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INTRODUCCIÓN
La Organización Mundial de la Salud sostiene que el número de personas con diabetes mellitus (DM) en el mundo ha aumenta do de 108 millones en 1980 a 422 millones en 2014 y que será la séptima causa de defunción para 2030 111 , 2. La diabetes mellitus tipo 2 (DM 2) es un problema en crecimiento, 371 millones de adultos viven con este tipo de diabetes en el mundo, de los cuales 26 millones (7%) residen en Latinoamérica 3. El Instituto Nacional de Estadística e Informática de Perú (INEI) informó que a nivel nacional el 3,9% de la población de 15 a más años fue diagnosticada con DM en 2019 4. En la costa del Perú se reportó mayor población con diabetes (4%) y mayor incidencia en la zona urbana 5.
La DM es una enfermedad crónica degenerativa, sus complicaciones crónicas más frecuentes son la nefropatía, neuropatía, retinopatía, cetoacidosis y la enfermedad cardiovascular 6. El tratamiento de la DM 2 es multifactorial y personalizado, teniendo como pilares la nutrición, la actividad física y medicamentos con reportes de adherencia del 47,8% 7. Las guías internacionales recomiendan como primera línea de tratamiento farmacológico a la metformina 8.
Las plantas medicinales (PM) constituyen una alternativa terapéutica viable debido a su bajo costo y fácil disponibilidad para muchas poblaciones, más de 400 PM con gran diversidad fitoquímica son estudiadas por su potencial antidiabético y menor o ningún efecto secundario, por lo que es importante validar científicamente la efectividad y seguridad para garantizar su uso 9 - 13. La Moringa oleifera (moringa) y Smallanthus sonchifolius (yacón) son PM de fácil acceso y bajo costo en nuestro medio.
La Moringa oleifera es un árbol originario del sur del Himalaya 14 y forma parte de la familia Moringaceae 15. Las hojas de la M. oleifera, además de proteínas, minerales y vitaminas, contienen los siguientes principios fitoquímicos: flavonoides, ácidos fenólicos, alcaloides y carotenoides, isotiocianatos, glucosinolatos y taninos, saponinas, oxalatos y fitatos 13. Se han identificado posibles compuestos con efecto hipoglicemiante y antioxidante en estudios fitoquímicos previos 6, que actúan por diferentes mecanismos en los que incluyen la inhibición de las actividades de α-amilasa y α-glucosidasa, aumento de la captación de glucosa en los músculos y el hígado, inhibición de la captación de glucosa desde el intestino, disminución de la gluconeogénesis en el hígado y aumento de la secreción y sensibilidad a la insulina 13. Asimismo, los estudios revisados de toxicidad en animales de experimentación han mostrado que los extractos acuosos y alcohólicos de la M. oleifera no tienen efectos adversos 13. Además, la M. oleifera protege los tejidos del estrés oxidativo 16, reduce la actividad de los radicales libres, la peroxidación lipídica y previene el desarrollo de complicaciones crónicas 6.
El S. sonchifolius pertenece a la familia Asteraceae, originario de los valles andinos de Sudamérica; se cultiva a altitudes de 2000 a 3100 m s. n. m. y alcanza la madurez entre 6 y 12 meses después de la siembra 17. La composición fitoquímica del S. sonchifolius ha sido descrita previamente y ha revelado altas concentraciones de grasas y aceites, fenoles y taninos, alcaloides, lactonas, flavonoides y antocianidinas 12; asimismo, se ha reportado su alta seguridad en pruebas de toxicidad aguda en modelos experimetnales, tanto de sus extractos atomizados como de sus alcaloides 12. El S. sonchilfolius tiene efectos hipoglicemiantes, induce la liberación de insulina y aumenta su concentración en el plasma en ratas diabéticas y normales 18. Este efecto ha sido confirmado principalmente por el ácido cafeico y clorogénico junto con tres ácidos dicaffeoilquinicos isoméricos, que podrían contribuir satisfactoriamente a una inhibición de la α-glucosidasa en el borde en cepillo de las células del intestino delgado. La decocción de hojas de yacón mostró in vitro e in vivo alargar el tiempo de absorción de la glucosa, retrasando la digestión rápida de la sacarosa; un componente aislado del yacón, la lactona sesquiterpénica disminuye significativamente los niveles de glicemia posprandial en ratas diabéticas 19.
Se ha demostrado el efecto hipoglicemiante in vitro de estas PM 12 , 13 , 18 , 19; sin embargo, se desconoce cuál de las dos plantas tiene mayor efecto in vivo, lo que permitiría considerarlas como una alternativa de tratamiento en DM, después de los posteriores y correspondientes ensayos clínicos. El objetivo del presente estudio fue comparar el efecto hipoglicemiante del extracto acuoso de la M. oleifera, el de S. sonchifolius, y la metformina en R. norvegicus con diabetes mellitus inducida.
MENSAJES CLAVE
Motivación para realizar el estudio: El incremento de la población peruana con diagnóstico de diabetes y la búsqueda de nuevos principios activos con efecto hipoglicemiantes útiles para su tratamiento.
Principales hallazgos: El extracto acuoso del Smallanthus sonchifolius (yacón) y de la Moringa oleifera (moringa), y metformina presentaron similar efecto hipoglicemiante en ratas de experimentación con diabetes inducida por aloxano.
Implicancias: La moringa y el yacón tuvieron efecto hipoglicemiante similar a la metformina en un modelo animal. Se requiere realizar estudios preclínicos con principios activos derivados de estas plantas, y posteriores estudios clínicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño de estudio y animales de experimentación
Se realizó un estudio experimental controlado y aleatorizado con ratas albinas (Rattus norvegicus, variedad albina) machos que desarrollaron diabetes mellitus inducida con aloxano. Se excluyeron todas aquellas que no elevaron sus niveles de glucosa (como mínimo 250 mg/dL) y que presentaron alguna patología.
Se seleccionaron 24 machos de la cepa Holfzman, de entre 12 y 14 semanas de edad aproximadamente y con un peso de 180 ± 20 g. Los animales fueron adquiridos en el bioterio del Hospital Regional Lambayeque, donde tuvieron diez días de adaptación con comida balanceada procedente de la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM). La dieta recibida fue de crecimiento con el siguiente valor nutricional: agua, 10%; proteínas, 13-14%; lípidos, 3-4%; y calcio, 0,5%; y según la hoja del fabricante, fue elaborado con los siguientes ingredientes: maíz amarillo, torta de soya 48%, pasta de algodón, torta de girasol, subproductos de agroindustria, heno de alfalfa, carbonato de calcio, fosfato dicálcico, aminoácidos sintéticos, promotores orgánicos, vitaminas, minerales, cloruro de sodio, antifúngico y antioxidantes.
Procedimiento
Recolección y secado de materiales vegetales
Las hojas de moringa se recolectaron del caserío Yurimaguas, distrito de Jayanca de la provincia de Lambayeque, de aproximadamen te dos meses de sembrado. Las hojas de yacón se recolectaron en el caserío Montegrande Bajo, distrito de Huarmaca en la provincia de Huancabamba, Piura, de aproximadamente siete meses de sembrado. Las muestras fueron depositadas en el Herbario Lambaye que PRG, del departamento de Botánica de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo (UNPRG) e identificadas por un especialista calificado.
Las hojas de moringa y yacón fueron lavadas y puestas en un secador de bandeja con aire caliente durante dos horas a 56 °C, se separaron tallos de hojas, para luego triturar solo hojas con ayuda de un mortero (cada planta por separado). Los triturados de cada planta fueron almacenados en recipientes herméticos por separado, aislados de luz y humedad.
Preparación de tratamientos
Preparación del extracto acuoso de M. oleifera y S. sonchifolius a 100 mg/ml
En el Laboratorio de Investigación del Hospital Regional Lambayeque (HRL) se pesó 10 g de moringa y de yacón con la ayuda de una balanza analítica; posteriormente, en una cabina de bioseguridad, se mezclaron con 100 mL de agua destilada estéril, se colocaron en tubos estériles de 15 mL, luego llevados a baño maría por 30 minutos a 90 °C. Posteriormente, se centrifugó a 3500 RPM durante diez minutos. En la cabina de bioseguridad, se extrajo el sobrenadante con ayuda de una jeringa estéril de 10 mL que constituyó el extracto acuoso. Se prepararon alícuotas y se conservaron entre 2 y 8 °C hasta su uso en los siguientes próximos cuatro días.
Preparación de metformina a 10 mg/Ml
En el Laboratorio de Investigación se pesó 1 g de metformina (Sigma, USA) y se diluyó en 100 mL de agua destilada 20, se homogenizó y conservó a 2-8 °C hasta su uso en los siguientes próximos cuatro días.
Inducción de diabetes mellitus en Rattus norvegicus variedad albina cepa Holfzman
Se les indujo diabetes experimental con una única dosis de aloxano (Sigma, St. Louis, MI, EUA), a dosis de 130 mg/kg de peso vivo (PV) vía intraperitoneal. Los niveles de glicemia se midieron a las 72 horas 21 y se consideraron diabéticas, aquellas que tengan un nivel de glicemia mayor de 250 mg/dL 22.
Distribución de grupos de estudio
A las ratas diabéticas se las distribuyó en cuatro grupos de seis ratas cada uno. Se enumeró cada rata con un marcador indeleble y se asignaron aleatoriamente con el programa Epidat 4.1. Estos fueron los grupos: grupo control, el cual no recibió tratamiento, y bebió agua a voluntad; grupo metformina, que recibió 14 mg/kg PV, tratamiento estándar de DM 2 20; grupo M. oleifera, que recibió 200 mg/Kg PV de extracto acuoso de M. oleifera 16; y grupo S. sonchifolius, que recibió 140 mg/Kg PV de extracto acuoso de S. sonchifolius 19.
La evaluación y duración del experimento se llevó a cabo durante 15 días consecutivos. Se realizó la medición de los niveles de glicemia a las siete horas. Asimismo, las sustancias con efecto hipoglicemiante fueron administradas a las ocho horas, mediante una sonda orogástrica descartable (vía orogástrica), salvo en el grupo control que no recibió tratamiento.
A todos los animales de experimentación se les dio una ración de 14 g de alimento balanceado para roedores una vez al día posterior al tratamiento correspondiente. El día anterior a la medición de la glicemia se mantuvo la comida en sus jaulas a las diez y a las 19 horas, luego se les retiró para el ayuno de 12 horas con agua ad libitum.
Medición de la glicemia en ratas
La concentración de glucosa en sangre se midió con el glucómetro Accu-Chek Instant (Roche). El nivel de glicemia durante el experimento fue monitoreado al primer, cuarto, octavo y décimo quinto día postratamiento. Para realizar este procedimiento, los especímenes permanecieron en ayunas 12 horas aproximadamente, se recolectó la muestra de sangre por punción en el ápice de las colas, previa antisepsia del área con alcohol al 70%, desechando la primera gota y recibiendo la siguiente sobre la tira reactiva. Los valores obtenidos se expresaron en miligramos por decilitro (mg/dL).
Según el reporte del fabricante, el sistema Accu-Chek® Instant (medidor y tiras) se calibra en fábrica a partir de sangre capilar de personas diabéticas (comparación de métodos y exactitud), sangre venosa (repetibilidad) y solución de control (reproducibilidad). Asimismo, al inicio y a la mitad de las mediciones en las ratas, se realizaron mediciones con la solución control administrada por el fabricante, que contenía una concentración de glucosa de 100 mg/dL. El equipo cumple con los requerimientos establecidos por las normas ISO 15197:2013 e ISO 15197:2015 para sistemas de ensayo para diagnóstico in vitro, requisitos de los sistemas de autodiagnóstico de monitoreo de glucosa en sangre en el manejo de la DM 23.
Análisis estadístico
Los datos se codificaron y digitaron en Microsoft Excel 2016 y se procesaron con IBM SPSS 24 (IBM Corp., Armonk, N.Y., EUA). Luego del análisis de la curva de distribución y el resultado de la prueba de normalidad de Shapiro-Wilks, se realizó un análisis descriptivo de la glicemia en todos los tratamientos y mediciones, mediante el cálculo de medianas y rangos inter cuartílicos.
El análisis comparativo del efecto hipoglicemiante de los extractos de M. oleífera, de S. sonchifolius, y metformina, se realizó mediante las pruebas no paramétricas de Kruskall Wallis y test de Dunn (comparaciones múltiples). Asimismo, para medir la reducción de la glicemia pretratamiento respecto al décimo quinto día de tratamiento se utilizó la prueba no paramétrica de Wilcoxon. Se consideró significativo un valor de p < 0,05.
Aspectos éticos
La investigación se realizó respetando los principios de reducir el número de animales experimentales, reemplazar los animales de experimentación por otros métodos y refinar las técnicas para aminorar el sufrimiento. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Ética en Investigación para Uso de Animales (CEIPUA), del HRL. Asimismo, se respetaron los principios y aspectos relacionados con el cuidado y uso de animales de laboratorio detallados en la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, respecto a la protección de los animales utilizados para fines científicos, y la Ley Nacional de Protección de Animales en Cautiverio 24. Al final del experimento las ratas fueron eutanasiadas con pentobarbital sódico a dosis de 100 mg/kg PV.
RESULTADOS
Los datos tuvieron distribución no normal. En la Tabla 1, se muestran medianas y rangos intercuartílicos de la glicemia de ratas con diabetes mellitus inducida, distribuida según grupos experimentales (control y tratamientos con M. oleifera, S. son chifolius, y metformina).
Tabla 1 Glicemia en ratas con diabetes mellitus inducida, 15 días postratamiento con extracto de 140 mg/kg PV Smallanthus sonchifolius (yacón), 200 mg/kg PV Moringa oleifera (moringa) y metformina 14 mg/kg PV
| Grupos (n=6) | Glicemia (mg/dL) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Pre Tto Me (RIC) | 1 dTto Me (RIC) | 4 dTto Me (RIC) | 8 dTto Me (RIC) | 15 dTto Me (RIC) | |
| Control | 439 (315-565) | 402 (166-469) | 445,5 (402-600) | 586,5 (522-600) | 389 (330-512) |
| Metformina | 522 (471-600) | 331 (191-476) | 271 (77-412) | 127 (115-251) | 107 (99-119) |
| M. oleifera | 417 (341-600) | 451 (378-600) | 427 (417-457) | 246 (170-421) | 110 (104-170) |
| S. sonchifolius | 398 (353-471) | 268 (249-435) | 298 (182-361) | 134 (121-346) | 117 (101-232) |
Tto: Tratamiento; dTto: días con tratamiento; Me: mediana; RIC: rango intercuartílico
Se observó reducción de la glicemia en los tratamientos con metformina, M. oleifera y S. sonchifolius, en 415 mg/dL, 313 mg/dL y 281,5 mg/dL; respectivamente (Tabla 2).
Tabla 2 Reducción de la glicemia en ratas con diabetes mellitus inducida y tratadas con extracto de 140 mg/kg PV Smallanthus sonchifolius (yacón), 200 mg/kg PV Moringa oleifera (moringa) y metformina 14 mg/kg PV.
| Grupos (n=6) | Mediana | Disminución | Valor de p* | ||
|---|---|---|---|---|---|
| Pre Tto | 15 dTto | mg/dL | % | ||
| Control | 439,0 | 389,0 | 50,0 | 11,4 | 0,981 |
| Metformina | 522,0 | 107,0 | 415,0 | 79,5 | 0,002 |
| M. oleifera | 423,0 | 110,0 | 313,0 | 74,0 | 0,009 |
| S. sonchifolius | 398,0 | 116,5 | 281,5 | 70,7 | 0,002 |
Tto: Tratamiento; dTto: días con tratamiento
*Prueba de Wilcoxon.
En la Figura 1, se visualiza la tendencia de la glicemia en los grupos experimentales, donde se observa que a medida que transcurre el tiempo, la glicemia de los tratamientos disminuye en comparación al control, quienes no recibieron tratamiento.
En cuanto a la comparación de las glicemias en los grupos tratados y control, se observó que a las 24 horas y cuatro días de tratamiento no hubo diferencia significativa (p > 0,05); mientras que al octavo y décimo quinto día, los tratamientos tuvieron una menor glicemia respecto al control, siendo esta diferencia estadísticamente significativa (Tabla 3 y 4).
Figura 1 Glicemia en ratas con diabetes mellitus inducida, tratadas con 140 mg/kg PV de extracto de S. sonchifolius (yacón), 200 mg/kg PV de M. oleifera (moringa) y 14 mg/kg PV de metformina.
Tabla 3 Comparación de la glicemia al octavo día de tratamiento con 200 mg/kg PV de M. oleifera, 140 mg/kg PV de S. sonchifolius y metformina, en ratas con diabetes inducida.
| Grupo | n | Mediana | Valor de p* | Comparación** |
|---|---|---|---|---|
| Control | 6 | 586,5 | 0,015 | A |
| Metformina | 6 | 126,5 | B | |
| M. oleifera | 5 | 246,0 | B | |
| S. sonchifolius | 6 | 134,0 | B |
*Valor de p de Kruskall Wallis.
**Letras iguales indican grupos con datos similares (test de Dunn).
Tabla 4 Comparación de la glicemia al décimo quinto día de tratamiento con 200 mg/kg PV M. oleifera, 140 mg/kg PV de S. sonchifolius y metformina, en ratas con diabetes inducida
| Grupo | n | Mediana | Valor de p* | Comparación** |
|---|---|---|---|---|
| Control | 6 | 389,0 | 0,004 | A |
| Metformina | 6 | 107,0 | B | |
| M. oleifera | 5 | 110,0 | B | |
| S. sonchifolius | 6 | 116,5 | B |
* Valor de p de Kruskall Wallis.
** Letras iguales indican grupos con datos similares (test de Dunn).
DISCUSIÓN
Se encontró que los extractos acuosos de S. sonchifolius y M. oleifera tuvieron efecto hipoglicemiante significativo, similar al comprobado con metformina. Al respecto, estudios previos han descrito que los extractos acuosos de hojas de yacón y moringa son frecuentemente utilizados en humanos por sus múltiples beneficios para la salud, entre los que resalta la reducción de la glucosa postprandial 18 - 20.
Asimismo, otro estudio encontró que la decocción de las hojas de yacón contiene compuestos fenólicos desde cafeico, clorogénico y ácidos dicaffeoilquinicos, el ácido ferúlico, el ácido pcumárico, el ácido protocatechuico y la quercetina contribuirían en su efecto hipoglicemiante inhibiendo la α-glucosidasa, promoviendo la regulación de la glucosa 19 , 25. Su acción hipoglicemiante también es atribuida por unirse a los receptores de insulina y potenciar la actividad de la enzima tirosinaquinasa cuya finalidad es disminuir los niveles de glucosa, además de proteger frente a las complicaciones producidas por la diabetes 18.
El efecto hipoglicemiante del extracto acuoso de yacón observado en nuestro estudio fue similar al reportado por Dos Santos et al., donde obtuvo descensos cercanos a la normalidad de los niveles de glucosa en ratas tratadas con extractos hidroetanólicos 25. Asimismo, Mejía et al. estudiaron el efecto hipoglicemiante usando raíz entera de yacón, obteniendo una menor disminución de los niveles de glucosa (27,6 mg/dl en 34 días) 26, comparado con nuestro estudio donde obtuvimos una disminución de 281,5 mg/dL en 15 días.
De igual manera, el grupo tratado con M. oleifera disminuyó significativamente los niveles de glicemia en comparación con el control, este resultado pudo haberse debido a su alto contenido de polifenoles y compuestos flavonoides 6 , 13, glucosinolatos e isotiocianatos 27, terpenoides, quercetina y kaempferol 28 encontrados en estudios fitoquímicos anteriores, donde actúan como secretagogos de insulina y contribuyen atenuando las complicaciones diabéticas 16 , 28 ya que, mejoran la regeneración y viabilidad de las células destruidas; otro de sus mecanismos es reducir la gluconeogénesis y glucogenólisis hepáticas atribuido al ácido clorogénico contenido en sus hojas 28.
Nuestros resultados son congruentes con los obtenidos por estudios previos donde ratas de experimentación hiperglucémicas son tratadas con extracto de M. oleifera obteniendo una disminución significativa de glicemia 6 , 20 , 29.
Los extractos acuosos de M. oleifera y S. sonchifolius tuvieron similar efecto hipoglicemiante sin diferencia significativa, esto pudo deberse a que ambas plantas contienen similitud en su composición como son los polifenoles, a quienes se les atribuye propiedades hipoglicemiantes 19 , 25 , 27 , 28, aunque todavía no se ha establecido exactamente su mecanismo de acción, que parece ser a varios niveles.
Se observó reducción de la glicemia pretratamiento con respecto al décimo quinto día de tratamiento en el control positivo (79,5%), tratamientos con M. oleifera (74%) y S. sonchifolius (70,7%). Estudios previos informan que grupos tratados con M. oleifera obtuvieron valores similares al efecto hipoglicemiante producido por la metformina 20 , 29. Pero no hay reportes similares con yacón y tampoco se encontraron estudios que comparen ambas PM.
El reducido tamaño de muestra fue una limitante del presente estudio, sin embargo, es usual en este tipo de diseños por aspectos éticos y logísticos, a pesar de ello, consideramos que los resultados son válidos 19 , 20 , 29 , 30. Otra limitación podría ser la pérdida de una unidad experimental del grupo de moringa en la mitad del experimento. El presente es un estudio preclínico que comprueba efectos hipoglicemiantes en animales de experimentación, pero deben realizarse estudios en seres humanos que prueben estos beneficios y midan otros riesgos. Asimismo, por cuestiones logísticas, no se estudió aspectos de la fisiopatología de acción del aloxano y de los tratamientos, así como la caracterización de los fitoquímicos en los extractos.
Se concluye que el extracto acuoso de Smallanthus sonchifolius a 140 mg/kg PV y de Moringa oleifera a 200 mg/kg PV, y metformina a 14 mg/kg PV no presentaron diferencias significativas en su efecto hipoglicemiante sobre ratas con diabetes inducidas con aloxano, a los ocho y 15 días de tratamiento. Por ello, se recomienda realizar estudios complementarios de seguridad, donde se evalúe toxicidad y citotoxicidad, in vitro e in vivo, y posteriormente realizar estudios clínicos para comprobar si el efecto hipoglicemiante encontrado en el presente estudio es similar en seres humanos. También se recomienda estudiar interacciones y sinergias entre los tratamientos, así como la fisiopatología de sus efectos.
