INTRODUCCIÓN
Las áreas urbanas, suburbanas y cerca de cultivos están ligadas a la proliferación de zancudos, considerados como vectores de enfermedades y causante de laceraciones en la piel (Cachago y Ligña, 2018). A. aegypti es una especie antropofílica. El mosquito Anopheles se adapta a todo tipo de climas y se le encuentra en la región de Tumbes, Perú (Castro, 2015; Alemán et al., 2016). En los arrozales de la zona se encuentra Aedes spp, Anopheles spp y Culex spp (Chin, 2001; Duong et al., 2017). Las hembras del mosquito Anopheles pueden vivir hasta un mes (Astaiza et al., 1988). Su presencia está ligada a su ciclo de vida, ya que se mueven solo dentro de unos metros de distancia de su lugar de cría original (Morán, 2018). Los mosquitos antropofílicos localizan a sus presas mediante el calor corporal y el dióxido de carbono emanado por ellos (Olaya y Méndez, 2003).
Los cerdos presentan la misma susceptibilidad que el humano ante la picadura de estos insectos (Barcomes, 2010), pudiendo causar pérdidas económicas a los productores por mermas en la producción e incluso muerte de lechones (Vargas, 1998; Morgan, 2012). Así mismo, el virus de la encefalitis japonesa B (E J) se transmite entre las aves, cerdos y humanos (Chin, 2001; Duong et al., 2017), causando pérdidas debidas a camadas anormales (Martínez y Juanes, 2006).
Los repelentes de insectos se utilizan para evitar el acercamiento de insectos a la piel (Lorrén et al., 2015). Algunas sustancias naturales o sintéticas poseen esta acción y son llamadas repelentes, aunque estas no matan (Egunyomi et al., 2010; Roldán et al., 2015). El ácido láctico y el dióxido de carbono, presente en el sudor de animales de sangre caliente, son sustancias atractivas para los mosquitos y es detectado por el receptor olfativo de las antenas que contienen los quimiorreceptores (Naseem et al., 2016). Los repelentes perturban la capacidad de los receptores en las antenas de los mosquitos para responder a la sede de estímulos (Olaya y Méndez, 2003).
Al aplicar el repelente, los solventes se evaporan, dejando el ingrediente activo sobre la piel (Castro-Gutiérrez y Diaz-Madrigal, 1998). La tendencia actual en en el uso de insecticidas y repelentes es hacia los productos de origen natural al considerarlos menos contaminantes, además de ser de fácil elaboración (Escalante et al., 2004; Hurtado et al., 2016). El repelente más usado para mosquitos en humanos y animales es el N, N-dietil-3-metilbenzamida (DEET), de gran efectividad, pero con residuos tóxicos (Morales, 2019), por lo que se investigan repelentes de origen vegetal para su reemplazo (Olaya y Méndez, 2003).
La planta de neem (Azadirachta indica A. Juss) tiene propiedades insecticidas, controla plagas de campo y almacén, y tiene uso medicinal, forestal y farmacológico (Novo et al., 1997; Celis et al., 2009; Fernández et al., 2009; Delgado et al., 2012; García, 2018). El azadiractin es el principio activo del neem, estructuralmente similar a la hormona ecdisona (hormona de la muda) de los insectos (Romero y Vargas, 2005; Fernández et al., 2009), y no presenta efectos secundarios y sus propiedades anti-inflamatorias son un buen complemento como repelente natural (Alemán et al., 2016).
Mayormente el neem se utiliza como extracto oleoso, el cual contiene la azadirachtina, compuesto muy conocido por su acción biológica (Vega-Jarquín, 2016). La proporción de este compuesto en el aceite de neem varía dependiendo del método de extracción y de la calidad de las semillas. La extracción con hexano resulta en el 35-44% de aceite (Antón et al., 2016). El objetivo del presente estudio fue evaluar la eficacia repelente para zancudos de tres dosis de aceite de neem en cerdos, obtenidos bajo condiciones de campo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar del Estudio
El estudio se llevó a cabo en la Facultad de Ciencias Agrarias (FCA) de la Universidad Nacional de Tumbes - UNT (Tumbes, Perú), adyacente a una zona arrocera, considerada como una zona de considerable proliferación de zancudos.
Aceite de Semilla de Neem
La semilla de neem (Azadirachta indica A. Juss) fue obtenida en la FCA-UNT. Se dejó secar por 15 días al medio ambiente, se separó la semilla de la cáscara (2 kg) y se realizó la molienda con un molino casero de tornillo sin fin. La extracción del aceite se realizó utilizando un equipo soxhlet empleando como solvente hexano (temperatura entre 80 y 90 °C) (Tesfaye y Tefera, 2017; Shooshtari et al., 2013; Cárdenas, 2017). El rendimiento se calculó según fórmula del extracto oleoso: EE = peso del aceite / peso de la muestra inicial (Esparza-Díaz et al., 2010).
Repelente
El repelente fue preparado siguiendo la metodología de Olaya y Méndez (2003), para lo cual se mezcló 1, 2% o 3% del aceite de neem con 30% de glicerina, agregando alcohol etílico (96%) hasta llegar al 100% (T1: 130-69; T2: 2-30-68; T3: 3-30-67).
Animales e Instalaciones
Se adquirieron 40 lechones en una granja de crianza semi-intensiva del caserío El Limón (Tumbes, Perú), con peso vivo entre 10 y 20 kg. Los animales se encontraban aparentemente saludables, libres de parásitos y de deformaciones congénitas.
Los lechones fueron estabulados en corrales con techo de eternit y con separaciones de malla metálica. Se utilizaron cuatro jaulas internas protegidas contra zancudos, de 4.5 m2 de área (de 3x1.5x1m) por tratamiento, que se encontraban dentro de corrales con techo de eternit y con separaciones de malla metálica. Las cuales fueron desinfectadas y fumigadas antes del inicio del experimento. Se colocaron 10 animales por jaula. Además, se utilizaron cuatro jaulas de malla metálica, sin protección para zancudos, ubicadas al exterior de los corrales, con un área de 1 m2 y una altura de 0.5 m. Se colocó un animal por jaula.
Evaluación de los lechones
Los lechones fueron escogidos de camadas similares, y se distribuyeron en cuatro grupos, de acuerdo con su peso vivo: grupo 1, 10.0-11.9 kg; grupo 2: 12.0-13.9 kg; grupo 3: 14.0-15.9 kg; grupo 4: >16 kg a más. Para formar tratamientos homogéneos, se seleccionó un lechón de cada grupo formando cuatro tratamientos (10 lechones por tratamiento colocados en una jaula interna).
Los lechones se lavaron con un jabón sin fragancia y agua fría el día previo al inicio de la prueba. Esta se realizó desde las 06:00 hasta las 08:45, periodo de mayor actividad de picadura de los zancudos en el área de estudio.
Para la prueba de repelencia en campo, cada día se escogió un lechón diferente entre los 10 de cada tratamiento y se les llevó a las jaulas externas (cuatro jaulas individuales, una por tratamiento) para ser expuestos a las picaduras de los zancudos. Las jaulas estaban distantes entre sí por 4 m. La posición de los lechones en las jaulas externas fue rotada aleatoriamente en cada día de evaluación. Se utilizaron los métodos de ensayo disponibles y modificados para animales por la Organización Mundial de la Salud para cuantificar la protección y la duración del efecto de formulaciones repelentes en campo (WHO, 2009).
A cada uno de los lechones en las jaulas externas se pulverizó 50 ml del repelente correspondiente al grupo experimental. El repelente fue aplicado sobre toda la superficie corporal del lechón. El grupo control (T0) no recibió aplicación alguna (Santamaría et al., 2012).
El experimento de repelencia se realizó durante 14 días en un periodo de 5 semanas (tres días consecutivos por semana - jueves, viernes y sábado) (Santamaría et al., 2012). En cada día se evaluó el efecto repelente por cuatro veces (06:15, 07:00. 07:45, 08:30) con una duración de 15 minutos por cada evaluación. Los lechones tuvieron 30 minutos de descanso y protección entre evaluaciones, donde fue retirado de la jaula externa y devuelto a la jaula interna protegida. Los zancudos que picaron a los lechones fueron recolectados con cuatro aspiradores manuales a batería (uno por cada tratamiento) y llevados al laboratorio para el conteo respectivo; adicionalmente se tomó fotografías de los zancudos al momento en que picaban a los lechones, considerando como picadura al zancudo con abdomen dilatado de color rojo (Santamaría et al., 2012).
Parámetros de Repelencia
El efecto repelente fue evaluado mediante los siguientes parámetros:
-Porcentaje de repelencia (PRp). Se estimó según la fórmula indicada por Olaya y Méndez 2003): %PRp = [(Ncp -Ntp) / (Ncp + Ntp)] x 100%, donde %PRp es el porcentaje de repelencia, Ncp es el número de mosquitos que picaron a los lechones a los que no se les aplicó el repelente, Ntp es el número de mosquitos que picaron a los lechones a los que sí se les aplicó el repelente.
-Porcentaje de protección (PP) o de eficiencia del repelente. Se determinó mediante el cálculo del número de mosquitos que pican a lechones con tratamiento comparado con el que no tiene tratamiento (Thorsell et al., 1989; WHO, 2009): PP = [(Nc - Nt)/Nc] x 100, donde Nc = número de picaduras en el lechón testigo en determinado periodo de tiempo, Nt = número de picaduras en el lechón tratado en el mismo periodo
-Número de picaduras/día. Se midió por conteo directo de las ronchas dejadas por los zancudos en la piel de los lechones
-Índice de repelencia (IR). Se utilizó la fórmula adaptada por Sanabria y Ramírez (2013): IR = 2G/(G + P), donde IR es el índice de repelencia, G es el porcentaje de zancudos en los lechones a los que se les aplicó el repelente, P es el porcentaje de zancudos en los lechones en los que no se aplicó el repelente. Para la interpretación del IR se consideró que para el IR = 1 el repelente no tuvo efecto; IR > 1 el repelente atrajo a los zancudos; IR < 1 el tratamiento repelió a los zancudos.
-Porcentaje de reducción de repelencia en función al tiempo de aplicación. Se determinó según la fórmula descrita por Santamaría et al. (2012), WHO (2009) y Thorsell et al. (1989): % de reducción de repelencia = 100[1-(Nt / Nc)], donde Nc es el número de picaduras en el lechón testigo en un determinado periodo de tiempo, Nt es el número de picaduras en el lechón tratado en el mismo periodo de tiempo (3 horas en cuatro intervalos: entre 15 y 30, 60 y 76, 95 y 120, 150 y 175 minutos).
Los resultados fueron analizados mediante análisis de varianza y la prueba de Duncan. La significancia estadística se fijó en p<0.05.
RESULTADOS
La extracción de aceite de neen mediante el método soxhlet fue de 43.25 ± 1.28%; rendimiento semejante al 40% reportado por Pérez et al. (2009).
El porcentaje de repelencia fue superior en el tratamiento T3 (88.74 ± 6.15%), seguido del T2 con 75.66 ± 11.08% y T1 con 52.27 ± 12.83%, encontrándose diferencias significativas (p<0.05) entre grupos (Figura 1a). El porcentaje de protección (PP) o de eficiencia del repelente fue igualmente superior en T3 (93.92 ± 11.19%), seguido del T2 con 85.71 ± 7.54% y T1 con 67.78 ± 3.66%, observándose diferencias significativas (p<0.05) entre grupos (Figura 1b).
El número promedio de picaduras de zancudo en el grupo testigo T0 (sin dosis de repelente) fue de 365.54 ± 646.82 picaduras/ día), siendo significativamente diferente (p<0.05) de los grupos tratados T1, T2 y T3 (49.98 ± 89.11; 113.82 ± 200.95; 19.52 ± 34.41 picaduras/día, respectivamente), y sin diferencia significativa entre los grupos tratados (Figura 1c).
El Índice de Repelencia (IR) para T1, T2 y T3 fue de 0.47; 0.24 y 0.10, respectivamente (Figura 2), lo cual demuestra que el repelente utilizado en T3 mostró mayor nivel de repelencia a los zancudos.
El porcentaje de reducción de la repelencia, valor que está relacionado con la pérdida del efecto repelente en función al tiempo mostrado en la Figura 3, donde la disminución promedio total de la repelencia a los zancudos fue de 80.13 ± 16.54% a los 175 minutos. En el caso de los tratamientos, la mayor pérdida fue en T1 (69.23 ± 4.11%), seguido de T2 (50.03 ± 4.47%) y T3 (27.32 ± 3.56%) en dicho lapso.
DISCUSIÓN
Se calcula la existencia de cerca de 85 especies de plantas con potenciales propiedades de repelencia contra insectos en Latinoamérica (Ramírez-Suárez et al., 2018), con componentes específicos (Alcalá-Orozco et al., 2017). Entre estas especies, la planta neem, considerada como un producto botánico bioactivo (Hernández-Castro et al., 2005), se presenta como una alternativa (Daza y Florez, 2006), habiendo sido utilizada como repelente de insectos en plantas, contra zancudos en humanos, como garrapaticida y contra moscas (Gruber, 1992; Esparza-Díaz et al., 2010; Ramírez-Suárez et al., 2018).
Los resultados obtenidos en la extracción de aceite de neem son semejantes a quienes recomiendan el método soxhlet utilizando hexano (Rodríguez et al., 2012; Tesfaye y Tefera, 2017). No obstante, existen métodos que utilizan maquinaria industrial y procesos fisicoquímicos con rendimiento de 76% y con máquinas de pelletsextrusado prensado con rendimientos de 64%, pero cuyos procesos son de mayor costo (Escalante et al., 2004; Delgado et al., 2012; Cárdenas, 2017).
El neem posee un olor característico y que es considerado como la base del efecto repelente (Alemán et al., 2016), pudiendo interferir con el sentido del olfato del zancudo (Mindiola, 2019), por lo que la acción repelente se incrementa con que el aumento de la concentración del aceite de la planta. En trabajos de repelencia para humanos se utilizaron dosis entre 0.63 y 2.5% (López, 2015; Lorrén et al., 2015), pero concentraciones entre 3 y 5% son menos eficientes en hembras Aedes aegypti (Alemán et al., 2016). Como repelente para plantas se utilizan dosis de hasta 10% (Novo et al., 1997; Chio yYang, 2008; López, 2015; Boito et al., 2018).
Los resultados de repelencia y protección del presente estudio en lechones fueron similares a los obtenidos para mosquitos en humanos, donde se obtuvieron repelencias desde 57% hasta 94%, dependiendo de la concentración de aceite de neem (Gruber, 1992; Daza y Florez, 2006; Regnault-Roger, 2012; Lorrén et al., 2015; Beltrán, 2018; Ramírez-Suárez et al., 2018). Así mismo, mostró efectos repelentes similares a compuestos de otras plantas como aceite de resino (Roldán et al., 2015) Melia azedarach L (Kebede et al., 2010), Elettaria cardamomum, Salvia officinalis y Lippia origanoides (Alcala-Orozco et al., 2019).
El neem mejora su efecto repelente en combinación con otros productos botánicos. Concentraciones de 2 y 5% de aceite de neem con aceite de coco en humanos contra Phlebotomus orientalis (vector de leishmaniasis visceral) dieron 96.3 y 98.3% de protección (Chio y Yang, 2008). Efectos similares se reportan con el extracto etanólico de la hoja (neem y Cinnamomum camphora) (Tabassum et al., 2018), neem y chinaberry (Melia azedarach L) (Kebede et al., 2010).
Debido a que la duración de la repelencia disminuye con el tiempo, se consideran las tres primeras horas como apropiadas para evaluar la acción repelente (Mandal, 2011). La disminución de repelencia en este trabajo fue mayor a la reportada utilizando neem y Cinnamomum camphora, donde solo disminuyó en 8% en una hora y 10% en la tercera hora (Tabassum et al., 2018). Así mismo, Martínez et al. (2016) usando sauco obtuvo mayor repelencia a las tres horas, resultado semejante a la dosis de T3 del presente experimento. Por otro lado, el aceite de neem con aceite de coco en humanos brindó una protección completa durante 12 h contra las picaduras de todas las especies de anophelidos (Kebede et al., 2010).
CONCLUSIONES
Las tres mezclas empleadas como repelentes contra zancudos tuvieron efecto positivo y significativo, con una tendencia no significativa de mayor porcentaje de repelencia (88.74%) con el tratamiento con 3% de aceite de neem (Azadirachta indica A. Juss).
La repelencia fue efectiva por lo menos por tres horas, siendo el tratamiento con 3% de aceite de neem quién presentó la menor disminución repelente (21.41%).