Animales, Dietas y Diseño Experimental

Trescientas codornices japonesas de 110 días de edad se distribuyeron en cinco grupos similares. Las aves se alojaron en jaulas (150 x 46 x 35 cm) en grupos de 60, en condiciones convencionales y con acceso a alimento y agua ad libitum. Las dietas experimentales se ofrecieron durante 12 semanas, tiempo en que la luz diurna fue de 12 horas. Las dietas (Cuadro 1) se prepararon mensualmente, utilizando un mezclador de 200 kg de capacidad. Las dietas, tipo polvo, se formularon utilizando el software ZMix iT(r) v. 3.1 (Zootech, Lima, Perú) con el contenido nutricional indicado en el Cuadro 2.

Cuadro 1 Composición de la dieta experimental ofrecida a codornices (Coturnix japonica) 

Vitaminas y mezcla de minerales: por kg contiene vitamina A 9 000 000 UI, vitamina D3 2 500 00 UI, vitamina D 15 000 UI, vitamina K3 2.5 g, vitamina B1 1.5 g, vitamina B2 6.5 g, vitamina B6 2 g, vitamina B12 0.01 g, Vitamina B5 5.50 g, Vitamina B9 1 g, Vitamina B3 25 g, Vitamina B8 0.15 g, Manganeso 70 g, Zinc 70 g, Hierro 30 g, Cobre 8 g, Yodo 1 g, Selenio 0,30 g, Cobalto 0.1 g, Excipientes

Cuadro 2 Composición nutricional de la dieta experimental 

El aceite esencial de orégano (Origanum vulgare) microencapsulado fue proveído por un laboratorio (Shandong Luxi Animal Medicine Share, Shandong, China). La dieta experimental se formuló de acuerdo con los requerimientos indicados por ^{Rostagno et al. (2017}). Los tratamientos fueron:

Control: Solo la dieta.

E&C: Dieta + dos antibióticos (0.01% de enramicina y 0.025% de sulfato de colistina).

A: Dieta con suplemento de 100 mg/kg de aceite esencial de orégano.

B: Dieta con suplemento de 150 mg/kg de aceite esencial de orégano.

C: Dieta con suplemento de 200 mg/kg de aceite esencial de orégano.

Variables en Estudio

La ingesta de alimentos (g) y la masa de huevos (g) se registraron semanalmente. La conversión de alimento se calculó semanalmente como alimento de consumo de alimento (g) dividido por la producción de huevos (g) de cada tratamiento. La producción de huevos (%) y el peso de los huevos (g) se registraron diariamente. De cada grupo experimental, se tomaron muestras de 10 huevos al azar para la prueba de estabilidad oxidativa mediante el método TBARS (sustancias reactivas al ácidotiobarbitúrico).

Sustancias Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico

Las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) como indicador de oxidación de lípidos se evaluaron utilizando la metodología descrita por ^{Prabhakar et al. (2012}) con algunas modificaciones. En resumen, el último día del periodo experimental se seleccionaron 10 huevos por cada nivel de aceite esencial de orégano. Estos huevos fueron analizados a los 0, 7 y 15 días de almacenamiento a temperatura ambiente, en un lugar fresco y seco con sombra, para determinar la concentración de malonaldehído por mililitro de yema. La yema de huevo (1.65 g) fue homogenizada con 5 ml de agua desionizada y se colocó 0.5 ml en un tubo de ensayo. Se agregó 1 ml de solución de TBA-TCA (ácido tiobarbitúrico 20 mM en ácido tricloroacético al 15% [p/v]). Las muestras fueron colocadas en baño maría (90 °C durante 15 minutos), se enfriaron a 4 °C durante 15 minutos, y se centrifugaron a 20 g durante 15 minutos. La absorbancia del sobrenadante de la mezcla y del blanco (agua desionizada) fue medida a 532 nm utilizando un espectrofotómetro lector de microplacas (Multiskan(tm) GO, Thermo Scientific, USA). Para realizar la curva de calibración estándar se utilizó 1,1,3,3tetraetoxipropano, precursor de MDA (10^-9 M/ml).

Análisis Estadístico

Se trabajó con un diseño factorial y se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) de una vía para determinar la importancia de los parámetros productivos y el ANOVA de dos vías para determinar la importancia de la prueba TBARS de los tratamientos y su interacción con los días de almacenamiento. El análisis post hoc se analizó mediante la prueba de Tukey (p<0.05). Los valores se expresan como la media ± error estándar de la media. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).

Parámetros Productivos

No se encontraron diferencias significativas entre los grupos experimentales en términos de peso del huevo (Cuadro 3). Esto es consistente con ^{Yesilbag et al. (2013}), usando aceite esencial de orégano al compararlo con otros aceites, y con los trabajos de ^{Cetingul et al. (2009}) y ^{Christaki et al. (2012}), que solo usaron niveles de polvo de orégano. Esto indica que la forma de suministro de orégano no afecta el peso del huevo en la codorniz. Esto también se observa en las gallinas ponedoras (^{Giannenas et al., 2005}).

Cuadro 3 Efecto del aceite esencial de Origanum vulgare en la dieta sobre los parámetros productivos de codornices (Coturnix japonica) 

EP = Producción de huevos (%); EW = Peso del huevo (g/día); EM = Masa de huevo (g/día/ave); FC = Conversión alimenticia (kg alimento/kg huevo); FI = Consumo de alimento (g/día) Los valores son medias de 12 repeticiones (n = 60) ± error estándar de la media

a,b,c,d Los promedios con diferentes superíndices dentro de columnas difieren significativamente (p<0.05)

Control: Solo la dieta; E&C: Dieta + dos antibióticos, A, B y C: Dieta con 100, 150 y 200 mg/kg de aceite esencial de orégano, respectivamente

El tratamiento E&C fue el mejor en producción de huevos, seguido de C, B, A y el Control (p<0.01). En el Cuadro 3 se puede observar que la mayor producción de huevos se obtienen cuanto más alto es el nivel de aceite esencial de orégano (p<0.01), aunque en cualquier caso superados por el grupo E&C. ^{Radwan et al. (2008}) obtuvieron similar resultado en gallinas ponedoras al comparar varias hierbas suplementadas en polvo; sin embargo, este efecto no se evidenció en los trabajos de ^{Yesilbag et al. (2013}), ^{Cetingul et al. (2009}) y ^{Christaki et al. (2012}) en codornices, posiblemente por el uso de dosis o variedades de orégano distintas al del presente estudio debido a que se sabe cada variedad puede tener otra composición y una concentración de compuestos diferente (^{Toncer et al., 2009}). Por otro lado, si bien el grupo E&C tuvo la mayor producción de huevos, ^{He et al. (2017}) obtuvo la mayor producción de huevos utilizando 150 mg/kg de aceite esencial de orégano en gallinas ponedoras, superando el resultado del grupo con antibiótico (100 mg/kg de sulfato de colistina) en la dieta.

En masa de huevo, el grupo control tuvo el resultado más bajo (p<0.01), aunque ^{Yesilbag et al. (2013}) no encontraron estas diferencias en su trabajo con codornices. En el presente estudio se encontró que la masa y la producción del huevo del huevo están directamente relacionadas, ya que el grupo control obtiene la más baja producción, resultando en una menor masa de huevo (^{Bohren, 1970}).

El grupo E&C, juntamente con los grupos C y B, obtuvieron las mejores conversiones alimenticias, seguido del grupo A y del control (p<0.01). En el estudio de ^{He et al. (2017}), el aceite esencial de orégano fue más efectivo que el tratamiento con antibióticos. La diferencia podría ser explicada por el hecho que en este estudio se utiliza la combinación de dos antibióticos que permite una mejor efectividad de la acción antibacteriana. Por el contrario, ^{Cetingul et al. (2009}) no obtuvieron diferencias significativas entre sus tratamientos con codornices.

Con relación a la ingesta de alimento, el grupo C alcanzó el mayor consumo (p<0.01), posiblemente debido a una mayor palatabilidad del alimento, dada las características aromáticas del orégano (^{Windisch et al., 2008}). Así mismo, ^{Yesilbag et al. (2013}), quienes utilizaron aceite esencial de orégano comparándolo con otros aceites obtuvieron un mayor consumo con respecto a la dieta de control. Sin embargo, otros trabajos con codornices (^{Cetingul et al., 2009}; ^{Christaki et al., 2012}) y en gallinas ponedoras (^{Giannenas et al., 2005}; ^{Radwan et al., 2008}; ^{He et al., 2017}) no encontraron un mayor consumo de alimento por efecto del orégano, debiendo realizarse mayores estudios para verificar este efecto.

Sustancias Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico

En la prueba del TBARS se encontraron diferencias altamente significativas entre los días de almacenamiento (p<0.001) y entre grupos (p<0.01), pero no en la interacción día-tratamiento (Figura 1). En un estudio similar, ^{Botsoglou et al. (1997}) reportan que la suplementación con tomillo al 3% en la dieta de gallinas ponedoras redujo significativamente los niveles de MDA en la yema, pero sin verse influenciado por el tiempo de almacenamiento.

El grupo control presentó los niveles de MDA más altos durante todo el tiempo de almacenamiento evaluado (día 0 = 3.845x109 M/ml, día 7 = 5.058x109 M/ml, día 15 = 5.66x109 M/ml) respecto a los demás grupos (Figura 1). Estos resultados concuerdan, puesto que se sabe que existe una relación inversa entre los niveles de malondialdehído (MDA), un indicador de la peroxidación de lípidos, y el nivel de antioxidantes en la dieta de los productos avícolas (^{Guo et al., 2001}; ^{Sahin et al., 2008}). En el día 0 (Figura 2 a) se muestra que los grupos que recibieron tratamiento con aceite esencial de orégano logran una mayor reducción (100 mg/kg: p<0.0001; 150 y 200 mg/kg: p<0.001) de los niveles de MDA que el grupo E&C (p<0.01). Resultado similar se obtiene en los otros días de almacenamiento con excepción del día 7, donde los niveles de MDA fueron similares entre el grupo C y el E&C (p<0.05). Se sabe que el aceite esencial de orégano presenta poderosos componentes antioxidantes como el timol del cual se ha reportado su posible influencia benéfica sobre el metabolismo de los lípidos y que está relacionada con la calidad nutricional de los productos como el huevo (^{Fernandez et al., 2019}).

Figura 1 Influencia del tiempo de almacenamiento del huevo de Coturnix japonica en los niveles de malondialdehído (Días: p<0.0001); tratamientos: p<0.0001; interacción díatratamiento: p>0.05) 

Figura 2 Niveles de malondialdehído en yema de huevo de codornices (Coturnix japónica) por día de almacenamiento. (a) día 0; (b) día 7; (c) día 15. (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 vs. Control) 

Respecto al grupo E&C que recibieron promotores de crecimiento, se sabe que la colistina ha sido relacionada con neurotoxicidad, inducción de apoptosis y aumento de estrés oxidativo (^{Dai et al., 2017}; ^{Ajiboye et al., 2018}), efectos que involucrarían a un mecanismo mediado por una disfunción mitocondrial y la regulación al alza en la expresión de los ARNm de caspasa-3 y Bax (^{Dai et al., 2019}); razón probable por la cual los niveles de MDA son altos. En contraste, los resultados del grupo B muestran que la suplementación es más beneficiosa sobre la estabilidad oxidativa de huevo si se compara con E&C (Figura 2 a, 2b, 2c). En este sentido, ^{Botsoglou et al. (2002}), usando estos niveles de aceite de orégano, disminuyeron los niveles de MDA inducidos por hierro en muestras de tejido de pollos. Asimismo, ^{Giannenas et al. (2005}), usando la dosis de 100 mg/kg, encontraron valores de MDA relativamente bajos respecto al grupo control.

Se había sugerido que el efecto antioxidante del aceite esencial de orégano sobre la peroxidación de lípidos era dependiente de la dosis, hipótesis que no fue corroborada en el presente estudio. Por el contrario, la dosis más baja fue la que mejor inhibió la peroxidación de lípidos en yema de huevos de codorniz, apoyando la hipótesis de que este aceite puede actuar como un bioantioxidante eficiente, incluso a dosis muy bajas como 300 ng/día (^{Misharina et al., 2013}).

^{Lee et al. (2004}) señalan que la posibilidad de acumulación de aceite esencial en el cuerpo es reducida debido a su rápida conversión y excreción metabólica, siempre y cuando la suplementación sea por cortos periodos. Esto se ha confirmado en productos animales como los huevos (^{Zhai et al., 2018}).

Sin embargo, esta susceptibilidad a la oxidación de lípidos también dependería de la especie animal (^{Luna et al., 2010}), sin dejar la posibilidad de que sea la misma en el caso de productos como el huevo de codorniz. Los resultados indicados indican una tasa moderada de oxidación de lípidos y un efecto de este tipo basado en los componentes antioxidantes del aceite esencial de orégano como el ácido rosmarínico, ácido gálico, ácido cafeico, ácido protocatecúcico, flavonoides, timol y carvacrol, responsables de la inhibición de la oxidación de los lípidos (^{Yanishlieva et al., 2006}).