http://doi.org/10.15381/rpb.v21i1.8251

TRABAJOS ORIGINALES

Caracterización molecular de la región determinante de resistencia a quinolonas (QRDR) de la topoisomerasa IV de Bartonella bacilliformis en aislados clínicos

Molecular characterization of quinolones resistance determining region (QRDR) of Bartonella bacilliformis topoisomerasa IV in clinical isolates

Abraham Espinoza-Culupú¹, Ruth Quispe-Gaspar¹, Michael Jaramillo¹, Melisa Icho¹, Anika Eca¹, Pablo Ramírez¹, Débora Alvarado¹, Juan Carlos Guerrero², Franklin Vargas-Vásquez³, Ofelia Córdova⁴, Ruth García-de-la-Guarda¹*

1 Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología _ Facultad de Ciencias Biológicas _ Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú. Apartado postal 110058, Lima-11, Perú.

2 Establecimiento de Salud I-4 Huancabamba, Piura, Perú.

3 Instituto de Investigación en Microbiología y Parasitología Tropical - Universidad Nacional de Trujillo, Perú.

4 Laboratorio de Biología Celular y Molecular - Dpto. de Ciencias - Universidad Privada Antenor Orrego, Trujillo, Perú.

*Autor para correspondencia. Email R. García-de-la-Guarda: rgarciad@unmsm.edu.pe

Email A. Espinoza: aespinozac20@gmail.com

Email R. Quispe: ruty_lilly@yahoo.es

Email M. Jaramillo: maycol776@yahoo.es

Email M. Icho: m.biomicro@gmail.com

Email A. Eca: anikaeca@gmail.com

Email P. Ramírez: pramirezr@unmsm.edu.pe

Email D. Alvarado: dalvaradoi@unmsm.edu.pe

Email J.C. Guerrero: guerreroruizjc@hotmail.com

Email F. Vargas-Vásquez: frvargasv@yahoo.es

Email O. Córdova: omacop@hotmail.com

Bartonella bacilliformis es el agente etiológico de la Enfermedad de Carrión, endémica del Perú. Pocas investigaciones han sido realizadas acerca de los genes asociados a la resistencia antimicrobiana en aislados clínicos de este patógeno. Estos genes no están caracterizados molecularmente, ni se conoce la región asociada a dicha resistencia. Por ello, el objetivo del este trabajo fue caracterizar molecularmente la región determinante de la resistencia a las quinolonas (QRDR) en la topoisomerasa IV, que está codificada por los genes parC y parE, así como también desarrollar una prueba de susceptibilidad antimicrobiana para B. bacilliformis. Las muestras sanguíneas de 65 pacientes procedentes de La Libertad, Cusco, Ancash y Piura, se sembraron en placas de agar sangre e incubaron a 30 °C con 5% CO₂. Luego se procedió a: (1) determinar la susceptibilidad antimicrobiana y (2) extraer el DNA genómico, amplificar los genes mencionados, secuenciarlos y analizarlos mediante herramientas bioinformáticas. Se obtuvieron 6 cultivos positivos. Los aislados fueron sensibles a la ciprofloxacina (excepto uno procedente de Quillabamba-Cusco, que presentó susceptibilidad disminuida) y resistentes al ácido nalidíxico. Del análisis de las secuencias aminoacídicas de ParC y ParE de B. bacilliformis se concluye que presentan diferencias aminoacídicas en comparación con las secuencias de las proteínas respectivas de E. coli K12 MG1655, que probablemente confieran resistencia al ácido nalidíxico pero no a la ciprofloxacina. Se determinó que las QRDR de las proteínas ParC y ParE de B. bacilliformis están comprendidas entre los aminoácidos 67 al 118 y 473 al 530, respectivamente. El antibiograma y la concentración mínima inhibitoria se evalúan mejor usando inóculos a escala 1 de McFarland y a los 6 días de incubación.

Palabras clave: Susceptibilidad antimicrobiana; Bartonella bacilliformis; ParC; ParE; quinolonas.

Bartonella bacilliformis is the etiologic agent of Carrion's disease, which if endemic to Peru. Studies on antimicrobial resistance genes from clinical isolates of this pathogen are scarce, and the molecular characteristics of these genes and their region resistance-associated are currently unknown. In this work we made the molecular characterization of the quinolone-resistance, and establish the region (QRDR) for the topoisomerase IV, which is encoded by the parC and parE genes, as well as develop an antimicrobial susceptibility test for B. bacilliformis. 65 Blood samples from La Libertad, Cusco, Ancash and Piura were processed on Blood Agar plates and incubated at 30 °C, 5% CO₂. The antimicrobial susceptibility was determined, then the genomic DNA extracted, aforementioned genes amplified, their sequence determined and it analyzed using bioinformatics tools. Six positive cultures were obtained. The isolates were susceptible to Ciprofloxacin (except one strain from Quillabamba _ Cusco, which showed decreased susceptibility) and were resistant to Nalidixic Acid. From the sequence analysis of B. bacilliformis ParC and ParE there have been shown amino acid differences compared to the respective protein sequences from E. coli K12 MG1655, which is likely to confer resistance to Nalidixic Acid but not to Ciprofloxacin. It was determined that B. bacilliformis ParC and ParE proteins QRDRs are comprised between amino acids 67 to 118 and 473 to 530, respectively. The antibiogram and the minimal inhibitory concentration are best assessed using the #1 McFarland standards after a 6-day incubation period.

Keywords: antimicrobial susceptibility; Bartonella bacilliformis; ParC; ParE; quinolones.

Bartonella bacilliformis es el agente etiológico de la Enfermedad de Carrión, endémica de los valles interandinos del Perú. Esta enfermedad es de notificación obligatoria en el Perú y sus tasas de incidencia por regiones han variado a lo largo de décadas, con un número elevado de casos en Amazonas, Ancash y Piura en los últimos años (DGE, 2013). Se han usado diferentes antibióticos para el tratamiento de infecciones con B. bacilliformis, tales como eritromicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, rifampicina, entre otros (MINSA 2006, Rolain et al. 2004). El tratamiento con estos antibióticos produce una rápida reducción de la bacteremia, sin embargo, se ha reportado casos en que la bacteremia persiste después de suspender el tratamiento con antibióticos (Rolain et al. 2004, Henriquez et al. 2004, Perez et al. 2010, Biswas 2010).

Actualmente, la ciprofloxacina (Cip) es considerada como el tratamiento de primera línea en Perú, debido a su buena penetración celular (MINSA 2006, Tarazona et al. 2006). Existen reportes donde se menciona que el 22.6% de los pacientes presentaron bacteremia asintomática crónica después del tratamiento con Cip (Pachas 2000), a pesar que este antibiótico aparentemente es exitoso (Maguiña et al. 2001, Maguiña et al 2008, Rolain et al. 2004). Además estudios previos han demostrado una susceptibilidad disminuida de B. bacilliformis a la Cip, también como a otras fluoroquinolonas (Flores 2008, Dörbecker et al. 2006, Sobraques et al. 1999). Asimismo, se ha determinado que las fluoroquinolonas usadas en monoterapias pueden ser inefectivas porque se han aislado fácilmente B. bacilliformis resistentes a Cip in vitro (Biswas et al. 2007). Recientemente, se ha determinado que B. bacilliformis presenta resistencia constitutiva a la quinolona ácido nalidíxico (Nal) (Del Valle et al. 2010). Asimismo, se ha demostrado que existen aislados de B. bacilliformis que están adquiriendo resistencia a rifampicina y eritromicina además de Cip (Minnick et al. 2003, Biswas et al. 2007). Maguiña et al. (2008), afirman que la mayoría de estos tratamientos se han definido basándose en opinión de expertos o estudios pequeños controlados, haciéndose necesaria la ejecución de ensayos clínicos randomizados controlados para la búsqueda de un mejor tratamiento.

Actualmente existen pocas investigaciones acerca de la susceptibilidad a antimicrobianos in vitro de B. bacilliformis. No existe un antibiograma estandarizado para esta bacteria y tampoco se conocen los mecanismos de resistencia ni las secuencias de los genes asociados a dicha resistencia. La base molecular de la resistencia a las quinolonas, como ocurre en otros microorganismos, reside en mutaciones en la región determinante de resistencia a quinolonas (QRDR) de los genes gyrA, gyrB de la topoisomerasa II y los genes parC y parE de la topoisomerasa IV (Law et al. 2010, Serra 2008, Hopkins et al. 2005).

Por consiguiente, el objetivo del presente estudio fue caracterizar la secuencia de la QRDR de ParC y ParE de aislados clínicos de B. bacilliformis de zonas endémicas, así como estandarizar un procedimiento para realizar el antibiograma y la concentración mínima inhibitoria (CMI).

Material y métodos

Pacientes y muestras.- Se colectaron 65 muestras de sangre venosa en tubos al vacío con anticoagulante EDTA, a personas con síntomas de la Enfermedad de Carrión (DGE 2013), según su historia clínica, para lo cual nos asistía el personal del centro de salud de la zona, con autorización verbal del Jefe de la Región de Salud respectiva dada después de haberle presentado el proyecto de la investigación.

Los muestreos fueron realizados en las siguientes zonas endémicas de la Enfermedad de Carrión (DGE 2013): a) Sondor (n=8), Sondorrillo (n=12) y Carmen de la Frontera (n=23), Departamento de Piura, b) Urubamba (n=5) y Quillabamba (n=10), Departamento de Cusco, c) Calipuy (n=4), Departamento de La Libertad, y d) Caraz (n= 3), Departamento de Ancash.

Declaración de ética.- El estudio fue aprobado bajo los lineamientos del Comité de Ética de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Todos los pacientes o adultos responsables firmaban por escrito el consentimiento informado para la toma de muestra y su posterior análisis. Los pacientes fueron informados que la muestra de sangre sería utilizada para fines de investigación y tomaban la decisión si aceptaban o rechazaban la toma de muestra.

Aislamiento de B. bacilliformis.- Para el aislamiento de esta bacteria a partir de sangre de pacientes, se emplearon placas de agar Columbia suplementado con 5% de glóbulos rojos de ovino y 2% de suero bovino fetal, así como tubos con medio bifásico compuestos por una fase sólida del mismo medio antes descrito y una fase líquida de caldo infusión cerebro corazón (BHI) (Colichón & De Bedon 1973; Coleman & Minnick 2001). Las placas se sembraron por diseminación con 200 µL de sangre homogeneizada y los tubos con medio bifásico con la adición de 800 a 1000 µL de sangre, siguiendo la metodología de Quispe (2009). Los cultivos se incubaron a 30 °C con 5% de CO₂ a una humedad relativa de 100% (Quispe 2009; Minnick et al. 2003) por seis a ocho días hasta su crecimiento. Los subcultivos y los ensayos de susceptibilidad antimicrobiana se realizaron en agar Columbia base (Merck) suplementado con 8% de glóbulos rojos de ovino.

Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana en Bartonella bacilliformis.- Se empleó la técnica de Kirby-Bauer (CLSI 2011, Restrepo 2002; Perilla et al. 2003) modificada según lo indicado por Pendle et al. (2006) para los ensayos de difusión en disco, y la prueba Épsilon para la CMI. Los cultivos de B. bacilliformis aislados de pacientes y las cepas del Instituto Pasteur de Francia CIP57.17 y CIP57.18, se resuspendieron en un volumen de 3 mL de solución salina fisiológica a pH 7.2 a una concentración celular equivalente a las escalas 0.5, 1 y 2 de McFarland. Se inoculó un volumen de 1.5 mL de las suspensiones bacterianas en las placas, bañando toda la superficie y aspirando el exceso con una micropipeta. Luego se procedió a colocar los discos de antibiótico (Oxoid) e incubar a 30 °C con 5% de CO₂ y a una humedad relativa de 100%. La evaluación del crecimiento e inhibición bacteriana en las placas se realizaron desde el día 5 hasta el 12. Para la susceptibilidad bacteriana se emplearon los siguientes antimicrobianos: discos de Cip (5 µg) y de Nal (30 µg), y tiras de Cip con una gradiente de concentración de 0.02 a 32 µg/ µL (tiras MICE de Oxoid).

Extracción de DNA.- La extracción del DNA genómico de las bartonelas, provenientes de cultivos en placas, se realizó usando el kit Miniprep de Wizard Genomic Purification (Promega), siguiendo las indicaciones del fabricante.

Lavado del paquete celular.- Se hicieron 3 lavados de las células bacterianas con agua de grado molecular para eliminar los restos de medio de cultivo, centrifugando a 13000 rpm por 2 minutos y descartando el sobrenadante.

Lisis celular y acción de la RNasa.- Al sedimento de células bacterianas se le adicionó 600 µl de la solución de lisis e incubó a 80 °C por 5 minutos, luego se dejó a temperatura ambiente por 5 minutos para adicionarle 3 µL de RNasa (4mg/mL) y se incubó a 37 °C por 1 hora.

Precipitación de proteínas.- Se agregó 200 µL de solución de precipitación de proteínas al lisado tratado con RNasa, se homogeneizó vigorosamente por 20 segundos e incubó por 5 minutos en hielo. Luego se centrifugó a 13000 rpm por 3 minutos colocando el sobrenadante a un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL.

Precipitación de DNA.- Al tubo de microcentrifuga con sobrenadante, se adicionó 600 µL de isopropanol absoluto mezclando suavemente por inversión, hasta formar una masa visible de DNA, para luego centrifugar a 13000 rpm por 2 minutos, eliminando el sobrenadante cuidadosamente y escurriendo el tubo en papel absorbente limpio.

Lavado del DNA.- Al microtubo que contenía el sedimento de DNA se adicionó 600 µL de etanol al 70%, se mezcló por inversión varias veces para lavar el sedimento, luego se centrifugó a 13000 rpm por 2 minutos, se eliminó el sobrenadante cuidadosamente y se dejó secar el tubo de 10 a 15 minutos.

Hidratación del DNA.- El DNA fue rehidratado con 100 µL de solución de rehidratación de DNA por incubación a 65°C por 1 hora, periódicamente se golpeaba el tubo suavemente para mezclar la solución. Finalmente se guardó a -20°C hasta su uso.

Ensayo de PCR.- La amplificación por PCR del gen ialB de B. bacilliformis se realizó para confirmar la especie (Mitchell & Minnick 1995, Flores 2008). Posteriormente, se amplificó las regiones QRDR de los genes parC y parE de la topoisomerasa IV. Los iniciadores usados fueron ParC F: TCTTATGCTAAGTGTGCACGGA y ParC R: TACCAACAGCAATCCCTGAAGAA (Flores, 2008), ParE F: GAAGTCGCACGAGAGCGCAA y ParE R: AGCGGAACCGTTCTTCCGGT (diseñados en este estudio). El parámetro de ciclaje fue: desnaturalización a 95 °C durante 3 minutos (1 ciclo), seguido de 29 ciclos a 94 °C por 30 segundos, hibridación a 57 °C (parC), 58 °C (ialB) y 62 °C (parE) por 30 segundos, extensión a 72 °C por 30 segundos y extensión final a 72 ºC por 7 minutos. La mezcla de reacción en un volumen de 50 µL fue: 1.5 µL de cada iniciador (10 µM), 5 µL de dNTPs (2mM), 5 µL de buffer Kod Hot Start (10X), 3 µL de MgSO₄ (25mM), 1.5 µL de Taq KOD Hot Start (Novagen^®), 31.5 µL de agua grado molecular y 1 µL de DNA molde.

Para visualizar el DNA y los productos de amplificación, se hicieron electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE 0,5X, mezclando las muestras con solución de carga 6X (Novagen^®). Se utilizó el marcador de tamaño molecular Perfect DNA^TM 50 bp Ladder (Novagen^®). Luego de la electroforesis, los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 µg/mL), por 45 segundos, para visualizarlos en el transiluminador UV.

Secuenciamiento y análisis bioinformático.- Los amplificados fueron secuenciados por la empresa Macrogen, con secuenciamiento estándar y por ambas direcciones. El análisis in silico se realizó mediante herramientas bioinformáticas empleando Bioedit (Hall 1999) y MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011) para evaluar y obtener la secuencia consenso de los genes. Posteriormente se usó CLUSTALW 2.1 (Thompson et al. 1994) para los alineamientos múltiples y determinar las posibles mutaciones en la secuencias nucleotídicas y aminoacídicas, comparando nuestras secuencias con las depositadas en la base de datos GenBank para los genes parC y parE de B. bacilliformis KC583 y E. coli K-12 MG1655.

Modelamiento por homología del dominio QRDR de ParC y ParE de B. bacilliformis relacionadas a la resistencia antimicrobiana.- Con las secuencias aminoacídicas de B. bacilliformis se realizaron los modelamientos para localizar, en la estructura, los aminoácidos involucrados en la resistencia antimicrobiana. Para estos modelamientos se empleó el servidor online SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/). Los modelos fueron obtenidos en formato pdb y las estructuras tridimensionales se visualizaron con Swiss-Pdb Viewer 4.1.0 y Jmol13.

Obtención de las secuencias de genes relacionados a resistencia antimicrobiana en el GenBank.- Se accedió al GenBank para obtener las secuencias de los genes de la topoisomerasa IV de B. bacilliformis KC583 parC y parE (Gene ID: 4684170 y 4684565), y para E. coli cepa K-12 MG1655 (Gene ID: 947499 y 947501) para compararlas con nuestras secuencias obtenidas.

Finalmente las secuencias nucleotídicas de los aislados de B. bacilliformis, obtenidos en el presente estudio, fueron ingresadas a la base de datos EBI (http://www.ebi.ac.uk/) con los números de acceso siguientes: HG315965, HG315966, HG315967 para el gen parC y HG315962, HG315963, HG315964 para el gen parE

Resultados

De los muestreos realizados se obtuvieron seis cultivos positivos (9%) con características culturales compatibles con B. bacilliformis. A los cultivos positivos se les codificó con USM-LMMB (Universidad Nacional Mayor de San Marcos _ Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología), seguido del número del aislado: USM-LMMB-001 (Calipuy - La Libertad); USM-LMMB-002 y USM-LMMB-006 (Quillabamba _ Cuzco); USM-LMMB-003 (Urubamba- Cuzco); USM-LMMB-005 (Sondor- Piura); USM-LMMB-007 (Carmen de la frontera _ Piura). Los seis cultivos fueron positivos a la amplificación del gen ialB, indicando que los cultivos corresponden a B. bacilliformis.

Susceptibilidad antimicrobiana en Bartonella bacilliformis.- Se ha estandarizado el procedimiento para realizar el antibiograma y la CIM (mediante la prueba Épsilon) para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de B. bacilliformis. Se obtuvieron crecimientos uniformes en las placas, siendo el inóculo con el que se visualizaron mejor los halos de inhibición del crecimiento bacteriano, el que estaba a una concentración celular equivalente al tubo N° 1 de la escala de McFarland (Fig. 1, Tabla 1, Fig. 2 y Tabla 2). En cuanto al tiempo de incubación óptimo para hacer la medición del diámetro de dichos halos, éste resultó ser el día 6 después de la siembra de las placas, debido a que fue el menor tiempo en el que se observaron los halos mejor definidos (Tabla 1 y 2).

Con respecto a la susceptibilidad de los aislados obtenidos, todos mostraron resistencia al Nal (Fig. 3A), y fueron sensibles a Cip (Fig. 3B y Fig. 3C), a excepción del aislado USM-LMM-002 procedente de Quillabamba - Cusco, que mostró susceptibilidad disminuida a Cip (Fig. 4).

Amplificación de genes de la topoisomerasa IV de Bartonella bacilliformis.- Las amplificaciones de las QRDR de los genes de la topoisomerasa IV se evidenciaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los carriles del 1 al 4 corresponden al amplificado de la QRDR del gen parC con un tamaño de 349 pb, y los carriles del 5 al 8 al amplificado de la QRDR del gen parE con un tamaño de 1495pb como se muestra en la Fig. 5.

Análisis in silico de la subunidad A (ParC) y subunidad B (ParE) de la topoisomerasa IV de Bartonella bacilliformis.- El análisis se hizo comparando las secuencias de ParC y ParE de B. bacilliformis con las de E. coli K12 debido a que en esta bacteria se conocen mejor las QRDR y las sustituciones de aminoácidos en las posiciones que alteran la susceptibilidad a las quinolonas. De esta manera hemos deducido las posiciones equivalentes en B. bacilliformis.

Secuencias aminoacídicas de ParC.- En el análisis de las secuencias aminoacídicas de ParC de los aislados de B. bacilliformis, se encontró que existen diferencias a nivel de los aminoácidos 80 y 94 (Ser por Ala) dentro de la QRDR, comparando con la QRDR de ParC de E. coli K12. Además se encontraron otros cambios muy cercanos al sitio activo en los aminoácidos 123 y 129 también de Ser por Ala. El aislado USM-LMMB-003 presentó diferencias aminoacídicas (Tyr por Asp) fuera de la QRDR (color celeste, Fig. 6) en los aminoácidos 124, 149, 164, 167 y 175 (numeración correspondiente a B. bacilliformis) incluso en el sitio activo.

Secuencias aminoacídicas de ParE.- En el análisis de las secuencias aminoacídicas de ParE, no se encontró ninguna diferencia dentro de la QRDR entre los aislados, pero sí se encontraron diferencias en relación a E. coli K12, en el aminoácido 441 (Lys por Arg), que es el más reportado para cepas con resistencia a fluoroquinolonas en E. coli. También en el aminoácido 451 se puede observar un cambio de Ser por Ala como se muestra en la (Fig. 7B). Analizando las secuencias nucleotídicas del gen parE de los aislados de B. bacilliformis, se encontraron en USM-LMMB-005dos mutaciones puntuales a nivel nucleotídico, las cuales no produjeron cambios en los aminoácidos 328 y 458 (Fig. 7A).

Modelamiento por homología del dominio QRDR de ParC y ParE de B. bacilliformis relacionadas a la resistencia antimicrobiana.- En la estructura terciaria del QRDR de ParC y ParE de B. bacilliformis se pudo apreciar cambios en la estructura terciaria en las posiciones donde existe una diferencia aminoacídica de Ser por Ala, cuando se le compara con E. coli K12. Estos cambios sugieren una débil interacción con la quinolona, los cambio son resaltados en círculo rojo como se observan en la Figura 8 y 9

Discusión

La Enfermedad de Carrión aún continúa siendo un problema de salud pública en Perú, a pesar de su importancia actualmente existen pocos estudios sobre la resistencia antimicrobiana de este patógeno. El presente estudio es a nuestro entender el primer trabajo sobre caracterización molecular de genes asociados a la resistencia antimicrobiana de aislados de B. bacilliformis de zonas endémicas del Perú. Este trabajo es de gran importancia, porque a pesar que las especies de Bartonella son altamente susceptibles a pruebas de antibióticos (Dörbecker et al. 2006), existen reportes de fallas en la monoterapia para las enfermedades relacionadas a Bartonella usando beta-lactámicos, macrólidos, tetraciclina, rifampicina o fluoroquinolonas (Biswas et al. 2007). Los aislados de B. bacilliformis presentaron una CIM para Cip que oscilaba entre 0.19 y 0.023 mg/L (Tabla 3), la que concuerda con los valores de CIM descritos en la literatura (Sobraquès et al. 1999, Döbecker et al. 2006, Angelakis et al. 2008). En cuanto a la susceptibilidad mediante Kirby-Bauer, los aislados analizados mostraron resistencia al Nal (primera quinolona) y sensibilidad a la Cip (Fig. 3).