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INTRODUCCIÓN
Escherichia coli (E. coli) es una bacteria presente en la microbiota intestinal habitual del humano y animales endotermos (OMS, 2018). Aunque E. coli no es usualmente descrita como bacteria patógena, existen cepas con la capacidad de causar enfermedad, como su variante shigatoxigénica productora de la toxina Shiga 2e (Stx2e-STEC) (Moredo, 2012; Figueroa, 2016).
Stx2e-STEC posee genes que codifican para sus principales factores de virulencia, una toxina (Shiga 2e) y una fimbria (F18), involucradas en la fisiopatología de la enfermedad del edema o de los edemas (EE), afección descrita en porcinos (Fairbrother, 2023). El uso de antibióticos está descrito para controlar la EE, pero el inadecuado empleo de estos agrava la creciente resistencia antimicrobiana (Arrunátegui, 2016), por lo que resulta crucial buscar alternativas preventivas como aquellas basadas en la inmunización de los animales.
Autores como Parma et al. (2000), Souza et al. (2001) y Cheng et al. (2006), así como Vu-Khac et al. (2007), Moredo et al. (2012), Meng et al. (2014) y Baldo et al. (2020) identificaron los genes de Stx2e-STEC en ejemplares con signos clínicos sugestivos de la EE y en animales aparentemente sanos. Estos estudios tienen importancia epidemiológica, sanitaria y económica. Los resultados pueden variar entre países y por la condición clínica individual, así como también se pueden ver influenciados por la manera de obtener la muestra y por el método de detección (Meng et al., 2014).
Si bien casos sugerentes de la EE han sido identificados en algunas granjas porcinas del país, se han detectado los dos genes en estudio en aislados de cerdos con manifestación de diarrea (F. Ramos, datos no publicados). Por otro lado, el cerdo sin manifestación clínica de diarrea podría actuar como potencial portador de la EE (Moredo, 2012).
La falta de publicaciones o estudios que expongan la presencia de cepas de Stx2eSTEC asociadas a la EE en centros de producción porcina a nivel nacional obstaculiza la instauración de planes de prevención que reduzcan las pérdidas económicas generadas por la alteración del estatus sanitario. En relación con lo anterior, el objetivo del presente estudio fue evaluar la posible presencia del gen stx2e y del gen f18 en aislados de E. coli, provenientes de cerdos libres de diarrea.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Experimental
El estudio se desarrolló en el Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina Vetertinaria (FMV) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), Lima, Perú. Se evaluaron 186 aislados de E. coli procedentes de cerdos menores de 50 días de edad sin manifestación clínica de diarrea, pertenecientes a cuatro granjas de crianza tecnificadas de la zona de Lima. La toma de muestras se hizo mediante hisopado rectal individual aleatorio en un estudio previo (octubre-diciembre, 2019).
El estudio fue de tipo descriptivo y de corte transversal. Para la determinación del tamaño muestral se utilizó la ecuación para población desconocida (Dohoo et al., 2003), con un 95% de nivel de confianza (z=1.96), 1.6% de prevalencia mínima esperada y 0.018% de precisión (Baldo et al., 2020). El tamaño de muestra resultante fue de 186.
Extracción de ADN
Para reactivar las de cepas de E. coli, los aislados se inocularon en agar de tripticasa de soya (TSA) y Agar MacConkey (MC), e incubados a 37 °C por 24 h. Posteriormente, se tomaron dos colonias que fueron inoculadas en viales con caldo LB (1.5 ml) e incubadas por 24 h a 37 °C hasta observar turbidez indicativa de crecimiento bacteriano. Para finalizar, se utilizó el kit GeneJET™ Genomic DNA Purification (Thermo Scientific) para la extracción del ADN. Se preservó el ADN a -20 °C.
Detección de stx2e y f18 por PCR
Con PCR convencional se realizó la detección de cada uno de los genes, stx2e y f18, haciendo uso del ADN obtenido en el paso previo como templado. El protocolo empleado fue resultado de una estandarización de lo establecido por Boerlin et al. (2005) y Casey y Bosworth (2009). Los detalles de presentan en el Cuadro 1.
Identificación del Gen stx2e
Se ajustó el protocolo con una concentración de 1X de DreamTaq Buffer (incluye MgCl2 a 2 mM), 0.15 µM de cada cebador y 0.2 mM de dNTPs; asimismo, 0.2 µl de DreamTaq DNA polymerase, 1 µl de ADN y se incluyó agua ultrapura para llegar al volumen final de 20 µl. Además de las muestras en estudio, se consideraron como control blanco al agua ultrapura, a la cepa P5A como control positivo y a la cepa ATCC 25922 como control negativo.
En el termociclado se consideró: 95 °C por 15 min para la desnaturalización inicial; seguido de 35 ciclos de 95 °C por ciclo de desnaturalización por 1 min, 55 °C de hibridación por 1 min y la elongación a 72 °C por 1 min; cerrando con una elongación final a 72 °C por 10 min.
Para la electroforesis se fabricó un gel con 1.5% de agarosa en buffer TBE 0.5X y las condiciones fueron de 90 v, 90 mA y 90 min. Se usó Blue/Orange 6X Loading Dye, 1 µl de tinte por 5 ìl de producto para teñir los amplicones obtenidos del PCR. El tamaño de pares de bases se comprobó utilizando un marcador de peso molecular o ladder (100bp Opti-DNA Marker). Posteriormente, se preparó una solución buffer TBE al 0.5X mezclado con DiamontTM Nucleic Acid Dye a 1X y se sumergió el gel durante 20 min. Con un transiluminador de luz azul se visualizó el tamaño de las bandas obtenidas.
Identificación del Gen f18
Se ajustó el protocolo con una concentración de 1X de DreamTaq Buffer (incluye MgCl2 a 2 mM), 0.15 ìM de cebador forward y 0.15 µM de cebador reverse y 0.2 mM de dNTPs; 0.2 µl de DreamTaq DNA polymerase, 1 µl de ADN y con agua ultrapura para completar los 20 µl de volumen final. Además de las muestras en estudio, se consideraron como control blanco al agua ultrapura, a la cepa P2A como control positivo y a la cepa ATCC 25922 para control negativo.
En el termociclado se consideró: 95 °C por 15 min para la desnaturalización inicial; siguiendo 30 ciclos. En cada ciclo desnaturalización a 95 °C por 45 s, hibridación a 55 °C por 45 s y elongación a 72 °C por 45 s, con una elongación final por 10 min a 72 °C.
Para la electroforesis se fabricó un gel con 1.5% de agarosa en buffer TBE 0.5X, con condiciones de 90 v, 90 mA y 90 min. Se usó Safe-GreenTM, 1 µl de tinte por cada 5 µl de producto para teñir los amplicones obtenidos del PCR. El tamaño de pares de bases se comprobó utilizando un ladder (100bp Plus Opti-DNA Marker). Con un transiluminador de luz azul se visualizó el tamaño de las bandas obtenidas.
El presente estudio tuvo por finalidad evaluar la posible existencia del gen stx2e y del gen f18 en aislados de E. coli de cerdos menores de 50 días de vida y sin diarrea. No se detectó la presencia del gen stx2e ni del gen f18 en los 186 aislados de E. coli bajo estudio; por tanto, la frecuencia resultante fue de 0% (0/186).
Parma et al. (2000) estudiaron por vez primera al gen stx2e en Argentina en cerdos sin diarrea sin llegar a detectar positivos. La similitud con estos resultados podría deberse a la edad de los animales muestreados, debido a que dichos autores incluyeron lechones libres de diarrea (0/19; 0%) y sus respectivas madres (0/20; 0%), cuyas edades no se encuentran dentro del grupo etario susceptible, que son los lechones posdestete (Fairbrother, 2023). Por su parte, Moredo (2012) tampoco halló a stx2e en lechones sin diarrea de 21 ± 3 días de edad, en tanto que los encontró en animales de más edad (69/986; 7%), sugiriendo que la posibilidad de detectar al gen aumenta en edades susceptibles, incluso cuando son animales aparentemente sanos.
En el posdestete, los lechones son más vulnerables a la colonización de STEC por el estrés asociado a la transición de un alimento a otro (Germán et al., 2005), así como más propensos a la EE por la expresión de ciertos receptores, específicamente para F18, que se incrementa posterior a los 21 días de vida, periodo de destete y más estrés (Fairbrother, 2023). Es así como la baja expresión de receptores restringe la unión de la bacteria a los enterocitos, y al no multiplicarse y liberar altamente la toxina Stx2e, baja la probabilidad de hallar al gen o que la enfermedad se manifieste.
Vu-Khac et al. (2007) también estudiaron animales aparentemente sanos menores de 14 días de edad sin encontrar positivos ni para stx2e ni f18 (0%), siendo nuevamente la edad un factor crucial para explicar en parte los hallazgos negativos en cerdos sin diarrea. Los autores también estudiaron lechones con diarrea de la misma edad, hallando una prevalencia de 4% (9/220) para stx2e y de 9% (20/220) para el gen f18, por lo que, si bien la nula o baja manifestación de la EE podría estar influenciada por la edad, aún en lechones lactantes podrían detectarse a los genes stx2e y f18, siendo la diarrea un signo clínico vinculado a esta posibilidad.
Por otro lado, Baldo et al. (2020) evaluaron a stx2e en 171 porcinos sanos, detectando al gen en tres de ellos que se encontraban en la etapa de engorde (1.75%). Asimismo, en los aislados positivos para stx2e evaluaron la presencia de f18, sin obtener resultados positivos (0/3; 0%). Esto podría indicar que aún en casos sugerentes de EE se puede encontrar cepas STEC stx2e positivas, pero f18 negativas (Cheng et al., 2005; Barth et al., 2007; Martineau et al., 2018). Esto, asimismo, es indicativo de que detectar positivos al gen f18 es menos probable que la frecuencia para stx2e, siendo otro punto que explicaría los casos negativos a f18 en este estudio.
En el presente estudio solo se empleó el muestreo por hisopado rectal. Meng et al. (2014) mencionan que la prevalencia de STEC en cerdos sanos puede variar según la zona de muestreo, siendo casi 4.4 y 2.5 veces mayor en muestras del contenido del colon que del intestino delgado y heces, respectivamente. Es así, que el punto anatómico donde se obtuvieron las muestras de este estudio podrían haber afectado la no obtención de resultados positivos.
