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INTRODUCCIÓN
La placenta es un órgano transitorio multifuncional que sustituye las funciones vitales que necesita un organismo para su óptimo desarrollo (Burton y Fowden, 2015). De otra parte, este órgano en el humano ha demostrado tener cualidades potenciales para la clínica experimental en la medicina regenerativa (Caruso et al., 2012; Pogozhykh et al., 2018), en tanto que los estudios realizados en placenta de animales domésticos han demostrado guardar características similares a la del humano (Barboni et al., 2018); sin embargo, la placenta de los camélidos sudamericanos ha sido muy poco estudiada.
Las células primarias (CP) de un tejido se pueden obtener de diversas formas (Zhu et al., 2013; Hendijani, 2017; Araujo et al., 2018; Reichard y Asosingh, 2019), sin embargo, clásicamente se obtienen de la disgregación mecánica y enzimática en el tejido o por cultivo de explantes. Del cultivo continuo de CP, se purifican las células madre (Soleimani y Nadri, 2009), células que se caracterizan por tener cualidades reparadoras y regenerativas, así como de participar en funciones de anti-apoptosis, inmunomodulación y angiogénesis (Kolios y Moodley, 2013).
Diversos estudios que abordan células madre de tejidos extrafetales de animales domésticos, han denotado características con buena cinética de proliferación y de morfología similar al fibroblasto (Park et al., 2012; Seo et al., 2013; Ribitsch et al., 2017; Long et al., 2018), siendo las condiciones de cultivo en estos trabajos de forma estándar, algunas de ellas suplementadas con un mayor soporte nutricional. Las células madre de los camélidos del viejo mundo también han demostrado presentar buena c apa c i d a d proliferativa, además de mostrar morfología fusiforme, tal es el caso de las células madre de la gelatina de Wharton del camello (Miniawy et al., 2017) y de la grasa abdominal del camello arábigo (Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2013). En cuanto a los camélidos sudamericanos, las células madre adiposas de alpaca también se caracterizan por s u morfología fusiforme (Enciso-Benavides et al., 2017); sin embargo, hasta le fecha no han habido estudios de caracterización en cinética de crecimiento y evaluación morfológica de células derivadas de tejidos extrafetales de camélidos sudamericanos, por lo que el objetivo del estudio fue determinar características biológicas de la morfología y cinética de crecimiento de las células primarias del corion de placenta de alpaca (CpCPa) como precursores de células madre.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras y Transporte
Se obtuvo cinco fetos con envoltura uterina de alpacas en último tercio de gestación. Los animales fueron sacrificados por abasto en el camal de la municipalidad provincial de Huancavelica. Se separó el corion de placenta de las envolturas extrafetales y envoltura uterina; se realizó 10 lavados con solución salina estéril, se colocó en pequeños contenedores estériles con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementada con 5% de suero fetal bovino más antibiótico -antimicótico (Ciprofloxacino/ Fluconazol, 200 mg/100 ml, 2X) y se transportó a la Universidad Científica del Sur en un contenedor térmico con hielo.
Aislamiento y Cultivo Primario de CpCPa
El aislamiento celular se llevó a cabo en e l Laboratorio de Cultivo C el u l ar e Inmunología de la Universidad Científica del Sur. Las muestras obtenidas se volvieron a lavar con solución salina estéril por 10 veces, procesándose únicamente 10 g del corion placentario. Se realizó disgregación mecánica y enzimática con colagenasa tipo IA al 0.05% (Sigma Aldrich) y se incubó a 37.5 Oc por 10 min; se tamizó con colador celular de 1 mm y se centrifugó a 300 g por 10 min. Se hicieron lavados con solución tampón fosfato estéril y se centrifugó a 300 g por 5 min por 2 veces. Se realizó recuento celular con cámara de Neubauer y se cultivó en placas Petri a una densidad de siembra de 2x104 células/cm2 con pequeños residuos de tejido filtrado. El medio de cultivo consistió en DMEM F-12 (Biowest) suplementado con 15% de suero fetal bovino (Biowest), y solución de antibiótico-antimicótico (penicilina 10 000 unidades, estreptomicina 10 mg/ml y anfotericina B 25 µg/ml) (Biowest) y se incubó a 37.5 oC con 5% de CO, 95% de humedad y a condición atmosférica normal.
Morfometría del Cultivo de CpCPa
Se evaluó la morfometría de las CpCPa de morfología fusiforme, desde el pasaje 0 al pasaje 3. Se tomaron microfotografías con el controlador de cámara de microscopio Nikon DS-L3 y se guardaron en un dispositivo USB. Se evaluaron las mediciones microfotográficas (longitud y ancho celular) con el software Image J (NIH, USA) y se hicieron comparaciones entre pasajes del mismo cultivo con el software Graph Pad Prism 5 (Graph Pad Software, USA), usando la prueba de T-student pareado. Los resultados se evidenciaron en significancia de las medias aritméticas.
Cinética de Crecimiento
Se evaluó la cinética de crecimiento de las CpCPa desde el pasaje 1 al pasaje 4. El pasaje de las CpC P a se realizó por tripsinización y se subcultivó en placas de seis pocillos a una densidad de 5x103 células/cm2. El recuento celular se realizó con la cámara de Neubauer empleando la tinción Azul de Tripán (Sigma Aldrich). Se evaluó el nivel de doblaje poblacional acumulativo (CPDL) y su tiempo de doblaje poblacional (DT) mediante la fórmula CPDL = Ln(N(t) / N(to)/Ln(2), donde N(t) es el número de células cosechadas a un tiempo de cultivo y N(to) es el número de células sembradas al inicio.
RESULTADOS
Cultivo Primario de CpCPa
Los tejidos del corion placentario de alpaca sometidos a disgregación mecánica (Figura 1A) y enzimática dieron como resultado de rendimiento celular 6x105 de células nucleadas/g de tejido. El tiempo de cultivo primario tuvo un rango de 3 a 5 días, mostrando mayor crecimiento de células fusiforme en cultivo primario a los 3 días (Figura 1B). No obstante, se evidenció heterogeneidad celular, células con morfología redonda y de bordes irregulares.
Las CpCPa en cultivo al pasaje 1, evidenciaron mayor crecimiento celular fusiforme y muy poco de morfología redonda e irregular, notando muy poca presencia en el pasaje 3. Asimismo, en los pasajes continuos de los cultivos se denotó incremento de tamaño morfológico en las CpCPa bajo su forma longitudinal (Figura 2)
Las medidas microfotográficas de las CpCPa fusiformes y su comparación significativa se presentan en el Cuadro 1 y Figura 3, respectivamente. La elongación evidenciada en las CpCPa muestra incrementos del 26.61, 68.08 y 26.61% con respecto a sus pasajes antecesores, mientras que los incrementos de ancho mostraron incrementos del 14.33, 32.38 y 2.77% con respecto a sus pasajes antecesores.
Cinética de Crecimiento
Los niveles de doblaje poblacional acumulativo de las CpCPa calculados fueron 2.07, 1.65, 1.06 y 0.30 para los pasajes 1 al 4 (Figura 4). Se encontró que en el pasaje 1 ocurre doble duplicación poblacional, y en el pasaje 2 y 3 concretan a una duplicación poblacional, mientras que en el pasaje 4 no ocurrió el doblaje poblacional.
DISCUSIÓN
Las células madre provienen de los cultivos primarios, cuya purificación se logra con la eliminación de células heterogéneas y eritrocitos en los primeros estadios del cultivo (Soleimani y Nadri, 2009). En este estudio no se realizó la identificación como células madre derivadas del corion de placenta de alpaca, según las características mínimas que se exige para la categorización básica (Dominici et al., 2006), pero se logró caracterizar parcialmente a los precursores de células madre de las CpCPa por su morfología, cuya característica identifica a las células madre mesenquimales de fuentes extrafetales de animales (Chen et al., 2011; Seo et al., 2013; Maciel et al., 2014; Somal et al., 2016; Ribitsch et al., 2017; Peng et al., 2017).
El protocolo de aislamiento aplicado en el estudio determinó un rendimiento celular de 6x105 células nucleadas/g de tejido, siendo mayor a los resultados de otros protocolos de aislamiento (Araujo et al., 2018; Wu et al., 2018). La confluencia alcanzada en las CpCPa en cultivo primario se obtuvo en corto tiempo, a diferencia de estudios similares que obtuvieron más tiempo (Ribitsch et al., 2017; Peng et al., 2017; Long et al., 2018).
Cuadro 1 Incremento morfométrico de longitud y ancho de las células primarias del corion de placenta de alpaca (CpCPa) con morfología fusiforme
Figura 4 Nivel de doblaje poblacional acumulado (CPDL) de las células primarias del corion de placenta de alpaca (CpCPa)
El rápido crecimiento celular pudo deberse a factores como la alta densidad de siembra y a los pequeños residuos de tejido cultivados como explantes, que coadyuvaron como andamiaje y condicionamiento para los constituyentes celulares, cuyas condiciones como las señales biomecánicas y bioquímicas son necesarias para la morfogénesis, diferenciación y homeostasis (Hendijani, 2017).
En los resultados hallados, a partir del pasaje 3, se muestra uniformidad celular fusiforme en las CpCPa. Este patrón de crecimiento también se reporta en algunos estudios de células animales (Seo et al., 2013; Huang et al., 2015).
Existen muy pocos reportes respecto al análisis morfométrico de células fusiformes, siendo uno de ellos el de Maciel et al. (2014), quién reporta que las células madre derivadas de médula ósea, además de tener apariencia fibroblástica, presentan incrementos morfométricos en condiciones de cultivo básico o estándar. Nissar et al. (2018) reportan la morfometría de células madre derivadas de tejido adiposo felino, así como ligeros incrementos en longitud y ancho celular. A diferencia de las CpCPa analizadas de 20 células por cada pasaje, el incremento morfométrico evidencia mayor incremento en longitud y poco incremento en ancho celular.
Por otro lado, el rendimiento proliferativo de las CpCPa evaluadas son inferiores al rendimiento de las células madre extrafetales de humano, porcino, búfalo, equino, caprino y canino (Chen et al., 2011; Dev et al., 2012; Seo et al., 2013; Somal et al., 2016; Wu et al., 2018; Zhan et al., 2019), entre ellas las células madre de equino que muestran rendimiento superior constante hasta el pasaje número 14. Las CpCPa analizadas no mantienen el mismo nivel proliferativo en los primeros pasajes de cultivo, al contrario, ocurre un descenso del nivel en los pasajes posteriores, por lo tanto es indispensable a futuro la evaluación de los factores de acondicionamiento para las células madre de alpaca, así como del tejido donde provienen las células (Rodrigues et al., 2010; Kilberg et al., 2016; Kwon et al., 2017).
Si el peso promedio del corion de placenta de alpaca es de 0.5 ± 0.13 kg y la placenta total de 0.8 ± 0.19 kg (Meesters et al., 2019), los resultados de este trabajo podrían pronosticar un mayor número de células nucleadas, dentro de las cuales se encuentran las células madre, que según algunos autores pueden representar entre el 0.001 a 0.01% (Pittenger y Martin, 2004). Esto permitiría iniciar el aislamiento de células madre con un determinado peso de tejido placentario para obtener una suficiente población de estas células para su futura caracterización y expansión con fines terapéuticos.
