INTRODUCCIÓN
La industria de la transferencia de embriones (TE) en bovinos fue establecida en Estados Unidos a inicios de los años 70 (Bó y Mapletoft, 2013). En la actualidad, el creciente campo de la TE permite considerarla como la contraparte femenina de la inseminación artificial. En los últimos 30 años, la TE ha sufrido avances importantes, en particular gracias a la producción in vitro de embriones, así como en las técnicas de manejo embrionario (Greve y Madison, 1991). La técnica de producción in vitro de embriones bovinos (PIVE), además de consolidarse como una de las técnicas de reproducción asistida más exitosa en los últimas décadas, ha permitido el desarrollo de variantes técnicas, abriendo la posibilidad de utilizarse con fines de investigación (desarrollo embrionario temprano, transgénesis y clonación) (Lonergan y Fair, 2014), en esquemas de mejoramiento genético (Wu y Zan, 2012), en el desarrollo de nuevas técnicas de reproducción asistida (Galli et al., 2003) (Mapletoft, 2013) y con propósitos comerciales (Pontes et al., 2011).
Exceptuando la recolección de los gametos, la PIVE puede dividirse en tres pasos esenciales: a) Maduración in vitro b) Fertilización in vitro, y c) Cultivo in vitro (Galli y Lazzari, 1996). El objetivo de este trabajo fue recopilar las técnicas más utilizadas en cada uno de estos procedimientos, además, de sugerir las técnicas de mejor perspectiva.
ASPECTOS ESENCIALES EN TÉCNICAS DE FERTILIZACIÓN IN VITRO
Existen diversas técnicas quirúrgicas y no quirúrgicas de extracción de gametos femeninos en bovinos, basadas en técnicas laparoscópicas o en técnicas guiadas por ultrasonografía como la aspiración folicular guiada por ultrasonografía (OPU-por sus siglas en inglés) (Galli et al., 2001), así como de estructuras de animales procedentes de matadero. Sin embargo, todas estas técnicas se remiten a la extracción del contenido de los folículos y la obtención de gametos inmaduros (complejos cumulus-ovocito COC's) (Sutton et al., 2003) que permiten, dado su estado fisiológico, obtener un mayor número y más homogeneidad en los procesos. En el laboratorio, todos los procesos comparten soporte y técnicas con el cultivo celular que permite el uso de materiales y fungibles para diversos usos.
La calidad de los ovocitos es esencial en la eficiencia de la maduración in vitro (MIV), y está relacionada desde su recolección por la cantidad y calidad de las células del cumulus adyacentes, así como por la calidad de su citoplasma (Boni et al., 2002). Lo más valorado en las células del cumulus es su cantidad, considerando más de cuatro capas como el número adecuado, así como su posición, la cual se busca que estén rodeando completamente la zona pelúcida (Lourenço et al., 2014). El citoplasma debe de presentar homogeneidad en su coloración marrón (café), por lo que cambios en esa coloración a tonalidades más claras u oscuras, son criterios de descarte asociados a picnosis y degeneración, entre otros (Wood y Wildt, 1997). En base a estos conceptos morfológicos, entidades como la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS), han establecido criterios de selección de COC's clasificados en cuatro grados (de I a IV) (Calado et al., 2001).
Maduración in vitro (MIV)
La MIV es el proceso contiguo a la extracción de los COC's y se considera el proceso mediante el cual los gametos femeninos adquieren la competencia para ser fecundados (Lonergan y Fair, 2008). Esto se debe a que los óvulos recolectados proceden de folículos de poco desarrollo, en fases iniciales de la onda folicular, con tamaños entre 2 y 8 mm (van Wagtendonk-de Leeuw, 2006). Estos gametos, durante la MIV, logran finalizar su desarrollo y llegar al estadio de Metafase dos (MII) (Voronina y Wessel, 2003), donde adquieren su competencia citoplasmática y genética, pasando desde la reacomodación de sus túbulos hasta la pérdida de un juego de cromosomas (haploides) (Smetanina et al., 2014). Al ser un proceso secuencial, el éxito de los procesos siguientes (fecundación y desarrollo embrionario) depende en gran parte del desarrollo de los ovocitos madurados in vitro (Sutton et al., 2003).
En condiciones óptimas, cerca del 95% de los ovocitos puede alcanzar la maduración y, de estos, cerca del 80% puede llegar el estadio de dos células; sin embargo, menos de la mitad (30-50%) alcanza al estado blastocisto siete días después de la fertilización (Ferré et al., 2020). La eficacia de la MIV puede verse afectada por factores como: a) la recolección de los gametos, el método de recolección de los COC's, b) la temperatura del transporte, en donde temperaturas demasiado altas o muy bajas afectan la competencia ovocitaria, c) el tiempo de recolección y de transporte de los COC's desde la colecta al laboratorio, en donde tiempos muy altos de procesamiento afectan la viabilidad de los COC's, d) su estadio de desarrollo, en donde óvulos ya maduros además de ser incompetentes para el proceso de MIV, afectan el rendimiento del lote, e) el tiempo de maduración (22-24 horas), f) la composición del medio de maduración y suplementos utilizados, y g) cambios en la osmolaridad, pH, y uso de hormonas (Smetanina et al., 2014) o aminoácidos (Bahrami et al., 2019).
En la técnica de MIV existen otros factores que también deben considerarse: a) el soporte físico (placa, tubo), b) modo de colocación del método de cultivo (gota o pozo), c) la adición de aceite mineral, d) el número de COC's por volumen de medio, y e) el movimiento (Hatýrnaz et al., 2018) Entre los sistemas de cultivo para el desarrollo de la MIV se destacan: a) el cerrado, en donde no se permite el contacto directo con la atmósfera, mediante el uso de un recipiente hermético (mezcla de gases) (Ortí et al., 2005) y b) el abierto, que se realiza manteniendo un intercambio gaseoso continuo (Smith y Rocha, 2012). El primero se considera de los más antiguos y al no permitir el intercambio gaseoso permanente, necesario para la maduración de los ovocitos, ha entrado en desuso, mientras que dentro del segundo grupo se encuentran el sistema abierto como tal y el recubierto (Gordon, 2003; Kocyigit, 2016).
En el sistema abierto se coloca el medio de cultivo en un recipiente que está en contacto directo con la atmosfera (placas petri, cámaras de cultivo, tubos etc.); sin embargo, la gran superficie de evaporación puede elevar el sodio y por consiguiente la osmolaridad (Gasperin et al., 2010). Por otro lado, en el sistema recubierto se cubre el medio de cultivo con aceite mineral para evitar la evaporación del medio y permitir el intercambio gaseoso, aunque el aceite mineral puede favorecer la absorción de suplementos como hormonas (Gordon, 2003). El éxito de la fecundación, división y desarrollo embrionario presenta estricta relación de la competencia adquirida durante la MIV (Avery et al., 2003).
Los medios de soporte más utilizados para la maduración in vitro son el KSOM (Yang et al., 1994) y el TCM199 (Kim et al., 1990), por su gran variedad de componentes iónicos y energéticos, que se correlacionan con el éxito presentado en cultivos de células en varias especies. La suplementación de estos medios de maduración pasa por diferentes sustancias en función del protocolo que se esté implementando. Los principales suplementos en orden de importancia son el suero fetal bovino (FCS), la albúmina sérica bovina (BSA), factores de crecimiento (IGF y EGF), y hormonas como FSH y LH (Sanbuissho y Threlfall, 1990). Tras el proceso de maduración, los aspectos de evaluación morfológica más evidentes son la expansión de las células del cumulus (Larsen et al., 1991) y la expulsión del primer corpúsculo polar confirmando el estado de Metafase II (Ectors et al., 1995).
Fertilización In vitro (FIV)
Una vez transcurrido la MIV, los COC's entran en contacto con los espermatozoides (fecundación propiamente dicha) para la FIV (Parrish, 2014). Este proceso engloba varios eventos, relacionados con la manipulación de los gametos masculinos y femeninos. Entre los eventos fisiológicos que ocurren en este periodo se encuentran la capacitación y penetración de los espermatozoides, la unión de los gametos y la formación de los pronúcleos. Un paso esencial es la selección de los espermatozoides más motiles y de mejor condición, en donde además se retiran sustancias no deseadas en el sistema de cultivo como diluyentes y crioprotectores (Liu et al., 2013).
Entre las técnicas de selección espermática más usadas se encuentran las de migración, como el Swim-Up (Liu et al., 2013), y las de lavado selectivo de subpoblaciones a través de centrifugación de gradientes de densidad como el Percoll(r) y el Bovipure(r) (Samardzija et al., 2006). Si bien estas presentan diferentes fundamentos, ambas buscan los mismos objetivos (espermatozoides motiles) (Arias et al., 2017). Existen otras técnicas reportadas menos usadas como la migración a través de columnas de ácido hialurónico (Witt et al., 2016), de moco cervical (Galli et al., 1991) y de sustancias adhesivas (fibra de vidrio) (Engel et al., 2001).
El método de Swim-Up se basa en la capacidad migratoria de los espermatozoides por sus propios movimientos, y consiste en colocar en el fondo de un tubo cónico con medio de selección espermática (inclinación de 45°) el contenido de la pajilla descongelada, durante 1 h a 38-39 °C. Pasado ese tiempo se retira el sobrenadante para recuperar los espermatozoides que se hayan desplazado a la parte superior (Magdanz et al., 2019).
Los Gradientes de Densidad buscan separar los espermatozoides motiles y viables por medio de la sedimentación-centrifugación. Las células son sedimentadas en un gradiente que se encuentra en equilibrio equivalente con su propia densidad, lo que permite que, mediante la centrifugación, los espermatozoides motiles y viables lleguen al fondo del tubo cónico formando un "pellet", actuando en forma de filtro para el plasma seminal, células redondas, detritos espermatozoides no mótiles, diluyentes y crioprotectores (Oliveira et al., 2012). Estos gradientes pueden ser continuos (Ficoll) (Palomo et al., 1999) o discontinuos (Percoll(r), Bovipure(r), Puresperm(r)) (Samardzija et al., 2006). Los dos últimos son a base de silicio coloidal y generalmente se utilizan concentraciones de 45 y 90% o 30, 45 y 90% (García-Herreros y Leal, 2014), diluidas en medios inertes o de capacitación, y el tiempo de centrifugación es variable según el protocolo (5-20 min) (Arias et al., 2017). Los productos más usados para el lavado de espermatozoides por gradientes discontinuos son el Percoll(r), PureSperm(r) y el Bovipure(r) (Malvezzi et al., 2014; Arias et al., 2017).
El proceso de capacitación espermática se desarrolla en condiciones fisiológicas (Hunter, 2012), proceso que en condiciones in vitro se procura realizar durante la selección y fecundación propiamente dicha (Parrish, 2014). Este proceso favorece cambios estructurales en el espermatozoide, mediado por sustancias llamadas "capacitantes" que promueven cambios estructurales y bioquímicos que conducen la eliminación de componentes adheridos a la membrana del espermatozoide, cambio de la composición lipídica de la membrana espermática, aumento de la permeabilidad a los iones Ca2+, cambio en el pH interno y un incremento en la permeabilidad y metabolismo celular (Stival et al., 2016) para lograr una correcta penetración y fusión al ovocito.
Entre los principales inductores de la capacitación espermática en condiciones in vitro se encuentran:
Células del cumulus (mediante liberación de hormonas esteroideas se induce el flujo de calcio, se provoca activación, reacción acrosómica y quimiotaxis hacia el ovocito) (Van Soom et al., 2002),
El Medio Tyrode's libre de calcio (iones, osmolaridad y pH permiten las modificaciones de membrana para la entrada de calcio) (Coy et al., 2002).
La albumina sérica bovina (BSA) libre de ácidos grasos (a través de la eliminación del colesterol y zinc, reducción de esteroles en las células y del nivel de los fosfolípidos de la membrana) (Stewart-Savage, 1993; Xia y Ren, 2009).
La heparina y otros glucosaminoglucanos (GAG), donde la heparina es considerada el GAG más potente para inducir la capacitación espermática en bovinos (Parrish, 2014) (se une a la membrana mediante proteínas del plasma seminal, reduciendo la actividad del calcioATPasa, permitiendo la entrada de calcio extracelular) (Leemans et al., 2019).
Los aminoácidos y catecolaminas (hipotaurina, penicilamina y epinefrina [PHE]) (Gonçalve et al., 2014), que permiten mantener una buena motilidad espermática e incrementar las tasas de penetración del ovocito.
Los ionóforos de calcio que ayudan a abrir los canales de calcio, y activan la reacción acrosómica (Pereira et al., 2000; Stival et al., 2016).
La cafeína que favorece la hipermotilidad espermática, y presenta efecto sinérgico con la heparina (Barakat et al., 2015).
Tras la selección espermática se determina la concentración, que permite conocer y ajustar la cantidad de espermatozoides que serán colocados con los ovocitos maduros. El conteo se realiza con hemocitómetro o cámara de Thoma (Anzar et al., 2009), y el ajuste suele realizarse a dosis que varían entre 1 y 6x106 espermatozoides/ml de medio de fecundación, dependiendo del protocolo utilizado (Mohanty et al., 2018). Tras la adición de los espermatozoides al medio de fertilización con los óvulos previamente ubicados, se consolida el cocultivo con los óvulos y espermatozoides en medio de fertilización, por periodos entre 18 y 22 horas en ambiente de alta humedad y protegidos de la luz (Parrish et al., 1986).
Los sistemas para el desarrollo de la FIV suelen ser similares a la MIV, permitiendo ser abiertos o bajo aceite mineral, utilizándose con más frecuencia el recubierto y en gotas (Martinez et al., 2017; Aravina et al., 2019). Las gotas son más utilizadas cuando se usa semen sexado, al buscar optimizar el número de espermatozoides en función del número de ovocitos (Xu et al., 2006; An et al., 2017; Hasegawa et al., 2014). Para el desarrollo de la FIV se utilizan medios como el TALP (Costa et al., 2010), el TCM-199 o el SOF (Mastromonaco et al., 2004), los cuales pueden ir suplementados por distintos componentes, como células oviductales (Yang et al., 1994), células del cumulus (Chian et al., 1995), BSA (libre de ácidos grasos), heparina, oPHE (Parrish, 2014; Kang et al., 2015).
Cultivo de Embriones
Trascurrido el tiempo de la fertilización, los presuntos cigotos se retiran del medio de la fertilización in vitro. En primer lugar, se retiran las células de cumulus adyacentes a los presuntos cigotos y luego se les clasifican. Finalmente, los cigotos denudados y los de mejor calidad pasan al sistema de cultivo (Cebrian-Serrano et al., 2013). La remoción de las células del cumulus se puede realizar a través de pipeteo fino, con el uso de hialuronidasa, o a través de vórtex (agitación) a los presuntos cigotos (Gordon, 2003). La clasificación de los presuntos cigotos se hace siguiendo el criterio de clasificación ovocitaria para citoplasma, buscando eliminar estructuras con citoplasmas claros u oscuros, en estado de apoptosis o degenerados (Van Soom et al., 2003).
El cultivo embrionario se puede definir como el periodo en el cual se desarrollan las estructuras desde presuntos cigotos hasta blastocistos. Este periodo está comprendido entre el día 1 y el día 7 del desarrollo embrionario. Este cultivo se puede desarrollar bajo diferentes características, que pueden diferir en: a) soporte (placa de Petri, placa de cuatro pozos, en gotas), con o sin cobertura de aceite mineral (Smith y Rocha, 2012), b) medio (medio simple definido, semi-definido indefinido, medios condicionados) (LoperaVásquez et al., 2016), c) tipos de células (cocultivo) (Cordova et al., 2014; Carvalho et al., 2017).
El medio de cultivo es un aspecto fundamental en el cultivo embrionario, ya que este debe proporcionar condiciones óptimas para el desarrollo del embrión. El medio de cultivo definido más utilizado en bovinos es el fluido oviductal sintético (SOF), que basa su composición en el fluido del oviducto bovino y es considerado es uno de los que mejor asemeja las condiciones de cultivo en condiciones fisiológicas (Holm et al., 1999). Sin embargo, se han reportado cultivo de embriones utilizando TCM199 (Kim et al., 1990), KSOM (Liu y Foote, 1995) y CR1aa (Rosenkrans et al., 1993).
En general, los medios están compuestos por sales inorgánicas (NaCl, KCl), fuentes energéticas (glucosa, piruvato y lactato 3 de sodio), amortiguadores de pH (NaHCO ) (Holm et al., 1999; Kim et al., 1990) y en algunas oportunidades de fuentes proteicas (suplementos) como la BSA (Palasz et al., 2006) o FCS (Leivas et al., 2011). Según la especificidad de los suplementos, se derivan los términos indefinidos, semidefinidos (Kim et al., 1993) y definidos (van der Valk et al., 2010), descritos previamente, en donde los cocultivos a través de las sustancias que secreta también pueden ser incluidos (LoperaVásquez et al., 2016).
Los indefinidos usan sustancias altamente inespecíficas que contienen gran variedad de otras sustancias como el FCS, que favorecen el crecimiento embrionario (Rizos et al., 2003). Dentro de estos se incluyen los cocultivos con células somáticas como células del cumulus (Thomas y Seidel, 1993), células de la granulosa (Goto et al., 1994), células del oviducto (Lopera-Vásquez et al., 2016), células de hígado de rata, y células Vero (Gómez et al., 2008), para estimular el desarrollo y la calidad de los embriones mediante mecanismos como la disminución del estrés oxidativo, hipoxia en el trasporte de fluidos a través de la membrana, la estabilidad del pH, la acción surfactante, y acciones como el reinicio de la meiosis (Cordova et al., 2014). Además, se consideran herramientas potentes para el estudio de mecanismos fisiológicos en condiciones in vitro (Cordova et al., 2013).
Suplementos como el FCS (Leivas et al., 2011) y la BSA (Palasz et al., 2006) presentan buenos resultados de desarrollo embrionario, inclusive donde su uso alternado o escalonado busca reducir el riesgo asociado a cada uno de ellos (sistemas de cultivo en "dos pasos") (Felmer et al., 2011).
Los sistemas definidos hacen referencia al uso de sustancias altamente específicas como polímeros sintéticos como el alcoholpolivinílico (PVA) y la polivinilpirrolidona (PVP), o algún tipo de BSA, o factores de crecimiento IGF, EGF (Ahumada et al., 2013) o hialunorato (Furnus et al., 1998). Debido a falencias asociadas a inespecificidad de los sistemas indefinidos, las investigaciones a nivel mundial avanzan en busca de retirar el FCS (Murillo et al., 2017), y si bien algunos autores reportan menor eficiencia de producción, otros han observado tasas similares de producción de embriones y diferencias metabólicas importantes entre embriones cultivados con o sin estos componentes (Rizos et al., 2003).
La valoración del desarrollo y la calidad embrionaria son puntos álgidos para conocer la eficiencia y calidad de los sistemas de maduración, fecundación y cultivo. Este se puede realizar al día 2 o 3 de haber realizado la fertilización (estadios de 2-4 o más células) denominado tasa de división o cleavage (clivaje) (Van Soom et al., 2003), al día 5 o 6 (mórulas o mórulas compactas) denominado previsión, y día 7 (blastocistos) o desarrollo embrionario (Maddox-Hyttell et al., 2003) con el fin de producir y seleccionar los embriones con las mejores cualidades a transferir buscando obtener el mayor número de gestaciones.
La calidad del embrión es un aspecto importante que refleja la eficiencia y desarrollo de los procesos embrionarios. Si bien existen diversas formas de valorar la calidad del embrión, la más utilizada para este fin es la morfología (Van Soom et al., 2003), en donde por su estadio de desarrollo y por las características de su apariencia, se clasifica según los criterios de la IETS (Rocha et al., 2016). Entre los aspectos más relevantes se encuentra la simetría, la homogeneidad y la coloración de la estructura del embrión, al igual que la coincidencia con el tiempo de desarrollo (Mapletoft, 2013). En este aspecto, las fases más tempranas presentan menores tasas de preñez en comparación con fases de desarrollo más avanzadas; sin embargo, fases avanzadas como blastocistos eclosionando o eclosionados, pueden ser más sensibles a cualquier cambio de ambiente en el transporte o transferencia (Chimote et al., 2013).
La calidad del embrión influye directamente sobre las tasas de preñez, donde se observa 10% más de preñeces con embriones en comparación con un nivel de calidad inmediatamente anterior (Pontes et al., 2009). La eficiencia de los niveles de preñez después de la transferencia embrionaria puede verse afectada por factores extrínsecos e intrínsecos. Los extrínsecos están asociados a factores externos a la receptora como bienestar del animal, medio ambiente, manejo animal y alimentación. Los intrínsecos se relacionan con la fisiología de la madre y del embrión, en donde son relevantes el tamaño del cuerpo lúteo de la receptora, el desarrollo y calidad del embrión, la eficiencia del semen en la FIV y la dificultad de la transferencia (Roper et al., 2018).
CONCLUSIONES
La producción de embriones in vitro es un proceso multifactorial en donde además de existir diversas técnicas para cada paso, la elección de cada una de estas deberá ser cautelosa y basada en resultados previos y condiciones de trabajo, ya que de esta decisión y aplicación dependerá el éxito o el fracaso de la producción de embriones.
Aspectos como la temperatura, atmosfera de gases, pH, medios, suplementos, tipo de soporte, sistema de cultivo y tiempos de incubación, al igual que la destreza y el tipo de técnica a utilizar en cada proceso afecta la eficiencia de la técnica, el desarrollo de los embriones y la posterior transferencia.
Factores externos al laboratorio como el mismo proceso de recolección de ovocitos o transferencia embrionaria, son determinantes en la eficiencia de la técnica.