INTRODUCCIÓN
La familia Bignoniaceae comprende alrededor de 120 géneros y 800 especies distribuidas en regiones tropicales y subtropicales1; entre ellos se tiene el género Tecoma, constituyendo 14 especies de arbustos, crece en toda Latinoamérica2-3. En el Perú, se encuentra distribuida en los departamentos de Ica, Arequipa, Tacna y Moquegua; desarrollándose entre 2000 a 3000
m.s.n.m. En la región Arequipa - Perú, hay tres especies: T. fulva subsp. arequipensis, T. stans y T. sambusifolia; utilizada en medicina tradicional: como agente antimicrobiano para el tratamiento de algunos tipos de cáncer y forraje del ganado4-5.
El extracto etanólico de las flores de T. stans tiene actividad antidiabética, debido a la presencia de los alcaloides tecomina y tecostamina6. La literatura científica reporta, que el género Tecoma contiene compuestos bioactivos, como: saponinas, glicósidos, flavonoides, alcaloides, aceites esenciales, terpenos, fitoesteroles, antraquinonas, taninos, etc.3-4.
El aceite esencial de las hojas de T. smithii Will, obtenido por hidrodestilación presentan actividad antimicrobiana y antioxidante, determinando sus características fisicoquímicas, fueron identificados los metabolitos secundarios por CG/EM1,7,8,9. La especie T. fulva subsp. arequipensis en el Perú, conocida tradicionalmente con el nombre de cahuato o huarango; utilizada en medicina popular para aliviar el dolor estomacal, antiinflamatorio y cicatrización de heridas, además es considerada como planta ornamental, para leña y elaboración de canastas.
El objetivo de la investigación es extraer, separar, purificar e identificar los componentes volátiles orgánicos de T. fulva subsp. arequipensis, obtenidas por dos métodos y su caracterización fitoquímica fue utilizando fundamentalmente técnicas de CG/EM y FTIR, debido a que no existen antecedentes bibliográficos de la especie en estudio.
PARTE EXPERIMENTAL
Recolección y secado de la muestra
Las hojas y flores del T. fulva subsp. arequipensis fue recolectada en el distrito de Sogay, región Arequipa a 2600 m.s.n.m. (16°56’75’’ sur y 71°43’75’’oeste) en los meses de abril y mayo del 2017; la muestra fue secada a temperatura ambiente, 20°C por el lapso de siete días. La clasificación taxonómica del vegetal fue realizada en el herbario de UNSA.
Materiales, reactivos y equipos
Todos los reactivos y solventes fueron de grado analítico, cromatofolios de silicagel 60F254 de las marcas Merck y Acros. Rotaevaporador marca Bucchi modelo R 300, CG/EM; modelo Shimadzu GC-2010, GCROM versión 21000; GC Detector MS serial N° 020524800562 AE ROM VERSIÓN 1,02 Modelo Etapa Dual TMP (Ultra) Fase móvil o gas de arrastre: helio, fase estacionaria: silica fundida 5 % y 95 % de fenildimetil polisiloxano. Columna: [GC- 2010]. Nombre: Rtx-5MS. Espesor: 0,25 μm. Longitud: 30 m. Diámetro interior: 0,25 mm. Temperatura máxima utilizable: 330°C. Inyector: automático.
Refractómetro Abbe. Espectrofotómetro Perkin Elmer Spectrum IR Modelo Frontier versión 10.6.0, en la región del infrarrojo medio comprendida entre 400 y 4000 cm-1. Bomba de vacío de alta presión marca Corning-EEL 852; Vortex marca Labor Muszeripari tipo LE-203.
Para el extracto etanólico se utilizó el CG/EM marca Thermo Scientific TraceTM serie 1300, Pre corrida tiempo: 10,00 minutos tiempo de equilibrio: 0,50 minutos. Inicio de preparación: 0,00 min. Encendido / apagado del horno: Encendido Habilitación criogénica: Apagado Umbral criogénico: 50,0 °C Tiempo de espera criogénico: 60,00 min Temperatura inicial: 100,0 °C Tiempo de retención inicial: 3,00 min Número de rampas: 1 rampa 01 velocidad: 20,0 °C / min Rampa 01 temperatura final: 300,0 °C Rampa 01 tiempo de espera: 20,00 min S
/ SL - Método frontal Modo S / SL: temperatura sin división habilitada: temperatura activada: 220 °C Habilitación de flujo dividido: Encendido Flujo dividido: 50,0 ml/min Tiempo sin división: 1,50 min Flujo de purga: 5,0 ml/min Purga de tabique constante: En modo portador: Flujo constante Habilitación de flujo portador: En portador flujo: 1,000 mL/minutos Compensación de vacío: Activación del ahorrador de gas portador: Flujo del ahorrador de gas portador: 5,0 mL/minuto Tiempo de ahorro de gas portador: 2,00 minutos Activación de retrolavado: Tiempo de inicio de retrolavado: 1,50 minutos Tiempo de ejecución del GC Auxiliar Zonas Método Auxiliar temperatura 1 habilitado: En Auxiliar temperatura 1: 240 °C Auxiliar temperatura 2 habilitada.
Extracción de los componentes volátiles
Los componentes volátiles orgánicos de hojas y flores frescas de T. fulva subsp. arequipensis, fueron extraídos por dos métodos: destilación con arrastre de vapor y por maceración en solventes orgánicos. El método de arrastre de vapor se realizó en un equipo tipo Clevenger, la extracción se realizó por triplicado de masa promedio de 180 g, de dos a tres horas. El destilado obtenido, se extrajo con CH Cl y éter de petróleo, se secó con Na SO4 anhidro 13, para luego identificar los compuestos químicos presentes por CCF. Por maceración se utilizó 25 g de hojas y flores de muestra seca por duplicado con 250 mL de solventes, previamente determinando la humedad residual, por el método gravimétrico; los solventes orgánicos empleados fueron: diclorometano, éter de petróleo y etanol. Durante cinco horas diarias con agitación constante con ayuda de un equipo vortex; macerado por cuatro días. El extracto se filtró en papel Whatman N° 1, se concentró en rotaevaporador13-14.
Caracterización física y separación por CCF
En el aceite esencial obtenido de la muestra fresca, se realizó la caracterización física: densidad por el método del picnómetro, índice de refracción y la solubilidad en solventes orgánicos, siendo separados sus componentes por CCF en cromatofolios de silicagel, como fase móvil se utilizó acetato de etilo - tolueno (7:93), como agente revelador fue empleado solución de vainillina - H2SO4, se comparó las moléculas orgánicas presentes en el aceite esencial, del vegetal en estudio con los estándares: α -terpineno, p-cimeno, pineno terpinen- 4-ol, borneol, timol, mentona y mentol15.
Identificación y cuantificación de los extractos orgánicos por CG/EM
Para la identificación de los componentes volátiles de los extractos orgánicos por maceración se concentró en rotaevaporador; con los concentrados orgánicos de hojas y flores obtenidos por separado se masó 0,5 g de muestra, aforando en fiola de 10 mL con hexano grado GC. Se depositó en el sonicador por 45 minutos. Filtro el extracto con filtro de jeringa 0,22 µm y colocar directo en el vial de lectura. Para ser analizados en las mismas condiciones por CG/ EM, cada uno de los extractos.
Purificación del extracto etanólico por CC y análisis por CG/EM
El fraccionamiento del extracto etanólico de las hojas y flores secas del T. fulva subsp. arequipensis se realizó por cromatografía en columna (CC) abierta, usando como fase estacionaria silicagel G-200, como fase móvil hexano-acetato de etilo, en diferentes proporciones (9:1; 8:2); fueron separadas las fracciones 1, 3 y 4, concentradas en rotaevaporador para luego determinar e identificar los componentes presentes por CG/EM. Las condiciones de análisis en 200 μL de cada fracción fueron cargados en sendos insertos para cada vial del autoinyector, la aguja es lavada con una mezcla de metanol-acetato de etilo, antes y después de cada inyección alrededor de 10 veces en total, se carga la jeringa para ser inyectada cuidadosamente, en el equipo Thermo Scientific TraceTM serie 1300 CG/EM.
El equipo GC se encuentra a una temperatura inicial de 60ºC en el horno, para operar en split, 1/50; reteniendo ese valor por 3 minutos luego se inicia una rampa de 20 Grd/min. hasta 300ºC en el horno de 10 a 15 min, para limpiar la columna capilar. El inyector del GC se estableció a 220 ºC, y la línea de transferencia del GC al MS a 240ºC. La fuente de iones está a 200ºC y se opera a 70 eV, barriendo de los 40 a los 50Da. El gas carrier es helio de alta pureza, el mismo que se encuentra presente dentro del EM, la columna capilar es una OV-5, para EM, de fase químicamente unida y entrelazada al capilar de la misma.
Estos ensayos se realizaron en el Instituto de Investigaciones en Tecnología Química (INTEQUI) de la Universidad Nacional de San Luis Argentina.
Análisis por Espectroscopia FT-IR
Las hojas y flores secas de T. fulva subps. arequipensis fueron maceradas en diclorometano por el lapso de tres días con agitación constante, se filtró a vacío haciendo uso de papel filtro Whatman N° 1, el extracto obtenido se concentró en rotaevaporador hasta polvo seco, la muestra se re disolvió en diclorometano; el análisis espectroscópico se realizó utilizando FT- IR, en porcentaje de transmitancia que fue útil para detectar los picos característicos y los grupos funcionales presentes en los extractos purificados, los mismos que fueron registrados e interpretados con tablas espectroscópicas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El rendimiento del aceite esencial por arrastre con vapor de agua de hojas y flores frescas de T. fulva subsp. arequipensis, fue de 0,40 %, de aspecto resinoso de color blanco, siendo inestable y soluble en agua luego de la extracción; por lo que no se aplicó la técnica de GC/ EM, de densidad 0,85 g/mL e índice de refracción 1,464 a 20°C, soluble en etanol absoluto, éter de petróleo y diclorometano.
Para el vegetal con 13 % de humedad residual, se utilizó el método de maceración en solventes orgánicos por cuatro días y concentrado en rotaevaporador, se obtuvieron los siguientes rendimientos: extracto en diclorometano 5,4 %; extracto en éter de petróleo 5,0 % y el extracto en etanol al 98 % fue de 6,2 %15.
Por CCF de los componentes volátiles de T. fulva subsp. arequipensis, al ser soluble en agua la resina obtenida se extrajeron los componentes orgánicos en diclorometano y éter de petróleo, de forma cualitativa se pudo identificar, cuatro probables estructuras orgánicas terpenicas, el terpinen-4-ol, p-cimeno, mentona y α- pineno (figuras 1 y 2). Los resultados indican que las estructura presentan el factor de retención (RF) similares a los estándares.
Donde:
M1: extracto en diclorometano de hojas. M2: extracto en diclorometano de flores.
Estándares cromatográficos:
α-terpineno (αT), borneol (B), p-cimeno (PC), α-pineno (αP), timol (T), terpinen 4-ol (T-ol), mentona (M-CO) mentol (M)
Donde:
M3: Extracto en éter de petróleo de T. fulva subsp. arequipensis hojas. M4: extracto en éter de petróleo de T. fulva subsp. arequipensis flores. Estándares cromatográficos:
α-terpineno (αT), borneol (B), p-cimeno (PC), α-pineno (αP), timol (T), terpinen 4-ol (T-ol), mentona (M-CO), mentol (M).
Analizando las figuras 1 y 2, se observa que hay presencia de moléculas terpénicas, siendo ello coincidente con estudios realizados en aceites esenciales de otras especies vegetales reportando estructuras terpénicas y terpenoides16-17.
Por la CG/EM del extracto en diclorometano de las hojas fueron identificados 11 compuestos orgánicos (tabla 1 y figura 3), correspondiendo a ocho estructuras de naturaleza terpénica, como el 4-terpineol con 37,45 % de abundancia (tabla 1, figura 3)
N° | Compuestos químicos | Porcentaje % |
---|---|---|
1 | oct-1-en-3-ol | 1,42 |
2 | terpinen-4-ol | 37,45 |
3 | 2-metilbutanoato de cis hex-3-enil | 1,47 |
4 | 3,7-dimetilocta-2,6-dieno | 1,95 |
5 | (1-prop-1-enil)-2-metoxifenol | 13,14 |
6 | octahidropentalen-1-ol | 10,28 |
7 | mentol | 5,15 |
8 | 2,5-diciclopropilpenta-2-en-4-ino | 3,09 |
9 | (10Z)-pentadec-10-en-1-ol | 8,67 |
10 | germacreno | 1,44 |
11 | α-pineno | 7,22 |
En el extracto etéreo de flores se detectó la presencia de 18 compuestos orgánicos, correspondiendo a 13 estructuras de naturaleza terpénica, siendo el compuesto mayoritario fitol con 16,38 % de abundancia (tabla 2, figura 4).
N° | Compuestos químicos | Porcentaje % |
---|---|---|
1 | 2-propilpenten-1-ol | 5,0 |
2 | 3,7-dimetilocta-1,6-dien-3-ol | 2,97 |
3 | nonanal | 3,16 |
4 | 4,5-dimetilundec-2-eno | 2,88 |
5 | 1(3-metilbutil)ciclopenteno | 4,74 |
6 | 2,6,10-trimetildodecano | 4,30 |
7 | 2,6,11-trimetildodecano | 4,14 |
8 | pentadecano | 2,99 |
9 | (3E)pentadec-3-en-2-ol | 2,97 |
10 | pentadecanal | 10,48 |
11 | decan-2-ona | 7,25 |
12 | 3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-en-1-ol | 6,01 |
13 | (2Z,5Z)pentadeca-2,5-dien-1-ol | 5,52 |
14 | decano | 6,69 |
15 | dodecanoato de-1-metiletilo | 3,06 |
16 | 2-metilpentadecano | 4,31 |
17 | fitol | 16,38 |
18 | 2,7,10-trimetildodecano | 3,05 |
El estudio fitoquímico de otras especies del género, como T. smithii, el aceite esencial de hojas frescas presentó 23 constituyentes químicos siendo el fitol el compuesto mayoritario (Kamilia et al. 2016); el extracto etanólico del T. stans se detectó la presencia de 17 constituyentes químicos, siendo estructuras terpénicas con marcada actividad biológica2, 18.
Del fraccionamiento por cromatografía en columna y CG/EM; en la fracción 1 obtenida del extracto etanólico de las hojas de T. fulva subsp. arequipensis fueron detectados la presencia de 33 constituyentes orgánicos, el esteroide γ-sitosterol, de fórmula molecular C29H50O y peso molecular 414 g/mol; fue el de mayor abundancia: (50,1 %), el espectro de masas puede ser observado en la figura 5. En la fracción 3 se detectaron la presencia de 33 componentes químicos siendo el ácido hexadecanoico con 52,2 % de mayor abundancia, de fórmula molecular C16H32O2 y peso molecular 256 g/mol, cuyo espectro de masas presentamos en la figura 7. En la fracción 4 se identificaron la presencia de 33 componentes químicos, siendo el 1,3-dihidro-3,3-dimetil-2H-indol-2-ona con 36,1 % el de mayor abundancia, de fórmula molecular C10H11NO y peso molecular 161 g/mol lo que se observa en la figura 8.
En la figura 6 se observa que a partir de la formación del ión molecular 414 m/z, se genera la fragmentación típica del γ-sitosterol con una insaturación Δ5, los fragmentos 329 m/z y 303 m/z, además de la pérdida de metilos, el -OH de la posición C-3 y carbonos de la cadena lateral; a través de pérdidas consecutivas de etino (C H )19.
La identificación de los componentes químicos en las fracciones fue realizada por comparación con la base de datos de los espectros de masas de la biblioteca científica. Mass Spectral Libraries (NIST 17 and Wiley Libraries) 2014.
Los resultados de los espectros FTIR, los picos detectados y las funciones orgánicas correspondientes al extracto de diclorometano de flores se muestran en la figura 9 y tabla 3 y de las hojas se muestran en la figura 10 y tabla 4 de T. fulva subsp. arequipensis.
N° pico | ΰ cm-1 | Vibración del grupo funcional | Función orgánica |
---|---|---|---|
A | 3500 | O-H, N-H | alcoholes, fenoles, ácidos y aminas |
B | 2923 | C-H | hidrocarburos saturados: alcanos |
C | 2853 | C-H | alcanos |
D | 1709 | C=O | cetonas α,β insaturadas, ácidos, ésteres |
E | 1463 | -CH2- | metilenos de alcanos |
F | 1377 | -CH3 | metilos de alcanos |
G | 1290-1034 | C-C, C-O, C-N | huella dactilar: alcanos, éteres, aminas |
N° pico | ΰ cm-1 | Vibración del grupo funcional | Función orgánica |
---|---|---|---|
A | 3427 | O-H, N-H | alcoholes, fenoles, ácidos y aminas |
B | 2925 | C-H | hidrocarburos saturados: alcanos |
C | 2855 | C-H | alcanos |
D | 1699 | C=O | cetonas α,β insaturadas, ácidos, ésteres |
E | 1638 | C=C | hidrocarburo insaturado: alquenos |
F | 1514 | C=C | hidrocarburo aromático |
G | 1459 | -CH2- | metilenos de alcanos |
H | 1376 | -CH3 | metilos de alcanos |
I | I 1298-913 | C-C, C-O, C-N | huella dactilar: alcanos, éteres, aminas |
La detección de los constituyentes químicos de los extractos en diclorometano de hojas y flores del T. fulva subsp. arequipensis, verificada por la técnica de FTIR, se encontró grupos funcionales característicos como: fenoles solamente en hojas, cuyas bandas de absorción son 1638 y 1514 cm-1, mientras en las flores se encuentran alcoholes secundarios, en ambos extractos se encuentra el grupo carbonilo especialmente de cetonas α, β insaturadas, ácidos carboxílicos y ésteres, entre las bandas de absorción de 1699 y 1709 cm-1, en las bandas de absorción 3427 y 3500 cm-1 se detecta la presencia del grupo hidroxilo y amino; las estructuras orgánicas detectadas también se confirman con el análisis de los espectros obtenidos por GC-MS10-12.
CONCLUSIONES
Por extracción y caracterización física en la T. fulva subsp. arequipensisse se comprobó la presencia de componentes orgánicos volátiles solubles en solventes de baja polaridad.
Por cromatografía CG/EM, del extracto diclorometanico y etéreo se identificó terpenos y terpenoides.
Por cromatografía en columna y CG/EM del extracto etanólico de hojas en la fracción 1, se identificó γ-sitosterol, en la fracción 3 se identificó ácido hexadecanoico y en la fracción 4 se identificó 1,3-dihidro-3,3-dimetil-2H-indol-2-ona, siendo los componentes orgánicos de mayor abundancia en cada fracción.
En los espectros de FTIR de los extractos del T. fulva subsp. arequipensis, se confirma la presencia de alcoholes, compuestos carbonilicos, hidrocarburos aromáticos, fenoles y aminas.