ARTÍCULOS PRIMARIOS

Aislamiento bacteriológico y caracterización de lesiones histopatológicas en tetra bleeding heart (Hyphessobrycon erythrostigma) de la cuenca amazónica peruana

Bacteriological isolation and characterization of histopathological lesions in tetra bleeding heart (Hyphessobrycon erythrostigma) of the peruvian amazon basin

 

Adhemir Valera A.^1,3, Jessica Jurado P.¹, Alberto Manchego S.² , Nieves Sandoval C.¹

¹ Laboratorio de Histología, Embriología y Patología Veterinaria,

² Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

³ E-mail: nieves.sandovalchaupe@gmail.com

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RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de agentes bacterianos y caracterizar las lesiones histopatológicas en tejidos del pez ornamental ‘tetra bleeding heart’ (Hyphessobrycon erytrhostigma) procedentes de un acuario comercial de la ciudad de Iquitos, Perú. Para el estudio microbiológico se utilizaron 60 peces, tomándose muestras de bazo y riñón. El aislamiento se hizo en agar MacConkey, agar Tripticasa de Soya, agar selectivo para Pseudomonas-Aeromonas (GSP) y agar Cytophaga. La identificación de los géneros bacterianos se hizo mediante la coloración Gram y pruebas bioquímicas. Para el estudio histopatológico se utilizaron otros 60 peces, evaluándose los tejidos de piel, ojo, branquias, estómago, intestino, hígado, bazo, músculo, riñón y peritoneo. Se aislaron siete géneros bacterianos: Pseudomonas, Aeromonas, Lactobacillus, Bacillus, Flavobacterium, Staphylocccus y Escherichia. En los estudios histopatológicos, se observó en las branquias la presencia de esporas de Mixosporidium sp, hiperplasia y fusión de lamelas; en hígado y peritoneo se hallaron granulomas parasitarios y bacterianos; en músculo, riñón y bazo se encontraron granulomas bacterianos; y en el estómago e intestino se observó hiperplasia de las células epiteliales, entre otras lesiones. El 52.3% (22/42) de los granulomas bacterianos fueron positivos a la tinción de Ziehl Neelsen, donde se evidenció bacterias bacilares largas acidorresistentes. No se observaron lesiones en los ojos.

Palabras clave: Hyphessobrycon erythrostigma; estudio microbiológico; estudio histopatológico

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ABSTRACT

The aim of this study was to determine the presence of bacterial agents and to characterize the histopathological lesions in ornamental tetra bleeding heart (Hyphessobrycon erytrhostigma) fish from a commercial aquarium in the city of Iquitos, Peru. For the microbiological study 60 fish were used, samples were taken from spleen and kidney. Isolation was done on MacConkey agar, Trypticase Soy agar, Pseudomonas Aeromonas selective agar (GSP) and Cytophaga agar and the genus identification was done by Gram staining and biochemical tests. Another 60 fish were used for the histopathological study where the skin, eye, gills, stomach, intestine, liver, spleen, muscle, kidney and peritoneum tissues were analyzed. Seven bacterial genera were isolated: Pseudomonas, Aeromonas, Lactobacillus, Bacillus, Flavobacterium, Staphylocccus and Escherichia. Spores of Mixosporidium sp, hyperplasia and lamella fusion were observed in gills. In the liver and peritoneum, parasitic and bacterial granulomas were found. In muscle, kidney and spleen, bacterial granulomas were found, and in stomach and intestine epithelial cell hyperplasia were found, among other lesions. Results showed that 52.3% (22/42) of the bacterial granulomas were positive for Ziehl Neelsen staining, which showed acid-fast bacilli bacteria. No lesions were found in the eyes.

Keywords: Hyphessobrycon erythrostigma; microbiological study; histopathological study

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INTRODUCCIÓN

Un estudio hecho en el Perú en 2006 reveló que 100 000 personas se beneficiaban con la extracción de peces ornamentales (FAO, 2010). La explotación y el comercio de peces ornamentales se ha convertido en una actividad económicamente importante, dado el incremento en la demanda nacional e internacional, exportándose a los Estados Unidos de América, Europa y Asia (Ruiz, 2005; FAO, 2010).

La salud de los peces puede afectarse por enfermedades causadas por diversos agentes patógenos, pudiendo llegar a ocasionarles la muerte (Roberts, 2001). Muchas de estas enfermedades son producidas por bacterias, las cuales ingresan al medio acuático ante un mal manejo sanitario, mientras que otras habitan como flora normal del pez o del agua. Sin embargo, en casos de estrés se tiene una respuesta inmune ineficiente en los peces, , que es aprovechada por estas bacterias para provocar infecciones (Chuquipiondo, 2014).Asimismo, diversos agentes patógenos que infectan peces de acuario tienen la capacidad de afectar al humano por lo que tienen una implicancia relevante en salud pública (CFSPH, 2007).

Los ‘tetra bleeding heart’ (Hyphessobrycon erythrostigma), conocidos también como tetra corazón sangrante o tetra de mancha roja, son parte de los peces con mayor demanda a nivel internacional (Araujo y Bances, 2009). En peces ornamentales de Rio Negro, Brasil, incluyendo al ‘tetra bleeding heart’ se han aislado bacterias de los géneros Staphylococcus, Nocardia, Acinetobacter y Lactococcus, bacterias potencialmente patógenas y que proliferan en condiciones de estrés (Carvalho et al., 2015). Es poco lo que se conoce del estado sanitario de esta especie en el Perú, de allí que se requiere estudiar los agentes bacterianos que causan lesiones en los tejidos. En el presente trabajo se realiza el estudio microbiológico e histopatológico de H. erythrostigma provenientes de la Amazonía del Perú.

MATERIALES Y MÉTODOS

Tipo y Lugar de Estudio

El estudio fue de tipo observacional transversal descriptivo y se llevó a cabo en 2015. Los peces en estudio provinieron de un centro de exportación de peces ornamentales amazónicos ubicado en la ciudad de Iquitos, Loreto, Perú. Los peces son capturados en los ríos de la selva peruana y agrupados, según la especie, en acuarios donde reciben el cuidado necesario para su alimentación y mantenimiento de la calidad del agua.

Tamaño de Muestra

El tamaño de muestra se basó en una frecuencia de 50% de casos esperados, como escenario conservador, un nivel de confianza del 95% y un error aceptado del 10%. Con esta base, se seleccionaron 120 peces ‘tetra bleeding heart’ (H. erythrostigma). Debido al pequeño tamaño de los peces (6 cm de longitud) y de sus órganos (bazo de 2 mm de diámetro, riñón de 3 x 2 mm), la mitad de los peces se empleó en el estudio microbiológico y la otra mitad en el estudio histopatológico,

Material Biológico

Los peces se encontraban en aparente buen estado de salud y recibían alimento peletizado. Fueron trasladados 140 peces al Laboratorio de Ictiopatología de la Facultad de Medicina Veterinaria (FMV) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, en Lima, en bolsas con agua de su propio acuario y con suficiente oxígeno. Se les mantuvo en ayunas por 12 h para vaciar su tubo digestivo, con la finalidad que el agua de transporte permanezca limpia. El tiempo del transporte fue de tres horas.

A la llegada, los peces fueron trasladados a acuarios, pero no fueron puestos directamente con el agua de estos recipientes para evitar diferencias en cuanto a temperatura y oxígeno disuelto. Se hizo un cambio gradual durante 24 h. Los peces recibieron alimento peletizado hasta realizar el proceso experimental, donde se seleccionaron 120 peces.

Necropsia

Los peces fueron anestesiados mediante adición al agua de benzocaína 1 g por cada 20 l (Ross L y Ross B, 2008) y sacrificados mediante corte medular con hoja de bisturí entre el cerebro y la medula espinal (Roberts y Sheperd, 1980; Rosenthal, 2013). La necropsia se realizó según los procedimientos de rutina (Reimschuessel et al., 1988).

Estudio Microbiológico

Con ayuda de una lupa, se realizaron punciones en el riñón y el bazo en los 60 peces, utilizando un ansa estéril de punta para el aislamiento de las bacterias.

Las muestras fueron sembradas en medio agar Tripticasa de Soya (TSA) a 30 °C por 24 h, Agar Cytophaga a 30 °C por 96 h, agar específico el aislamiento de bacterias del género Flavobacterium, Agar GSP a 30 °C por 96 h, agar específico para el aislamiento de Aeromonas sp y Pseudomonas sp, y Agar MacConkey a 30 °C por 24 h para el crecimiento de bacterias gramnegativas. Para la identificación bacteriana se utilizó el diagrama de identificación propuesto por Orvay (1993), así como el Manual de Determinación Bacteriológica de Bergey´s (Hoelt et al., 2000). Los primeros aislados fueron conservados en refrigeración (8 °C) en espera del crecimiento de todas las muestras. Para la identificación y caracterización de las colonias se utilizó la coloración Gram y pruebas bioquímicas como: oxidasa, catalasa, Medio LIA, Agar Simmons Citrato, Medio TSI, Rojo de Metilo-Vogues Proskauer, Medio SIM y la prueba de óxido-reducción.

Estudio Histopatológico

Luego del sacrificio, se separó la cabeza, cola y aletas del resto del cuerpo, y fueron colocados en un frasco rotulado que contenía formol tamponado al 10% hasta su procesamiento. Se realizó la tinción convencional de hematoxilina y eosina a todas las muestras, y la tinción Ziehl-Neelsen en las muestras que presentaban granulomas con sospecha de ser causadas por Mycobacterium sp. Las láminas histológicas fueron observadas con un microscopio óptico de luz con aumentos de 10X, 40X, 100X para determinar lesiones patológicas en bazo, riñón, hígado, estómago, intestino delgado, peritoneo, ojo, piel, músculo esquelético y branquias. Los hallazgos fueron categorizados según el grado de afección (normal, escaso, leve, moderado y severo) y tipo de trastorno (de crecimiento, parasitario, circulatorio, inflamatoria y degenerativo) propuestos por Reimshuessel et al. (1992).

Análisis de Datos

Se realizaron estimaciones de frecuencias de los géneros bacterianos aislados y de las lesiones histopatológicas encontradas, según Bland y Alman (1986).

Consideraciones Éticas

En el estudio se contemplaron las normas éticas para la investigación señaladas por el Comité de Ética y Bienestar Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

RESULTADOS

En el cultivo microbiológico de las muestras de bazo y riñón se identificaron siete géneros bacterianos: Flavobacterium (16/60; 26.7%), Bacillus (13/60; 21.6%), Staphylococcus (11/60; 28.3%), Aeromona (6/60; 10%), Pseudomona (3/60; 5%), Lactobacillus (1/60; 1.7%), Plesiomona (1/60; 1.7%) y Escherichia (9/60; 15%).

En el estudio histopatológico del bazo solo se observaron granulomas bacterianos (Figura 1A en el 13.3% (8/60) de las muestras, con un grado de afección escaso y leve.

En la piel se encontró necrosis epitelial (3.3%; 2/60) e infiltración de células inflamatorias en el 20% de los casos (12/60) (Figura 1B).

En el músculo esquelético se observaron pocos quistes de Microsporidium sp (5%; 3/60) (Figura 1C), granulomas bacterianos (5%; 3/60) (Figura 1D), infiltración de células inflamatorias (73.3%; 44/60) y necrosis de las fibras musculares (95%; 57/60) (Figura 1E), siendo estos dos últimos hallazgos de grado escaso y leve.

En el estómago se observó hiperplasia de las células epiteliales (85%; 51/60) y atrofia de las células epiteliales (10%; 6/60) (Figura 2A), ambas en grado leve. Además, se encontraron lesiones degenerativas como desprendimiento de las células epiteliales (20%; 12/60) y necrosis del epitelio estomacal (43.3%; 26/60) (Figura 2B), mayormente de grado escaso. En el peritoneo solo se observaron granulomas bacterianos (31.6%; 19/60), granulomas de tipo parasitario (36.6%, 22/60) e infiltración de células inflamatorias (16.6%; 10/60) (Figuras 2C, D).

En el hígado, las lesiones más frecuentes fueron la degeneración hidrópica (88.3%) y la degeneración grasa (43.3%) (Figura 3A) en grados de afección severos. Además, se encontraron granulomas parasitarios (33.3%) (Figura 2F) (ver Cuadro 2).

En las branquias, todas las muestras presentaron hiperplasia del epitelio, fusión de lamelas secundarias (Figura 3A) y esporas de Mixosporidium sp (Figura 3B). Asimismo, se encontró infiltración de células inflamatorias en el 63.3% de las muestras (Figura 3B) (ver Cuadro 1). En el riñón, los túbulos renales presentaban degeneración hidrópica (93.3%) y edema peritubular (61.6%) (Figura 3C), además de granulomas bacterianos (13.3%) (Figura 3D (ver Cuadro 4).

En la histología del intestino, el 78.3% de las muestras presentaron hiperplasia de los enterocitos (Figura 3E) y el 41.6% presentaba necrosis de los enterocitos (Figura 3F), desde grado escaso a moderado (Cuadro 1). Por otro lado, no se encontraron lesiones histopatológicas en ojos.

En 42 muestras de órganos teñidas con H-E se observaron granulomas bacterianos. Estos fueron sometidos a tinción de Ziehl Neelsen encontrando 22 muestras positivas (52.3%, 22/42), correspondiendo al hígado (3/ 4), riñón (4/8), músculo esquelético (1/3), bazo (2/8) y peritoneo (12/19). En las láminas positivas se evidenciaron bacterias bacilares ácido resistentes en el interior de los granu-lomas (Figura 4).

Lesiones histológicas como granulomas que contienen bacilos acidorresistentes fueron pruebas sólidas de la presencia de bacterias del género Mycobacterium en peces (Center for Food Security and Public Health , 2006).

DISCUSIÓN

Los resultados indican una frecuencia elevada de peces infectados con siete géneros bacterianos potencialmente patógenos. Esto es similar a los valores hallados por Palacios et al. (2015) en tetra neón (Paracheirodon innesi), donde se ha encontrado bacterias de los géneros Flavobacterium, Staphylococcus, Pseudomonas y Bacillus; indicando que ambas especies de peces son susceptibles a infectarse con bacterias de los mismos géneros.

Los peces del estudio fueron considerados como clínicamente sanos; sin embargo, el 27.1% se encontraba infectado con Flavobacterium sp. Se ha demostrado en peces que las respuestas inmunes innatas y adquiridas que se activan frente a patógenos bacterianos permiten que las infecciones subclínicas se tornen en clínicas cuando los peces son sometidos a condiciones inmunosupresoras como el estrés de captura y de cautiverio en acuarios (Ellis, 2001).

Las lesiones de hiperplasia en branquias se consideran como respuestas adaptativas frente a afecciones tisulares, pero cuando la hiperplasia no es lo suficientemente rápida para proteger a las lamelas ocurre la fusión lamelar (Ramírez et al., 2009). Estas lesiones pueden ser causadas por agentes bacterianos, parasitarios e incluso por una mala calidad del agua (Noga, 2000). Según Domitrovic (1998), estas lesiones también pueden ser causadas por Mixosporidium sp, lo cual concuerda con este estudio donde se observó la presencia de estas esporas en todas las muestras. Similar conclusión fue dada por Iregui et al. (1999) en cachama blanca (Piaractus brachypomus) quienes reportan una severa atrofia de las lamelas ante la presencia de estos parásitos.

Las lesiones en piel fueron poco frecuentes (infiltración de células inflamatorias, necrosis e hiperplasia de células epiteliales). Estos hallazgos están relacionados a procesos inflamatorios asociados a bacterias de los géneros Escherichia, Pseudomonas y Aeromonas entre otros. Escherichia spp puede causar daño a nivel intestinal o producir lesiones en las branquias y en piel, como ha sido observado en peces ornamentales tropicales Poecilia sp y Carassius sp (Austin B y Austin D, 2007). Este tipo de lesiones son similares a las encontradas en tilapia nilótica (Oreochromis niloticus) infectadas naturalmente por Pseudomona fluorescences y Aeromona hydrophila (Mohamed E y Mohamed M, 2008). Es importante señalar que bacterias del género Aeromonas son parte de la microflora intestinal normal de peces (Trust et al., 1974) y que cuadros de enfermedad por Pseudomonas ocurre ante una baja de la inmunidad (Salcido, 1998) como puede ocurrir ante el estrés por el transporte de los peces.

El 5% de muestras de músculo esquelético afectadas por quistes de Microsporidium sp y 5% por granulomas bacterianos difiere del reporte de Palacios et al. (2015), quienes encontraron quistes de Microsporidium sp en la mayoría de individuos tetra neón (P. innesi). Por otro lado, Ferguson (2006) sostiene que la mayoría de los microsporidios con estadios inmaduros parecen producir una leve a nula respuesta inflamatoria y, generalmente, son encontrados como hallazgos incidentales en el trabajo de rutina diagnóstica. La necrosis muscular observada en este estudio pudo estar relacionada con agentes bacterianos o parasitarios, pero también podría haber estado asociada a deficiencias nutricionales (Rajeshkumar y Munuswamy, 2011), ya que estas lesiones fueron leves y escasas, pero presentes en el 95% de las muestras y muchas veces acompañada de leve infiltración de células inflamatorias.

En el intestino, las lesiones como hiperplasia de los enterocitos y de las células productoras de mucus puede estar asociada a un periodo de ayuno prolongado o una situación de estrés (como la captura y traslado), generándose cambios en la permeabilidad intestinal (Farhadi et al., 2003; Lambert, 2003). Asimismo, Magi et al. (2009) demostraron que Pseudomona anguillisepticum causaba hiperplasia de los enterocitos, infiltración de células inflamatorias, necrosis y desprendimiento de la mucosa.

No se disponen de muchos estudios acerca de lesiones en el estómago de peces. Las lesiones encontradas de hiperplasia, desprendimiento y necrosis de células epiteliales, y atrofia podrían estar explicadas por el efecto decontaminantes enelríoAmazonas,elcual tiene altas cargas de materia orgánica y diversos tipos de desechos tóxicos, los cuales pueden afectar la mucosa gástrica, tal y como lo indica Haloi et al. (2013) en un estudio sobre cambios patológicos en el estómago de Chana Punctatus. Por otro lado, la degeneración grasa del hígado está asociada, tanto a dietas ricas en grasas (Reyna, 1993), como a una movilización rápida de las reservas lipídicas por ayunos prolongados (Vigliano et al., 2002).

Con respecto a las lesiones encontradas en el riñón, tales como degeneración hidrópica, edema peritubular y necrosis de los túbulos renales, Fathy et al. (2013), en su estudio en Poecilia reticulata y Gambusia affinis expuestos al bisfenol A (compuesto orgánico empleado en la fabricación de plásticos) indican que este tipo de lesiones están relacionadas a causas no infecciosas.

Granulomas bacterianos similares a los encontrados en el presente estudio en hígado, riñón, músculo esquelético, bazo y peritoneo han sido descritos por Huang et al. (1999) en tilapias infectadas con Staphylococcus epidermidis, demostrando que bacterias del género Staphylococcus producen granulomas de manera sistémica. Asimismo, diversas bacterias del género Mycobacterium inducen enfermedad sistémica crónica con formación de granulomas en órganos de peces (Frerichs, 1989). Las más comunes en peces de acuario y en el medio natural son M. marinum, M. fortuitum y M. chelonae (Roberts, 2001), aunque también pueden encontrase M. abscessus, M. neoaurum, M. scrofulaceum y M. siniae; todas ellas con capacidad de infectar al humano (Rhodes et al., 2001). Verján et al. (2002) reportaron infecciones por Mycobacterium sp con presencia de granulomas en tejidos parenquimatosos y conectivos en siete especies de peces ornamentales (escalar [Ptero-phyllum altum], cardenal [Parachei-rodon axelrodi], disco [Symphysodon aequifas-ciata], betta [Betta splendens], goldfish [Carassius auratus] y gourami [Trichogaster trichopterus]).

CONCLUSIONES

• Se aislaron siete agentes bacterianos en peces ‘tetra bleeding heart’, pertenecientes a los géneros Flavobacterium, Lactobacillus, Pseudomonas, Aeromonas, Bacillus, Stpahylococcus y Escherichia.

• De las 42 muestras con granulomas bacterianos encontrados en peritoneo, riñón, bazo, hígado y músculo esquelético, 22 de ellas fueron positivos a la tinción de Ziehl Neelsen, donde se evidenciaron bacterias bacilares largas acidorresistentes.

• Se identificaron agentes parasitarios como los protozoos Mixosporidium sp en branquias y Microsporodim sp en músculo, así como granulomas parasitarios en peritoneo e hígado.

• Se encontraron diversos hallazgos histopatológicos en branquias, hígado, riñón, bazo, músculo esquelético, peritoneo, intestino delgado y piel.

Agradecimientos

Los autores manifiestan su agradecimiento al Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos por el financiamiento del estudio.

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Recibido: 6 de marzo de 2017

Aceptado para publicación: 15 de octubre de 2017