multocida y 7 positivos a M. haemolytica (en dos casos se aislaron ambas bacterias). La presencia de patógenos múltiples fue observada en 14/22 de los casos con clara predominancia de la asociación virus/bacteria (n=13). La coexistencia de BRSV-PM fue la más frecuente (n=6), seguida de BRVS-MH (n=4) y PI3-PM o MH (n=4). Los resultados sugieren posible interacción patogénica virus bacteria, similares a otros rumiantes, en el desarrollo de neumonías agudas en alpacas.

The etiopathogenesis of acute pneumonia, the second most important cause of mortality among Peruvian neonatal alpacas, is still poorly understood. The objective of this study was to characterize gross and histopathology lesions, as well as to identify viruses [parainfluenza type 3 (PI-3) and bovine respiratory syncytial (BRS)] by direct immunofluorescence test, and isolate bacteria [Pasteurella multocida (PM) and Mannheimia haemolytica (MH)] from 24 fatal acute pneumonia cases of 7-39 days-old neonates. At necropsy the gross lesions corresponded to moderate purulent focal bronchopneumonia or severe necrotic purulent fibrinous (n=13), and moderate to severe pulmonary congestion and edema (n=11). Histopathological analysis revealed: acute, severe, and diffuse necrotizing, fibrinous, suppurative bronchopneumonia (n=3), acute mild to moderate and focally diffuse suppurative bronchopneumonia (n=10), and acute, moderate to severe diffuse congestion and pulmonary edema (n=11). Among these 24 cases, 22 yielded virus identification and/or bacterial isolation. Eight cases were positive to one pathogen (5 for viruses and 3 for bacteria), 10/22 were positive for two pathogens [BRSV plus bacteria (n=7), PI-3 plus bacteria (n=2), and one for both bacteria)], and 4/22 positive for 3 pathogens [BRSV, PI-3 plus bacteria (n=3), and PI-3 plus both bacteria (n=1)]. Among the affected lung tissue, virus was identified 19 times (13 positive for BRSV, 9 for PI-3, and 3/19 for both viruses) whereas bacteria was isolated 14 times [P. multocida (n=8), M. haemolytica (n=6), and both bacteria (n=2)]. The presence of multiple pathogens was observed in 14/22 positive cases with an observation of virus-bacteria association in 13/14 of the cases. The coexistence of BRSV-PM was the most frequently observed (6/13), followed by the simultaneous presence of BRSV-MH (4/13) and PI-3 PM or MH (4/13). The results appear to indicate that acute pneumonia in alpaca neonates may well result from virus and bacterial interactions in a similar way to pneumonic lesions of other ruminants.

In vitro and in vivo analysis of clostridium perfringens supernatant isolates from alpaca enterotoxemia cases

Se reportan evaluaciones de sobrenadantes bacterianos (nativos) crudos obtenidos de 24 aislados de C. perfringens de casos fatales de enterotoxemia buscando caracterizar propiedades lecitinasas, hemolíticas, citotóxicas in vitro y enterotóxicas in vivo de la exotoxina fosfolipasa C (Cp-PLC). Los aislados (12 en estados vegetativos y 12 esporulados) contenían el gen cpa (genotipo A), y seis de ellos tenían además el gen cpb2, pero todos carecían del gen de la enterotoxina (cpe). Las actividades lecitinasas fueron evaluadas, en microplacas, usando emulsiones de yemas de huevo; las hemolíticas y perfringolisina en microplacas, usando eritrocitos de carnero y de equino respectivamente; las citotóxicas, en células HEp-2; y las enterotóxicas en conejos inoculados intraintestinalmente. Los aislados fueron clasificados, de acuerdo a los niveles de la actividad lecitinasa, en cepas de alta, mediana y baja producción de Cp-PLC. La mayoría de aislados (66.6%) en estados vegetativos mostraron perfiles de alta y mediana producción de Cp-PLC, mientras que la totalidad de los esporulados fueron de baja producción. Todos los aislados altamente productores de Cp-PLC fueron citotóxicos y mostraron las mayores actividades hemolíticas (24.0 ± 8.4 u.a.h). A pesar de que el 66.6% (n=16) de los aislados indujeron acumulación de fluido intestinal (0.12-0.47 mL/cm), ninguno fue capaz de generar lesiones intestinales en conejos, similares a las descritas en la enterotoxemia. Los sobrenadantes crudos de los aislados evidenciaron la presencia de otras toxinas tipo hemolisinas, citotoxinas y enterotoxinas, distintas a Cp-PLC, CPE y toxina â2, que necesitan ser investigadas a fin de elucidar su posible rol en la etiopatogénesis de la enterotoxemia en alpacas.

In the present study, 24 native supernatants isolated from enterotoxemia fatalities were evaluated to characterize lecitinase, hemolytic, in vitro cytotoxicity, and in vivo enterotoxicity activities of the phospholipase C (Cp-PLC) exotoxin. The lecitinase activity was monitored in microplates using egg white emulsifications, the hemolityc and perfringolisine in microplates using sheep and equine eritrocytes respectively, the cytotoxic activity was tested on HEp-2 cells and the enterotoxicity by inoculating within intestinal loops of rabbits. At the molecular level, all the isolates (12 vegetative and 12 sporulated) were found to contain the cpa gene (genotype A), while six also contained cpb2 gene but none had the cpe gene. These isolates were classified, according the lecitinase activity, as high, medium and low producer strains. Most of the vegetative (66.6%) isolates had high and medium Cp-PLC production profiles, whereas all of the sprorulated ones were low producers. All high lecitinase production strains were citotoxic to HeP2 cells and the highest hemolytic activities (24.0 ± 8.4 u.a.h). Although the 66.6% (n=16) of the isolates induced intestinal fluid accumulations (0.12-0.47 mL/cm) none of the 24 isolates was able to produce intestinal lesions similar to enterotoxemia. The native supernantants showed presence of other toxins with hemolytic, citotoxic and enterotoxin activities similar to the Cp-PLC, CPE and â2 toxin that warrant further investigation to elucidate their possible role in the etiopathogenecity of enterotoxemia in alpacas.

Seroprevalence to pathogenic leptospira in alpacas and vicuñas from Huancavelica and Ayacucho, Peru

Se realizaron estudios serológicos en 793 alpacas y 195 vicuñas de comunidades campesinas de los departamentos de Huancavelica y Ayacucho, Perú, para detectar anticuerpos específicos para cinco serovares patogénicos (icterohaemorrhagiae, pomona, canicola, wolfii y ballum) mediante la prueba serovar específica de microaglutinación. Se encontró que 89.6% de las alpacas y 77.4% de las vicuñas eran seropositivas a uno o más serovares. En alpacas, los anticuerpos tuvieron títulos de 1:100 hasta 1:1600, mayormente con los serovares icterohaemorrhagiae (43.4%) y pomona (37.8%); en tanto que en las vicuñas se obtuvo títulos de 1:100 hasta 1:400, reaccionando similarmente a icterohaemorrhagiae (69.2%) y pomona (8.2%). Solamente las alpacas mostraron títulos positivos a los serovares canicola (7.8%) y wolfii (0.6%). Los resultados indican que los animales han estado expuestos a por lo menos 4 de los 5 serovares estudiados y que las alpacas, por los altos títulos, evidencian historia de infección reciente a los serovares icterohaemorrhagiae y pomona.

A serologic study was conducted on 793 alpaca and 195 vicuña sera samples collected in Huancavelica and Ayacucho departments in Peru to detect specific antibodies against five pathogenic leptospira serovars (L. icterohaemorrhagiae, L. pomona, L. canicola, L. wolfii and L. ballum) by the microaglutination test. The survey revealed that 89.6% of the alpacas and 77.4% of vicuñas were positive to one or more serovars. In alpacas, the titers varied from 1:100 to 1:1600 reacting mainly to L. icterohaemorrhagiae (43.4%) and L. pomona (37.8%), whereas titers among vicuñas varied from 1:100 to 1:400 reacting similarly to L. icterohaemorrhagiae (69.2%) and L. pomona (8.2%) serovars. The alpacas also had antibodies to L. canicola (7.8 %) and L. wolfii (0.6%) serovars. These results show that the animals had previous exposure to at least 4 of the 5 serovars tested and the elevated titers to L. icterohaemorrhagiae and L. pomona serovars in alpacas suggest a recent infection event.

Microbiological, pathological and microelement analyses in vicuñas affected with "dandruff"

Se describen 75 estudios histopatológicos en biopsias de piel (33 afectados y 42 no afectados con "caspa"), 85 análisis microbiológicos en raspados de piel (44 afectados y 41 no afectados) y 70 determinaciones séricas de zinc, selenio, cobre y molibdeno (41 afectados y 29 no afectados) de tres poblaciones de vicuñas silvestres capturadas en "Chakus" en el 2009 en las comunidades campesinas de Huaytará, Ayaví, Santa Rosa de Tambo y en una población captiva multicomunal, en Huancavelica. Los animales afectados no tenían alteraciones clínicas, pero los vellones a la postesquila presentaron escamas blanquecinas dispersas o acumuladas y fuertemente adheridas, usualmente, al dorso lateral y algunas veces por todo el vellón. Todas las muestras de piel, con mayor severidad en las afectadas, mostraron moderada hiperqueratosis ortoqueratótica laminar asociada con dermatosis inespecífica, moderada-severa dilatación de folículos pilosos y moderada-severa atrofia de vaina interna de la raíz folicular pero con ausencia de agentes patógenos e inflamación. El 63.3% (28/44) de raspados de pieles afectadas y el 41.5% (17/ 41) de las no afectadas contenían especies saprofíticas de Ulocladium spp., Penicillum spp., Hialofomicetos, Geotrichum candidum y Aspergilus flavus. Los niveles sanguíneos, en las 70 muestras (afectados y no afectados) presentaron 10 veces la concentración esperada para selenio, principalmente en vicuñas captivas en el área multicomunal (afectados 3.23 ± 1.31 μg/mL y no afectados 3.56 ± 2.27 μg/mL), posiblemente debido al sobrepastoreo de los pastizales con presencia de especies selenνferas de Astragalus spp. ("garbanzo" o "garbancillo"). Todos los animales mostraron deficiencia de cobre y los animales afectados de Huaytará y todos los de Santa Rosa de Tambo presentaron deficiencia de zinc.

In recent years important economic losses have resulted from what is described as "dandruff" in vicuña fiber. With the goal of analyzing the possible cause/s was conducted an histopathological analysis of 75 skin biopsies (33 affected/42 unaffected), microbiological analysis of 85 skin/fiber scrapings (44 affected/41 unaffected), and microelement analysis (zinc, selenium, copper, molybdenum) of 70 serum samples (41 affected/ 29 unaffected), collected from three wild populations in the communities of Huaytará, Ayaví and Santa Rosa de Tambo, Huancavelica, Peru, as well as from the captive herd held jointly by these communities. The affected vicuñas were clinically normal and the presence of "dandruff" was generally detected after shearing. In these fleeces, white scales scattered or accumulated and firmly adhered to the fibers were found, especially on the flanks and backs of the animals, but also widely dispersed throughout the fleece. Histopathological analysis of the skin biopsies revealed that both affected and unaffected animals had moderate to severe dermatosis (hyperkeratosis - orthokeratosis), with moderate to severe atrophy of the inner root sheath of the follicle, but without evidence of inflammation. Microbiological analysis determined the presence of fungus species in 63.3% (28/44) of the affected and 41.5% (17/41) of unaffected animals, including Ulocladium spp., Penicillum spp., Hialofomicetos, Geotrichum candidum and Aspergilus flavus. Microelement analysis revealed 10 fold selenium concentration as compared to normal values, especially in the captive population (affected: 3.23 ± 1.31 μg/ mL; unaffected: 3.56 ± 2.27 μg/mL) possibly due to overgrazing of pastures with presence of Astragalus spp., a common seleniferous plant in the region. All animals showed cooper deficiency. Also, all animals from Santa Rosa de Tambo and affected animals from Huaytará were zinc deficient.

DNA extraction methods from vicuña fecal samples (vicugna vicugna mensalis)

Actualmente es posible determinar el estatus de especies silvestres mediante el análisis de ADN extraído de muestras no invasivas como las heces. Aunque dichos análisis suelen ser dificultosos debido principalmente a la composición y conservación de las heces, se ha demostrado en muchas especies que con el desarrollo de métodos adecuados de extracción es posible maximizar la fiabilidad y eficacia de este procedimiento. Por tanto, el objetivo del presente estudio fue optimizar un método de extracción de ADN de heces de vicuña Vicugna vicugna mensalis, especie clasificada como casi amenazada en el Perú, con la finalidad de obtener ADN de suficiente calidad para análisis moleculares. Se recolectaron 51 muestras de heces durante los meses de agosto y septiembre de 2008 en dos comunidades vicuñeras ubicadas a más de 4600 msnm en los departamentos de Junín y Moquegua. Luego de observar la defecación, las muestras fueron recolectadas en forma inmediata, conservadas en etanol y transportadas al laboratorio para la extracción del ADN. El kit comercial QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIAGEN) fue modificado para incluir un vigoroso y extenso proceso de agitación y los resultados fueron comparados con dos protocolos comúnmente utilizados: fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y el mismo kit QIAGEN. La cantidad del ADN extraído fue observado en electroforesis horizontal en geles de agarosa, y la calidad evaluada mediante la amplificación y visualización de los tamaños esperados de los microsatélites YWLL46 y LCA19. Aunque se logró extraer ADN con los tres métodos, solamente el método modificado permitió obtener ADN de suficiente calidad para ser utilizado en pruebas moleculares.

At present, the use of DNA extracted from non-invasive samples, especially feces, is common practice in the discipline of conservation genetics. Even though DNA analysis is often difficult mainly due to the composition and preservation of feces has been shown in many species with the development of suitable extraction methods is possible to maximize the reliability and effectiveness of such procedures. The objective of this study has been optimization of a protocol for the extraction of DNA from vicuña feces (Vicugna vicugna mensalis), species classified as Near Threatened in Peru, in order to obtain DNA of sufficient quality for molecular analysis. A total of 51 samples were taken from vicuña dung piles in two communities located 4600 meters above sea level in the dry Puna ecosystems of the regions of Junin and Moquegua between August and September 2008. After observing defecation, samples were collected immediately, preserved in ethanol and transported to the laboratory for DNA extraction. Modification of the protocol of the QIAamp ® DNA Stool Mini Kit (QIAGEN) to include an extended period of vigorous shaking was found to producer higher quality DNA than was obtained using both the kit protocol and PCI (Phenol/chloroform/isoamyl alcohol). The amount of extracted DNA was visualized using horizontal agarose gel electrophoresis, and the quality was tested analyzing microsatellite markers LCA 19 and YWLL 46 on polyacrylamide gels. Although DNA was obtained by all three methods, only the modified protocol produced DNA of sufficient quality for use in molecular analyses.

Use of polimerase chain reaction for sexing south american camelids

Se reporta el desarrollo y optimizaciones de técnicas moleculares (PCR simple, múltiple y semi-anidada) para determinar el sexo de camélidos sudamericanos (CSA) amplificando la secuencia del gen Zinc Finger Protein (ZF). La técnica utilizó ADN obtenido de 28 muestras de sangre de alpacas, llamas y vicuñas, 20 muestras de heces de vicuñas y guanacos conservadas en etanol al 96%, y 22 embriones de alpaca colectados entre 72 y 96 horas postmonta y preservados en etanol. Las muestras de ADN de sangre y heces fueron extraídas usando kits comerciales, y las de embriones aplicando tres métodos (ebullición, proteinasa K y fenol-cloroformo). Una vez optimizada la PCR simple para la detección de los genes ZFY y ZFX, se implementó la PCR múltiple para ADN de sangre y heces y la PCR semi-anidada para ADN de embriones. La técnica de PCR múltiple determinó el sexo correctamente en el 100% de las muestras de ADN sanguíneo, en el 87.5% de muestras de ADN de heces colectadas en 2008 y en el 50% de las muestras de ADN de heces colectadas en 2004 y preservadas durante cuatro años antes del análisis. La prueba de PCR semi-anidada, sin embargo, no pudo ser optimizada.

The objective of this study was to develop a PCR technique to determine the sex of South American camelids (CSA) using Zinc Finger Protein (ZF) sequences from blood and fecal samples, as well as cells from alpaca embryos. A total of 28 alpaca, llama and vicuña blood samples, 20 vicuña and guanaco fecal samples, and 22 alpaca embryos collected between 72 and 96 hours postcopula were used. The fecal and embryo samples were preserved in 96% and 70% ethanol respectively. DNA was extracted from blood and feces using commercial kits. Three methods (boiling, proteinase K and phenol-cloroform) were used to extract DNA from alpaca embryos. Two PCR techniques were developed to analyze DNA: multiplex (for fecal and blood sample DNA) and heminested PCR (for embryo cell DNA). The multiplex PCR accurately determined the sex in 100% of the DNA samples extracted from blood, in 87.5% of the samples extracted from fresh feces and in 50% of the 4-year old fecal samples. The heminested PCR, however, could not be optimized.

Phenotypic characterization and mitocondrial DNA analysis of marcapomacocha llamas, Peru

Las llamas kara de Marcapomacocha, provincia de Yauli, departamento de Junín, Perú, se distinguen por presentar un alto porcentaje de animales con coloración ancestral con una semblanza muy semejante al guanaco peruano, Lama guanicoe cacsilensis. Con el objetivo de documentar estas características, aparentemente únicas de esta población, se describen medidas biométricas y análisis del ADN mitocondrial en 50 llamas (5 machos y 45 hembras de uno a más de cuatro años de edad). El patrón de coloración de las llamas muestra tonalidades desde marrón amarillento hasta rojizo oscuro, con el pecho, abdomen y la parte interna de las piernas de color casi blanco y la cabeza gris a negra con blanco alrededor de los labios, ojos y bordes de las orejas. El análisis biométrico de los 30 animales mayores a 4 años fue: altura a la cruz 123.2 ± 12.2 cm; altura a la grupa 119.5 ± 8.5 cm, ancho de pecho 36.5 ± 2.7 cm, perímetro torácico 136.4 ± 5.5 cm, largo de orejas 19.6 ± 2.7, perímetro de cuello al nivel superior 42.8 ± 2.7 cm y al nivel inferior 63.9 ± 4.7 cm, longitud corporal 118.5 ± 5.3 cm y peso promedio de 152. 5 ± 12.3 kg. Al comparar estos datos con los existentes en la literatura, se constata que las llamas de Marcapomacocha son más altas, más largas y más pesadas que las llamas k´ara de otras regiones del Perú. El análisis de un segmento diagnóstico del gen de citocromo b (ADN mitocondrial) reveló que las 50 llamas tenían el haplotipo ancestral guanaco, indicando reducida posibilidad de hibridización con la alpaca.

The kara llama population of Marcapomacocha district, Yauli province, department of Junín, Peru is known for the preponderance of ancestral coloration in the herds. In order to document the apparently unique characteristics of these animals, phenotypic and DNA analyses were carried out on 50 llamas (5 male and 45 female aged 1 to >4 years) from the region. The coat coloration pattern of the animals was uniform, with tones varying from yellow brown to dark red brown, similar to that of the ancestral Peruvian guanaco (Lama guanicoe cacsilensis), while the chest, abdomen and inner surface of the legs are white with a grey-black head and white outlining of the lips, eyes and ears. Biometric analysis of 30 adults (4 years of age and greater) yielded the following results: withers height 123.2 ± 12.2 cm; rump height 119.5 ± 8.5 cm; chest width 36.5 ± 2.7 cm; chest girth 136.4 ± 5.5 cm; ear length 19.6 ± 2.7, upper and lower neck circumferences 42.8 ± 2.7 and 63.9 ± 4.7 cm respectively. Body length averaged 118.5 ± 5.3 cm and body weight was 152.5 ± 12.3 kg. Based on a survey of the literature, the Marcapomacocha llamas are taller, longer and heavier than k´ara llamas from other regions of Peru. Analysis of a diagnostic segment of the cytochrome b gene revealed that all 50 llamas had the ancestral guanaco haplotype, possibly indicating that no hybridization with alpacas has occurred