Artículos primarios

Detección hematológica de Anaplasma phagocytophilum en caballos de la provincia de Chiclayo, Perú

Hematological detection of Anaplasma phagocytophilum in horses in the province of Chiclayo, Peru

 

Deysi Masgo C.¹, Luis Hoyos S.^1,3, Olga Li E.¹, Luis Gómez P.², Leyla Ramires V.¹, Grecia Álvarez M.¹, Miguel Cervantes S.¹, Álvaro Vásquez Y.¹

¹ Laboratorio de Patología Clínica Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

² Laboratorio de Epidemiología y Economía Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

³ E-mail: luis.hoyos@unmsm.edu.pe

 

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RESUMEN

El objetivo del estudio fue detectar Anaplasma phagocytophilum en caballos de la provincia de Chiclayo, Perú, utilizando técnicas hematológicas. Se colectaron 100 muestras de sangre de caballos aparentemente sanos y con antecedentes de exposición a garrapatas. El estudio hematológico consistió en la realización del hemograma y la evaluación de frotis sanguíneos teñidos con Wright y naranja de acridina para la búsqueda de cuerpos de inclusión y mórulas del agente patógeno. El 9% de caballos (9/100) presentaron estructuras compatibles con cuerpos de inclusión o mórulas de A. phagocytophilum, por lo que fueron considerados como «positivos». Este grupo de animales presentó leves alteraciones en la serie leucocítica y trombocítica. Los hallazgos indican la presencia de A. phagocytophilum en caballos en el Perú.

Palabras clave: Anaplasma phagocytophilum; caballos; técnicas hematológicas

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ABSTRACT

The aim of this study was to detect Anaplasma phagocytophilum in horses from the province of Chiclayo, Peru, using haematological techniques. One hundred blood samples were collected from apparently healthy horses with a history of exposure to ticks. The haematological study consisted of blood count and the evaluation of blood smears stained with Wright and acridine orange to search for inclusion bodies and morulae of the pathogen. Results showed that 9% of horses (9/100) presented structures compatible with inclusion bodies or morulae of A. phagocytophilum, so they were considered as «positive». This group of animals presented slight alterations in the leukocytic and thrombocytic series. The findings indicate the presence of A. phagocytophilum in horses in Peru.

Key words: Anaplasma phagocytophilum; horses; hematological techniques

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INTRODUCCIÓN

Anaplasma phagocytophilum es una bacteria gram negativa intracelular obligatoria que infecta granulocitos, principalmente neutrófilos, en cuyos citoplasmas forma una «microcolonia» denominada «mórula» (Woldehiwet, 2010). Es capaz de infectar a un gran número de mamíferos; sin embargo, la enfermedad clínica solo ha sido documentada en perros, ovejas, cabras, caballos, gatos y humanos, entre otros (Diniz y Breitschwerdt, 2011), denominándose anaplasmosis granulocítica.

La transmisión de la enfermedad se produce principalmente por la mordedura de una garrapata infectada del género Ixodes a un individuo susceptible (Pusterla y Madigan, 2014). La distribución de la enfermedad está asociada a la presencia de la garrapata vector, la cual se encuentra distribuida principalmente en el hemisferio norte. En el Perú ha sido reportada en el departamento de Amazonas (Macedo et al., 1994), y en el departamento de Piura (Glenny et al., 2004) infestando animales domésticos y silvestres.

Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC), la Anaplasmosis Granulocítica Humana (AGH) es una enfermedad infecciosa de carácter zoonótico cuyos reportes se han ido incrementando anualmente. De 348 casos en 2000 a 4151 casos en 2016, con una tasa de letalidad estimada inferior al 1%.Así mismo, tiene una presentación clínica inespecífica, siendo el síntoma más común la fiebre, seguido por dolor de cabeza, dolor muscular, malestar general, resfrío, náuseas, dolor abdominal y tos (CDC, 2018).

La Anaplasmosis Granulocítica Equina (AGE) fue reportada por primera vez en caballos al norte de California en 1960, habiéndose diseminado dentro de Estados Unidos, Canadá y Europa (Pusterla y Madigan, 2014) y en países de Sudamérica como Chile (Conejeros, 2012), Brasil (Farias et al., 2015) y Venezuela (Arraga et al., 1992; Castellanos et al., 2010). La presentación de la enfermedad está en función a la edad de los caballos, siendo más afectados los de mayor edad (Pusterla y Madigan, 2015); sin embargo, la enfermedad es autolimitante, habiéndose reportado caballos infectados asintomáticos (Madigan, 1993).

El diagnóstico se basa en la anamnesis, presentación de signos clínicos y evaluación hematológica en primera instancia. La técnica hematológica consiste en la realización del hemograma y la evaluación del frotis sanguíneo para la búsqueda de cuerpos de inclusión o mórulas en el citoplasma de neutrófilos y eosinófilos (Gribble, 1969). La mórula puede ser evidenciada entre menos del 1% hasta en 20-30% de los neutrófilos durante los primeros días de la infección (fase aguda) (Madigan y Pusterla, 2000); sin embargo existen reportes de la permanencia de la bacteria en circulación periférica en caballos meses después de su recuperación clínica. La sensibilidad y especificidad de la técnica es limitada, por ello es necesario el uso de técnicas confirmatorias como el PCR, técnica altamente sensible y específica; sin embargo, el Gold Standard es la prueba serológica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) (CDC, 2018).

En el Perú, los caballos cumplen un rol cultural (Caballo Peruano de Paso), social (policía), deportivo (caballos de carrera), interactivo (caballos de paseo), e incluso terapéutico (equinoterapia), que hace estrecha su relación con el hombre favoreciendo la transmisión de enfermedades zoonóticas. La detección hematológica de A. phagocytophilum es, por lo tanto, de importancia para la salud pública. El diagnóstico temprano de la enfermedad es crucial para la aplicación de un correcto tratamiento y recuperación del paciente, ya que la mortalidad está altamente relacionada con el tiempo de evolución de la enfermedad, tanto en humanos como en caballos.

MATERIALES Y MÉTODOS

La colección de muestras se realizó en la provincia de Chiclayo, departamento de Lambayeque, ubicada en la costa norte del Perú, que presenta un clima subtropical con temperaturas promedio de 15.4-28.8 °C (SENAMHI, 2019).

Se colectaron 100 muestras de sangre (3 ml) en tubos comerciales con EDTA de caballos de cuatro haras en marzo de 2015. Para el muestreo se consideró la totalidad de animales de cada establecimiento, sin distinción de sexo, edad o raza. Los animales se encontraban aparentemente sanos el día de la toma de muestra, y todos tenían antecedentes de exposición a garrapatas.

El procesamiento de muestras para los recuentos hematológicos se llevó a cabo en el Centro Veterinario «Más que Patas» de la ciudad de Chiclayo, la evaluación de los frotis sanguíneos teñidos con Wright en el Laboratorio de Patología Clínica Veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria (FMV) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) y la evaluación de los frotis teñidos con naranja de acridina en el Laboratorio de Epidemiología y Economía Veterinaria de la FMV-UNMSM, estos últimos ubicados en la ciudad de Lima.

Se determinó la serie eritrocítica (hematocrito [%], hemoglobina [g/dl], recuento total de glóbulos rojos [x10⁶/µl]), la serie leucocítica (recuento total de leucocitos [x10³/µl], recuento diferencial relativo y absoluto), y la serie trombocítica (recuento total de plaquetas), de acuerdo a lo establecido por Benjamin (1991). Además, se observaron los frotices sanguíneos teñidos con Wright y naranja de acridina (Gribble, 1969) para la búsqueda de cuerpos de inclusión y mórulas (Uehlinger et al., 2011).

Para la visualización de los frotis sanguíneos teñidos con Wright se utilizó el microscopio de inmersión Leica DM 500 con objetivo de 100X para determinar el porcentaje de células circulantes con cuerpos de inclusión (CI) y mórulas y, a su vez, el número promedio de CI y mórulas/células. Este procedimiento se realizó identificando al menos 200 células (entre neutrófilos y eosinófilos) (Franzén et al., 2009) y se repitió 10 veces por cada frotis de sangre. La búsqueda de cuerpos de inclusión o mórulas se realizó tanto en la monocapa como en la cola de los frotis sanguíneos.

En el caso de CI y mórulas compatibles con A. phagocytophilum se utilizó la tinción naranja de acridina (Forbes, 2009). Los frotis fueron examinados en la monocapa y cola y por lo menos 200 células (entre neutrófilos y eosinófilos) fueron evaluadas, siguiendo el mismo procedimiento indicado para la tinción Wright, pero utilizando el microscopio de fluorescencia ZEISS Axioskop 40 con objetivos de 40x y100x a una longitud de onda de excitación de 450-490 nm y de emisión de 515 nm.

RESULTADOS

El 9% de los caballos (9/100) evidenciaron estructuras compatibles con cuerpos de inclusión y mórulas de Anaplasma phagocytophilum en frotis de sangre periférica teñidos con Wright (Figura 1) y naranja de acridina (Figura 2), siendo considerados positivos al patógeno. Los resultados de las variables hematológicas de los nueve animales positivos, así como los valores referenciales se muestran en el Cuadro 1.

El Cuadro 2, muestra la distribución de los animales «positivos» según la presencia o no de trombocitopenia, así como la media del conteo de plaquetas en cada grupo.

DISCUSIÓN

La evaluación hematológica para la detección de Anaplasma phagocytophilum en caballos evidenció 9% de animales con estructuras compatibles con cuerpos de inclusión o mórulas de Anaplasma phagocytophilum en el citoplasma de neutrófilos (Cuadro 1). Las estructuras visualizadas con la tinción Wright fueron cuerpos de inclusión, similares a las encontradas por Arraga et al. (1992), a los que denominó «cuerpos elemenel citoplasma, compatibles con cuerpos de tales o iniciales».Algosimilar reportó Gribble inclusión o mórulas de Anaplasma (1969) quién observó inclusiones individuales phagocytophilum. Se evidencia, además, un a las que denominó «inclusiones tempranas linfocito normal (flecha negra). Tinción Na-pequeñas». Estas estructuras podrían corresranja de Acridina. 40X ponder a la fase de internalización de la bacteria antes de la replicación (Troese y Carlyon, 2009). Sin embargo, las estructuras fluorescentes visualizadas con la tinción naranja de acridina corresponderían a mórulas, debido a su forma y distribución en el citoplasma de los neutrófilos.

Cabe mencionar que los animales evaluados se encontraban aparentemente sanos el día de la toma de muestra, lo cual coincide con lo referido por Castellanos et al. (2010) quienes reportaron el hallazgo de estructuras compatibles con A. phagocytophylum en el frotis sanguíneo de 32.9% de caballos asintomáticos provenientes de dos hatos del estado Apure, Venezuela.

La evaluación hematológica de los caballos «positivos» (Cuadro 2) mostraron leve leucocitosis, lo cual estuvo relacionada a un aumento en el valor absoluto de neutrófilos, lo cual podría darse como respuesta al estrés durante la toma de muestra (leucocitosis fisiológica). A su vez, se evidenció moderada linfopenia en algunos y linfocitosis en otros; hallazgos que concuerdan con Franzén et al. (2005).

Si bien la principal alteración hematológica de la infección con A. phagocytophilum es la trombocitopenia (Pusterla et al., 2000), solo el 56% de los animales «positivos» presentaron trombocitopenia (6/9), lo cual difiere con otros estudios (Franzén et al., 2005, 2009) donde se evidenció trombocitopenias en todos los animales infectados. No hay reportes de alteraciones en el conteo de plaquetas en animales infectados asintómáticos; sin embargo, Franzén (2008) demostró la persistencia de la bacteria en la sangre detectada por PCR de sangre periférica hasta por tres meses después la recuperación clínica de caballos infectados experimentalmente.

En los animales «positivos» (9/100) se evidenciaron estructuras compatibles con cuerpos de inclusión o mórulas en un rango de 0.5 a 3% de neutrófilos (es decir, de 1 a 6 por cada 200 neutrófilos). Franzén et al. (2005) encontraron entre 0.5 y 16% de neutrófilos infectados, en tanto que Madigan y Pusterla (2000) refirieron que el porcentaje de neutrófilos con inclusiones varía en todo momento y entre caballos, presentándose entre menos de 1% y hasta en 20 y 30% de neutrófilos. Gribble (1969) evidenció el porcentaje más alto de infección (73%) utilizando las tinciones giemsa y naranja de acridina.

Los animales en este estudio se encontraron aparentemente sanos el día de la toma de muestra, de allí que no cursaban la fase aguda de la enfermedad. Esto indica tres posibilidades: la primera, que los caballos hayan cursado con picos de fiebre por periodos cortos que pasaron desapercibidos por los criadores, coincidiendo con Franzén et al. (2005), quienes evidenciaron cuerpos de inclusión 2.6 días después del inicio de la fiebre, siendo por ello que el número de neutrófilos infectados fue bajo dado que el muestreo se realizó al inicio de la aparición de las inclusiones. La segunda es que haya un mecanismo de adaptación de los caballos de la zona con el agente, como lo ocurrido en áreas endémicas, donde la infección subclínica con A. phagocytophilum es común, y los caballos desarrollan anticuerpos contra este agente sin haber presentado signos clínicos (Madigan, 1993). Y la tercera posibilidad es que ocurra algo parecido a lo evidenciado en ovejas con infección persistente, las cuales tras la recuperación de la enfermedad clínica, no manifiestan signos clínicos, pero hay evidencia de la bacteria en sangre periférica (Stuen et al., 2001).

CONCLUSIONES

• El presente estudio constituye el primer reporte de detección hematológica Anaplasma phagocytophilum en caballos en el Perú, lo que evidencia la exposición al agente zoonótico. Por lo tanto, la anaplasmosis granulocítica debería considerarse en la lista de diagnósticos diferenciales de enfermedades febriles, tanto en humanos como en caballos.

• La presentación de la enfermedad sería de tipo subclínico, dado que los animales se encontraron aparentemente sanos.

LITERATURA CITADA

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Recibido: 13 de enero de 2019

Aceptado para publicación: 21 de octubre de 2019.