INTRODUCCIÓN

Las orquídeas pertenecen a una familia de las más diversas y son muy vulnerables por la destrucción de sus ambientes y extracción (^{Ávila & Salgado-Garciglia, 2006}); en Costa Rica, en los Cerros La Carpintería, constituye el reservorio de la diver-sidad de orquídeas, donde el género Epidendrum fue el más diverso, comparado a otros (^{Cascante-Marín & Trejos, 2019}); asimismo, en Colombia, en un relicto de bosque alto andino E. caliptratoides fue la más frecuente en seis de nueve transectos evaluados (^{Califa & Estupiñan, 2020}); en la reserva de Biosfera de México del Estado de Tamaulipas, se han encontrado 39 especies y 20 géneros de orquídeas (^{Baltazar & Solano, 2020}); en Perú, en bosque de llanura, Paujil, Oxapampa, se ha regis-trado mayores índices de diversidad en bosque ribereño (^{Damian, 2015}); por otro lado, E. catillus, se reporta entre los 860-1500 msnm, monte siempre verde, subxerófilo, de hojas más o menos dura (^{Trujillo, 2022}).

Por otro lado, las principales actividades que amenazan el crecimiento y desarrollo natural de las orquídeas son la alteración de su ecosistema y la extracción de éstas para su comercio ilegal (^{Martínez-Meléndez et al., 2020}). Por la belleza de sus flores, son muy cotizadas en el mercado; debido a esto, tiene efecto sobre su estado de conservación en ambientes naturales, como Laelia speciosa, endémica de Aguas Calientes, México, con protec-ción especial y que está amenazada (^{González, 2014}); asimismo, Hadrolaelia grandis en peligro de extinción por destrucción de su hábitat y recolección como ornamental, frente a ello se ha probado varios tipos de medios con miras a la conservación y propagación (^{Vudala & Ribas, 2017}); pero existen otras que se encuentran amenazadas, como es el caso de Telipogon papili y T. bowmanii (^{Martel, 2020}).

La germinación natural de las semillas de orquí-deas es alrededor del 5% (^{Mamani et al., 2022}b); presenta dificultades en las primeras etapas del crecimiento y desarrollo de las plantas (^{Harris et al., 2021}); donde, dependen de la asociación con un hongo (^{McKendrick, 2000}); se ha sugerido que existiría una asociación específica entre las especies intervinientes (^{Otero & Bayman, 2009}). Al respecto, en Dendrobium officinale, con hongos micorríticos compatibles: Tulasnella sp. TPYD-2, y Piriformospora indica PI y Tulasnella sp. FDd1 incompatibles, la germinación de semillas fue superior en PI con 67,80%, se obtuvo plántulas con dos hojas, comparado a TPYD-2, con 37,10%, y en cuanto a FDd1 no produjo plántulas (^{Chen et al., 2022}); sin embargo, el hongo micorrítico DYXY033, tiene una alta especificidad con Paphiopedilum hirsutissimum (Lindl.ex Hook.) Stein, en medio PDA produjo el agrandamiento de la semilla para dar origen al protocormo (^{Tian et al., 2023}). La germinación asimbiótica in vitro de diferentes especies de orquídeas, ha permitido introducir y germinar semillas con una alta tasa de germinación, obtención de plantas sanas y vigorosas en algunas de ellas (^{Velázquez et al., 2016}); sin embargo, las respuestas de cada una de éstas en los medios nutritivos es variable (^{Flores-Hernández et al., 2017}); también, tiene que ver el estado de madurez fisiológica y el estado inde-hiscente de las cápsulas (^{Pérez-Martinez & Castañeda-Garzón, 2016}).

Los embriones se transforman en estructuras dife-renciadas denominadas protocormo (^{Pujasatria et al., 2020}), donde sucede la morfogénesis que a veces demora años (^{Mendoza, 2016}); Eulophia flava (Lindl.) Hook.f. en MS sin suplementos, es suficiente para germinar semillas en un 26,39%, y formaron plántulas en pos protocormo en 11,50% (^{Vasupen et al., 2023}). Es importante el contenido de los nutrientes en el medio de cultivo y del genotipo de la especie; en Cattleya crispa la germinación en MS + 30 g L-1 + 2 g L-1 de Phytagel, produjo la germinación a los 7 ddi, formación de protocormos a los 30 ddi y plantas a los 150 ddi (^{Vargas et al., 2023}); asimismo, diferentes orquí-deas, resultaron mejores en medio MS + jugo de piña, variando la germinación entre ocho a doce semanas y con agregado de plátano se diferen-ciaron órganos axiales a la quinta semana (^{Chacón-Campana et al., 2017}); también en, Dendrobium cunninghamii, en los medios Nor-Stog 1973 y Vacin y Went 1949, cada uno + sacarosa al 2%, se obtuvo una germinación de alrededor del 50% en ambos medios (^{Diantina et al., 2020}); por otro lado, en Paraphalaenopsis labukensis Shim, A. Lamb & CL Chan, la mayor tasa de germinación se dio con el medio Knudson C, seguido de MS, con 98,78% y 92,80, respectivamente y Knudson + 0,5 mg L-1 con 17,25% (^{Nelson et al., 2023}); y en Cremastra appendiculata var. variabilis (Blume) I.D. Lund. tuvo un mayor porcentaje de germinación, 48,7%, en un medio MS + 30 g L-1 de sacarosa + 8 g L-1 de agar vegetal + 500 mg L-1 de carbón activado, comparado a otros medios (^{Faisal et al., 2022}); También, el uso de agua de coco al 20% dio una germinación del 86,4% (^{Mamani et al., 2022}a). asimismo, en medio MS al 50% + 0,3% de carbón activado se ha obtenido la germinación del híbrido intergenérico Laeliocattleya (^{Gonçalves et al., 2016}). La orquídea Coelogyne pandurata Lindl. se desarrolló mejor en un medio a base de fertilizante foliar que contenía emulsión de pescado + fenolatos y añadido una mezcla de macro y micronutrientes de hidroponía + agar 7 g L-1 + 2 g L-1 de carbón activado, comparado a otros medios (^{Dwiyani et al., 2022}).

Las semillas de cápsulas inmaduras de Prosthechea fragrans (Sw.) W.E. Higgins, inoculadas en el medio MS modificado con vitaminas Morel más agua de coco y carbón activado, luego de un mes se evidenció la aparición de tejidos verdes y por ende la germinación, seguida por el rápido desarrollo de los protocormos (^{Salgado & Peñaranda, 2019}). Asimismo, en tres especies de Chloraea (C. crispa, C. gavilu y C. virescens), C. crispa logró la máxima germinación cercana al 85%, en medio de cultivo de tomate, seguida del medio Malmgren Modified (MM) y medio de cultivo de banano con un 70% de germinación; sin embargo, los embriones de todas las especies en medio MM alcanzaron el mayor desarrollo, evidenciando brotación distinta en cada una de ellas (^{Pereira et al., 2017}). Igualmente, el porcentaje de semillas que germinaron en la especie Anacamptis longicornu fue diferente en los medios Orchimax + carbón activado y 30 g L-1 y MS con 20 g L-1 en las diferentes fechas de evaluación entre 60 a 180 dds (^{Arcidiacono et al., 2021}).

Por tanto, la propagación masiva in vitro de diferentes especies de orquídeas se considera una alternativa biotecnológica efectiva como medida preventiva para disminuir la presión de la extracción y tráfico ilegal de las poblaciones silvestres (^{Castillo-Pérez et al., 2020}). Por otro lado, existen varios medios de germinación in vitro, como Knudson y otros, pero los requerimiento nutricionales de orquídeas, pueden ser mucho más variados, aún en las especies del mismo género (^{Mayo et al., 2010}); éstas no se realizan como otras semillas, sino en simbiosis con hongos micorríticos que les proporcionan energía para la germinación porque carecen de reservas (^{Barbery & Morales, 2011}); esto hace que, se desarrollen investiga-ciones sobre diferentes medios en la germinación in vitro de orquídeas. El objetivo de la presente investigación fue determinar un medio de cultivo para la germinación y formación de protocormos de E. catillus, colectada en la zona de Grapanazú, Huancabamba, Oxapampa-Perú.

METODOLOGÍA

Siembra e incubación de semillas

La cápsula, previamente desinfectada, se cortó con un bisturí N° 21 sobre una placa de Petri estéril, en secciones longitudinales, Figura 1c; se extrajeron las semillas y se inocularon en los diferentes medios de cultivo (tratamientos), contenidos en las placas de Petri, dispersándolas en forma uniforme sobre la superficie, Figura 1d; se rotularon y sellaron con Parafilm, luego fueron llevadas a la sala de incubación en los anaqueles a 23 °C, 59,57 μmol m-2 s-1 (LP 471 PAR) de luminosidad, 60% de humedad relativa y fotoperíodo de 16 horas luz (ALION CE AHC 15A).

Figura 1 Cápsula de E. catillus en madurez fisiológica (a), en etanol al 70% (b), en corte longitudinal (c) y dispersión de semillas en medio de cultivo (d). 

Diseño estadístico

El diseño utilizado fue el de bloques completa-mente al azar, DBCA, (^{Melo et al., 2020}), de seis tratamientos, Tabla 1, y cinco repeticiones; la unidad experimental estuvo constituida por una placa de Petri.

Tabla 1 Tratamientos para germinación in vitro de semillas de E. catillus 

Variables

Las variables, fueron el porcentaje de germinación y de protocormos; la germinación fue establecida por la presencia de una coloración verde, y para el estadio de protocormo fue la coloración verde y de aspecto globoso (^{Nava, 2010}), Figura 2a.

Figura 2 Semillas de E. catillus, en germinación y formación de protocormos (a) y distribución de cuadriculas para evaluación (b). 

Cada placa de Petri se dividió en 4 cuadrantes, y se marcó una cuadrícula de 4 cm2 solo en dos cua-drantes opuestos, Figura 2b; con la ayuda de un estereoscopio ACCU-SCOPE a 6,7 aumentos se registró el total de semillas germinadas y las transformadas en protocormos. Las evaluaciones fueron realizadas a los 32, 40, 49, 53, 57, 60, 64 y 71 días después de la siembra (dds).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El análisis de varianza, ANOVA, Tabla 2, muestra diferencias altamente significativas para trata-mientos (medios de cultivo) en porcentaje de germinación y protocormos en las fechas evalua-das, excepto a los 40 dds; y a los 32 dds en germinación no fueron significativos. La prueba de comparación múltiple de Duncan, α = 0,05, Figura 3, muestra que en la germinación de las semillas, a los 32 y 40 dds, en los seis medios de cultivo, cinco de ellos respondieron de manera similar, el t2 tuvo menor porcentaje; a los 49, 53 y 57 dds, los tratamientos t1, t3 y t6 fueron superiores con respecto a los demás; a los 60 dds, el t1 fue superior e igual a t3; sin embargo, los tratamientos t2 y t5 fueron inferiores a los demás y calificados como un tercer grupo; a los 64 y 71 dds, los tratamientos t1, t3, t4 y t6 igualaron en la respuesta y fueron superiores sin diferencias significativas entre ellos; y t2 y t5 continuaron con menor respuesta en la germinación de las semillas y sin diferencias significativas entre éstos.

La germinación de las semillas a los 32 y 40 dds, la respuesta fue de manera similar en cinco tratamientos a excepción de t2, que fue menor, al respecto se observa que, el uso de AG3 en combinación con ANA en el medio, presentó efecto negativo importante en la germinación in vitro, porque hubo diferencias entre las semillas germinadas, en comparación que no contenía esta combinación, esto indicaría que el ANA, estaría bloqueando la acción del AG3, en el medio de cultivo, en base a que en el t4, que contiene solamente AG3, la germinación ha progresado igual a los demás medios; es importante que, en la introducción in vitro la cápsula debe encontrase en madurez fisiológica y en estado indehiscente; además, han determinado que, en medio MS reducido al 50% en sus sales con pulpa de banano 60 g L-1, canela en polvo 1,5 g L-1 y sin o con AIB a 2,5 mg L-1 fueron favorables para la germinación de cuatro especies de orquídeas (Pérez-Martínez & Castañeda-Garzón, 2016); sin embargo, en el presente trabajo, con un 75% (t3) y 100% (t6) de sales del MS, ambos con 100 mL L-1 de agua de coco, también favorecieron la germinación; esta etapa es crítica en las orquídeas, debido a que el embrión carece de reserva o endospermo (^{Lallana et al., 2016}), que provee de energía para la germinación.

Tabla 2 Anova, coeficiente de variación (CV) y valores descriptivos en la germinación de E. catillus en seis medios de cultivo en diferentes fechas de evaluación después de la siembra (dds) 

Figura 3 Germinación de semillas de E. catillus en seis medios de cultivo evaluados después de la siembra. 

Por otro lado, el inicio de la germinación de la especie en estudio no concuerda con Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews, que tuvo lugar a los 60 días en medio MS + vitaminas + 30 y 5 g L-1 de sacarosa y carbón activado, respectivamente (^{Carranza-Álvarez et al., 2021}), esta diferencia es debido a que se trata de otra especie, y la germinación depende mucho del medio nutritivo y genotipo (^{Flores-Hernández et al., 2017}).

Los tratamientos t3 y t6 que igualaron a t1 (Knudson) considerado como medio específico para la gemina-ción de varias especies de orquídeas, esto evidencia que es posible la germinación de E. catillus con MS + agua de coco a la concentración utilizada, resultados que concuerdan con otros autores, donde reportan que es posible hacer germinar semillas de orquídeas con el agregado de sustancias orgánicas; se ha inducido la germinación in vitro de semillas de Rodriguezia longifolia, Bletia catenulata y Epidendrum spilatum en medio MS suplementado con jugo de piña variando entre ocho a doce semanas; asimismo, para Epidendrum secundum, La organogénesis fue mejor con el suplemento de plátano (^{Chacón-Campana et al., 2017}); en Dendrobium cruentum Rchb. f. en medio VW complementado con homogeneizado de plátano y papa (1000 mg L-1), germinaron semillas in vitro en un 94,69%, y en agua de coco (100 mL L-1) ha favorecido en la formación de protocormos en 47,38% y la combinación de éste con el homoge-neizado de papa con 52,13% (^{Samala & Thipwong, 2023}); por otro lado, en Anacamptis longicornu se obtuvo la germinación de 95,5% en medio Orcgimax y 21,4% en medio MS (^{Arcidiacono et al., 2021}).

En caso de t4, que contenía MS + AG3, respondió bien a la germinación de la orquídea en estudio, similar a lo reportado que, a los 30 días de incubación, semillas de Cattleya mendelii y C. quadricolor en medio MS con 1,5 µM de GA3 y 0,5 µM de NAA se encontraron la mayor tasa de germinación, 9,2% y 96,4%, respectivamente, con respecto al medio Knudson 41,7% y 84,3% sin reguladores de crecimiento (Díaz-Álvarez et al., 2015), en caso del medio Knudson es contrario al resultado del presente trabajo que resultó favorable; asimismo, en Laelia anceps subsp. Anceps se ha logrado la germinación de semillas en MS basal adicio¬nado con 1% (p/v) de carbón activado y sin la adición de reguladores de crecimiento vegetal (^{Castillo-Pérez et al., 2020}).

Los resultados a 64 y 71 dds, concuerdan en tiempo de germinación con los obtenidos de semillas de cápsulas de tamaño intermedio de 9 a 10 cm de longitud, que germinaron alrededor del 90% a los dos meses de cultivo en medio MS sin carbón activado y mantenidas en total oscuridad; pero, las semillas cultivadas igualmente en la oscuridad, en medio con carbón activado no germinaron (^{Flores et al., 2017}). Por otro lado, en medio MS reducido al 50% en sus sales con pulpa de banano 60 g L-1, canela en polvo 1,5 g L-1 y sin o con AIB a 2,5 mg L-1 fueron favorables para la germinación de cuatro especies de orquídeas; sin embargo, estos medios no lograron romper la latencia de embriones inmaduros de las cápsulas (^{Pérez-Martinez & Castañeda-Garzón, 2016}). Las especies de orquídeas responden de diferente manera a un medio de germinación in vitro, Dactylorhiza majalis mejoró en cierta manera cuando la concentración de nitrato fue de 1 mg L-1 (^{Figura et al., 2020}).

La prueba de comparación múltiple de Duncan, α = 0,05, Figura 4, muestra que a los 32 y 40 dds, la formación de protocormos en los seis medios de cultivo, cinco de ellos respondieron de manera similar, sin diferencias estadísticas entre ellos y el t2 tuvo menor porcentaje; mientras que, a los 49, 53 y 57 dds, t1, t3 y t6 fueron superiores con respecto a los demás tratamientos.

Figura 4 Formación de protocormos de E. catillus en diferentes medios de cultivo evaluados después de la siembra. 

Asimismo, t2 igualó estadísticamente a t5 y fueron de menor porcentaje comparado al resto de tratamientos; a los 60 dds, el t1 fue superior e igual a t3; sin embargo, los tratamientos t2 y t5 fueron inferiores a los demás y calificados como un tercer grupo; a los 64 y 71 dds, tuvieron igual compor-tamiento, los tratamientos t1, t3, t4 y t6, sin diferencias significativas entre ellos y superiores a t2 y t5 los que tuvieron una menor respuesta en la formación de protocormos, sin diferencias signifi-cativas entre éstos.

La formación de protocormos, a los 32 y 40 dds, concuerda con los resultados que, en Prosthechea fragrans (Sw.) W. E. Higgins en el medio MS + vitaminas Morel, agua de coco y carbón activado que luego de un mes originó tejidos verdes y rápido desarrollo de protocormos (^{Salgado y Peñaranda, 2019}); mientras que, la combinación de BAP 1,5 mg L-1 + ANA 0,15 mg L-1, resultó mejor con un pro-medio de 6,75 brotes, y observaron la órgano-génesis de Prosthechea citrina (La Llave & Lex.), en el rango de BAP 1,0 a 3,0 mg L-1 (^{Cazarez et al., 2016}). En Trichopilia tortilis Lindl. se observa la formación de protocormos a los 45 días en medio MS líquido y sólido; sin embargo, a los 120 días en el medio sólido se encontró mayor germinación, 91,64% con respecto al medio líquido 78,94% (^{Mendoza, 2016}); por otro lado, en Serapias vomeracea germinó 58,77% en medio Knudson, superior a los medios Vacin and Went y Lindemann y a sus diluciones al 50% incluido a Knudson (^{Acemi & Özen, 2019}).

El desarrollo de protocormos, en E. catillus de 49 a 60 dds, muestra una variación en los seis medios de cultivo, donde se observa tres grupos; t2 y t5 fueron los tratamientos de menor repuesta, resultados que concuerdan con lo reportado para Hadrolaelia grandis, donde encontraron una variación entre los medios dentro de cada periodo de evaluación (^{Vudala & Ribas, 2017}); en Cattleya aurantiaca, Encyclia adenocaula, Epidendrum radicans, Euchile citrina, Laelia albida, L. autumnalis, Oncidium cavendishianum, y O. tigrinum la adición de reguladores como auxinas, citoquininas y giberelinas al medio MS, favorece el crecimiento a partir de protocormos provenientes de semillas (ÁviLa & SaLgado-GarcigLia, 2006). Por otro lado, el desarrollo en Laelia rubescens Lindl. fue mejor en medio, Phytamax + jugo de piña comparado a Phytamax + agua de coco, ambos a una dosis de 100 mL L-1 (^{Mayo-Mosqueda et al., 2020}).

CONCLUSIONES

De los seis medios de cultivo utilizados para la germinación y formación de protocormos de E. catillus, cuatro de ellos a partir de los 64 dds, resultaron ser superiores frente a t2 y t5, estos fueron la formulación Knudson (t1), los que tuvieron MS en un 75% (t3) y 100% (t6) ambos con 100 mL L-1 de agua de coco y MS 100% + 3,0 mg L-1 de AG3 (t4), respectivamente. En base a los resultados, se recomienda probar otras combina-ciones de MS con agua de coco.