Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica

Futuro de la resistencia a drogas antituberculosas en el Perú

**Detección rápida de resistencia a drogas en Mycobacterium tuberculosis mediante PCR-SSCP y PCR- Heteroduplex**

Objetivo: Detectar tempranamente la susceptibilidad a las drogas antituberculosas rifampicina e isoniacida mediante PCR y electroforesis conformacional. Materiales y métodos: Se implementaron dos ensayos de amplificación de los genes rpoB y katG y mediante Heteroduplex y SSCP se determinó la susceptibilidad antituberculosa de 31 muestras clínicas procedentes de pacientes con diagnóstico de tuberculosis pulmonar baciloscopía positiva. La caracterización fenotípica de la susceptibilidad, se realizó empleando el método de las proporciones. Resultados: Los ensayos de PCR detectaron hasta 2,5 pg de ADN genómico de M. tuberculosis; no amplificando ADN de otras micobacterias y bacterias comunes de la flora bucal. Se encontró una concordancia general entre la detección molecular y convencional de la susceptibilidad a rifampicina e isoniacida de 96,7% y 83,9% (p<0,05), respectivamente. Sin embargo, sólo en pacientes con antecedente de tratamiento se presentó una concordancia del 100% y 90,9% (p<0,05) para rifampicina e isoniacida, respectivamente. Además, este sistema de detección de resistencia puede emitir resultados 48 horas después de la recepción de la muestra clínica. Conclusiones: Estos sistemas se presentan como una excelente alternativa para la identificación temprana de pacientes infectados con bacilos de M. tuberculosis drogoresistentes. Potencialmente, se podrán dirigir óptimos y oportunos esquemas terapéuticos que contribuirán con el control y prevención de la transmisión de cepas multidrogo-resistentes que afectan en gran medida a la salud pública de nuestro país.

Objective: Early detection of Mycobacterium tuberculosis susceptibility to two anti tuberculous drugs,rifampin and isoniazid using PCR and conformational electrophoresis. Material and methods: Two amplification assays were implemented for the rpoB and katG genes and susceptibility to antituberculous agents was determined by heteroduplex and SSCP in 31clinical samples obtained from patients with positive smear pulmonar tuberculosis.The phenotypical characterization of susceptibility to antituberculous agents was performed using proportion method. Results: PCR assays detected up to 2,5 pg of M. tuberculosis genomic DNA, no amplifications of DNA of other mycobacteria and common bacteria of buccal flora was performed. The general concordance between the molecular and conventional detection of rifampin and isoniazid susceptibility was 96,7% and 83,9% (p<005) respectively. However, a 100% and 90,9% concordance (p<0,05) for rifampin and isoniazid respectively was found only in patients who received previous treatment. Moreover, this resistance detection system can give results 48 hours after the clinical sample is obtained. Conclusion: These systems showed to be an excellent diagnosis alternative for the early identification of patients infected with drugresistant Mycobacterium tuberculosis. It will potentially allow the use of timely and optimal treatment schemes that may contribute to the control and prevention of multidrug-resistant strains that affect public health in our country.

**Perfiles genéticos (RFLP-IS6110) y resistencia a drogas en aislamientos de M. tuberculosis de pacientes internados en un hospital referencial del Callao, Perú**

Objetivo: evaluar la frecuencia y el agrupamiento de los perfiles genéticos (RFLP-IS6110) y los niveles de resistencia a drogas en aislamientos de M. tuberculosis de pacientes hospitalizados con tuberculosis pulmonar frotis positivo (TBP-FP) en un hospital general de la provincia del Callao, Lima, Perú. Materiales y métodos: se incluyeron pacientes con TBP-FP hospitalizados en el Hospital Nacional Daniel A. Carrión entre agosto de 2000 y febrero de 2001. Se realizó la prueba de sensibilidad a las cuatro drogas de primera linea (INH, RIF, SM, EMB) por el método de las proporciones y la genotipificación mediante el método estándar de RFLP-IS6110. Se recolectó la información de los pacientes de los registros de laboratorio e historias clínicas. Resultados: en 74 aislamientos, el número de bandas en los perfiles genéticos variaron entre 2 y 16, 4 perfiles (5,5%) mostraron menos de 5 bandas. En total 50 perfiles genéticos fueron obtenidos de 70 pacientes. 34 aislamientos (48,6 %) se agruparon en 14 "clusters" y 36 tuvieron ocurrencia única. La resistencia a drogas en pacientes nunca y antes tratados fue 45,2% y 71,1%, respectivamente. La multidrogorresistencia fue 16,1% y 36,8%, respectivamente. 10 de los 14 "clusters" incluyeron por lo menos un aislamiento resistente y un cluster agrupó 6 aislamientos resistentes. Conclusiones: No se encontró evidencia de algún genotipo predominante en la población estudiada. Sin embargo, se observaron «clusters» agrupando pacientes con TB sensible y resistente. Nuestros resultados sugieren que existen genotipos asociados a resistencia lo cual indicaría transmisión activa de cepas resistentes en la provincia del Callao. Es necesario llevar a cabo un estudio poblacional para confirmar nuestros resultados.

Objective: To assess the frequency and clustering of DNA fingerprinting (RFLP-IS6110), and to determine levels of drug-resistance among M. tuberculosis isolates from smear-positive pulmonary tuberculosis patients (SP-PTB) from a general hospital in Callao. Materials and methods: Patients with SP-PTB hospitalized in the Hospital Nacional Daniel A Carrión from August 2000 to February 2001were included in the study. Drug-susceptibilty testing to the four first-line drugs (INH, RIF, SM, EMB) was performed using the proportion method, and DNA fingerprinting analysis was performed using the standard IS6110-RFLP technique. Patient information was collected from clinical and laboratory records. Results: From 74 isolates, the number of IS6110-bands varied from 2 to 16, 4 isolates (5,5%) showed less than 5 bands. Overall, 50 DNA fingerprinting profiles were observed in 70 patients. 34 isolates (48,6 %) were grouped in 14 clusters and 36 isolates were isolated ocurrences. Drug resistance in never treated and previoulsy treated patients was 45,2% and 71,1%, respectively. Multidrug-resistance was 16,1% and 36,8%, respectively. 10 out of 14 clusters had at least one drug-resistant isolate. One cluster involved 6 drug-resistant isolates. Conclusion: No evidence of clonal spread of a particular strain was observed. However, we found clusters grouping drug-resistant and drug-susceptible patients. Our results suggests that there are genotypes associated with drug resistance, which could indicates ongoing transmission of drug-resistant M. tuberculosis strains in Callao. A population-based study is necessary to confirm our results.

**Distribución geográfica y comportamiento estacional de la picadura del Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root 1926 en localidades de la frontera Perú-Bolivia, Madre de Dios, Perú**

Objetivos: Determinar la distribución geográfica y el comportamiento estacional de la picadura del Anopheles darlingi en localidades de San Pedro, La Novia, Shiringayoc y Mavila del departamento de Madre de Dios. Materiales y métodos: En estas 4 localidades, durante el periodo comprendido entre junio de 2001 y abril de 2002, se realizó la inspección de criaderos, colecta de larvas de Anopheles darlingi por el método del cucharón y la colecta de mosquitos adultos por el método cebo humano (intradomicilio y peridomicilio), trampa Shannon y refugio animal (extradomicilio). Se construyó un mapa de ubicación geográfica del vector, calculándose los indicadores: criadero positivo y densidad larvaria por cucharonada, índice de picadura hombre noche (IPHN), indice de picadura hombre hora (IPHH), índice esporozoítico y tasa de paridad. Resultados: Se demostró la presencia de Anopheles darlingi en las localidades de San Pedro, La Novia y Mavila. Las especies inmaduras representaron menos del 12% de las larvas encontradas en los criaderos permanentes. El IPHN en las tres localidades se incrementó en la estación lluviosa (diciembre-abril). La picadura del Anopheles darlingi tuvo un comportamiento ematofágico unimodal, con picos de IPHH entre las 20.00 y 23.00 horas en San Pedro y La Novia; y entre las 20.00 y 22.00 horas en Mavila. Conclusiones: El Anopheles darlingi presenta mayor densidad poblacional en los meses de estación lluviosa, presentando un comportamiento de picadura unimodal con mayor actividad hematofágica entre las 20.00 y 23.00 horas.

Objectives: To determine the geographical distribution and the seasonal behavior of Anopheles darlingi in San Pedro, La Novia, Shiringayoc and Mavila sites in Madre de Dios Department. Materials and methods: Between June 2001 and April 2002, the inspection of breeding places, the collection of acuatic stages of Anopheles darlingi using the ladle method and the collection of adult mosquitoes with indoor and outdoor human baits (intra and peridomiciliary), Shannon trap and animal shelter (extradomiciliary), were performed monthly in the four sites. A map of the geographical location of the vectors calculating the indicators: positive breeding place, larva density by ladle, human night bite index (HNBI), human hour bite index (HHBI) and parity rate, was elaborated. Results: The presence of Anopheles darlingi in San Pedro, La Novia and Mavila sites was demonstrated. Inmature stages represented less than 12% of the larvae of Anopheles found in permanent breeding places. HHBI for the three sites was higher in the rainy season (December-April), The bite of Anoph-eles darlingi showed an unimodal behavior, with the highest HHBI between 20:00 and 23:00 hours in San Pedro and La Novia; and between 20:00 and 22:00 hours in Mavila. Conclusions: The highest population density for Anopheles darlingi is shown during the rainy season, this vector presented an unimodal bite behavior with greatest hematophagical activity between 22:00 and 23:00 hours.

Aplicación de un programa de control de infecciones intrahospitalarias en establecimientos de salud de la región San Martín, Perú.

Objetivo: Aplicar un programa de control de infecciones intrahospitalarias (IIH) para modificar conocimientos, actitudes y prácticas (CAP) del personal de salud y su efecto sobre la prevalencia de IIH en establecimientos de salud de San Martín, Perú, julio 2000 - enero 2001. Materiales y métodos: Estudio prospectivo de intervención. Se determinó la prevalencia basal, intermedia y final de IIH y se evaluó los cambios en CAP con la metodología investigación-acción. Participó personal del Hospital de Apoyo Banda de Shilcayo (HABS), Hospital Nueva Cajamarca (HNC), Centro Materno Perinatal, Centro de Salud Lluyllucucha, localizados en zonas rurales. Se utilizaron indicadores estandarizados nacionales. Resultados: Los médicos tuvieron la menor participación (62,0%); y el personal técnico la mayor (90,0%). Las prácticas adecuadas de lavado de manos y materiales, utilización de ropa y guantes, manejo de objetos punzo-cortantes y exposición a fluidos aumentaron significativamente (p<0,01). El mismo comportamiento tuvieron las actitudes de limpieza, desinfección y esterilización en centro quirúrgico. El HABS presentó la prevalencia basal más alta de IIH (26,8%), mientras que el HNC la menor (15,4%). 36,0% fueron casos de gérmenes aislados en hemocultivos de pacientes sin foco infeccioso establecido. 36,0% correspondió a infecciones de herida operatoria, 5,0% neumonías, 2,0% endometritis puerperales, 5,0% infecciones en pacientes quemados y 16,0% infecciones urinarias. Enterobacter aerogenes (32,0%) y Pseudomonas aeuroginosa (24,0%) fueron las bacterias más frecuentes. La prevalencia de IIH disminuyó (de 25,7% a 15,2%) (p0,05). Conclusiones: La aplicación de un programa de control de IIH logró mejorar significativamente las actitudes y prácticas en establecimientos de salud de San Martín, Perú.

Objective: To set up a nosocomial infection control program (NICP) in order to change knowledge, attitudes and practices (KAP) of health care providers in health care facilities in San Martin-Peru, July 2000 - January 2001. Material and meth- ods: Prospective intervention study. The prevalence of basal, intermediate and final nosocomial infections (NI) was deter-mined, the investigation-action methodology ("learning by doing") was used to assess changes in KAP of the target population. The staff of four health care facilities located in rural areas: Banda de Shilcayo Hospital (HABS), Nueva Cajamarca Hospital (HNC), Maternal Health Center of Tarapoto (CMP) and Lluyllucucha Health Center took place in the study. National standardized indicators were used. Results: Physicians participated in less proportion (62%) compared to nonmedical health workers (90%). Good practices regarding tools and hand-washing, use of gloves and clinical wardrobe and the management of blood and other fluids improved significantly (p<0.01). Cleaning, desinfection and sterilization of surgical rooms were also improved (p<0.01). HABS showed the highest prevalence of nosocomial infections (26.8%), and HNC the lowest (15.4%). 36% of the cases were patients with bacteremia, 36% from surgical wounds, 5% pneumonia, 2% puerperal endometritis, 5% infections in burned patients and 16% urinary tract infections. The bacterias most frequently found were Enterobacter aerogenes (32%) and Pseudomonas aeuroginosa (24%). The prevalence of NI decreased after the intervention (25.7% to 15.2%) (p0.05). Conclusions: The implementation of a NI control program improved significantly the attitudes and practices of health care workers of health facilities located in rural areas in San Martin, Peru.

Caracterización e inmunoreactividad de la proteína acídica Ribosomal P2ß de L. (V.) braziliensis

Introducción: El diagnóstico serológico de la leishmaniasis usando proteínas totales presenta reacciones cruzadas. La caracterización de nuevos antígenos de Leishmania mejorará el uso de herramientas serológicas en el diagnóstico de esta enfermedad. Objetivo: Caracterizar un nuevo antígeno de Leishmania. Materiales y métodos: Se seleccionó el bacteriófago T166-U19 de una biblioteca de cADN de L. (V.) braziliensis el cual es reactivo a mezclas de sueros de leishmaniasis cutánea y mucocutánea. El cADN del clon T166-U19 fue subclonado en el plásmido pGEX, luego secuenciado y la proteína recombinante fue expresada. La reactividad de esta proteína recombinante se evaluó por ELISA. Resultados: El cADN del clon T166- U19 presentó un marco de lectura abierto de 318 pb que traduce una proteína de 105 aminoácidos con 81,1%, 82,9% y 60,7% de identidad total con la proteína acídica ribosomal LiP de L. (L.) infantum, P2 de L. (L.) donovani, y P2 de T. cruzi, respectivamente. Además, la proteína recombinante presentó baja reactividad (50%) con sueros de pacientes con leishmaniosis, mientras que presentó reactividad cruzada con sueros de pacientes chagásicos. Conclusiones: Se caracterizó por primera vez la proteína acídica ribosomal P2B de L. (V.) braziliensis, y presentando baja reactividad con sueros de pacientes con leishmaniasis.

Introduction: The serologic diagnosis of leishmaniosis using total proteins shows cross reactions. The characterization of new Leishmania antigens will improve the use of serological tools for the diagnosis of this disease. Objetive: To haracterizate a new antigen of Leishmania. Materials and methods: the T166-U19 bacteriophage was characterizated from a cDNA L. (V.) braziliensis library which reacted against pooled sera from patients with cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. The T166-U19 cDNA clone was subcloned in a pGEX plasmid, sequenced, and the recombinant protein was expressed. The reactivity of this recombinant protein was assessed by ELISA. Results: The T166-U19 cDNA clone contained a 318- bp open reading frame (ORF) encoding 105 amino acid residues which has 81,1%, 82,9% and 60,7% identity with L. (L.) infantum LiP, L.(L.) donovani P2, and T. cruzi P2, respectively. Furthermore, the recombinant protein showed low reactivity (50%) with sera from patients with Leishmaniasis and it has croos-reactivity against sera from patients with Chagas disease. Conclusion: the P2_acidic ribosomal protein of L. (V.) braziliensis has been characterized for the first time and it has shown low reactivity against sera from patient with leishmaniasis.

**Estandarización de una prueba de PCR para la detección de Brucella sp.**

Objetivo: Estandarizar una prueba de PCR para la detección de Brucella spp. Materiales y métodos: Se usó oligonucleótidos reportados que amplifican la secuencia de 16S rRNA de Brucella spp. Fueron evaluados dos métodos de extracción de ADN: fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y un kit comercial basado en columnas con afinidad. Para determinar la sensibilidad de la prueba se usó 8 cepas peruanas de Brucella y para determinar la especificidad de la prueba se usó otras cepas bacterianas peruanas de E. coli, Shigella, Proteus mirabilis, Salmonella aratyphi, Salmonella typhi, Citrobacter freundii y Vibrio cholerae. Resultados: Los 2 métodos de extracción de ADN evaluados fueron efectivos. La sensibilidad analítica de la prueba es alta, lográndose detectar 80 femtogramos de ADN de Brucella spp. purificado. Todas las cepas peruanas de Brucella spp. fueron detectadas por la prueba. Además, la prueba es negativa para cepas peruanas de otras especies bacterianas. Conclusión: Se ha estandarizado las condiciones de una prueba de PCR para la detección de cepas peruanas de Brucella spp., la cual es muy sensible y específica en el laboratorio.

Objetive: To standardize a PCR assay for detecting Brucella spp. Materials and methods: Reported primers targeted at the 16S rRNA gene of Brucella were used. Two DNA isolation methods were assessed: phenol-chloroform-isoamyl alcohol method and a comercial kit based on DNA affinity column. Eight Peruvian isolates of Brucella spp. were used to assess sensitivity and 7 different bacterial isolates, including E. coli, Shigella, Proteus mirabilis, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Citrobacter freundii and Vibrio cholerae were used to assess specificity. Results: Both DNA isolation methods were effective for DNA isolation. The analytical sensitivity of the test was high as we were able to detect at least 80 femtograms of purified DNA. All isolates of Brucella spp. were detected by the assay. Furthermore, the test was negative with 7 bacteria species evaluated in this study. Conclusion: The conditions of a PCR assay to detect Peruvian isolates of Brucella spp, which has been shown to be very sensitive and specific in the laboratory have been tandardized.

**Determinacion de la susceptibilidad de Mycobacterium tuberculosis a la pirazinamida mediante la prueba de la pirazinamidasa,: Perú - 1999**

Se utilizó la prueba de la pirazinamidasa para la determinación de la susceptibilidad frente a la pirazinamida en 1217 cepas de Mycobacterium tuberculosis recibidas en el Laboratorio Nacional de Referencia del Instituto Nacional de Salud (Lima, Perú) de marzo a diciembre de 1999, procedentes de diversas ciudades del país. 88,2% de las cepas fueron de pacientes sin antecedente de tratamiento antituberculoso. La sensibilidad in vitro a la pirazinamida se determinó por el Método de Wayne. Los valores encontrados de resistencia primaria y adquirida a la pirazinamida son de 1,9% y 10,5%, respectivamente.

The pyrazinamidase test was used to determine susceptibility to pyrazinamide in 1217 Mycobacterium tuberculosis strains from different areas in Peru received in the National Reference Laboratory of the Instituto Nacional de Salud (Lima, Perú) from March to December 1999. In Vitro susceptibility to pyrazinamidase was determined using Wayne´s method. Primary and acquired resistance to pyrazinamidase rates were 1,9% y 10,5%, respectively.

Eventos moleculares, genéticos e inmunológicos durante la interacción VIH-Hombre

En el presente trabajo se hace una revisión de los principales estudios realizados en el aspecto genético, molecular e inmunológico de la interacción VIH-Hombre. Del mismo modo, se citan algunos alcances actuales sobre los progresos en el tratamiento contra el SIDA. Finalmente, se plantean estrategias experimentales que podrían ser aplicadas a la realidad peruana y que permitirían responder algunos vacíos sobre los factores genéticos humanos y virales que influyen sobre la transmisión y progresión de la enfermedad.

This is a review about the major studies related to HIV-Human interaction in genetic, molecular and immunological. In the same way, some highlights of the current progress in AIDS therapy are mentioned. Finally, some experimental strategies to be applied in the Peruvian setting that might allow to answer some questions about human and viral factors implicated on transmission and progression of the disease are suggested.