INTRODUCCIÓN
La acuicultura es el sector de producción de alimentos con mayor nivel de crecimiento a nivel mundial. En el Perú, los principales recursos acuícolas son la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), los langostinos (Litopenaeus vannamei) y las conchas de abanico (Argopecten purpuratus) (FAO, 2018; PRODUCE, 2018). Una patología que afecta el cultivo de la trucha arcoíris es la aeromoniasis, la cual es ocasionada por bacterias del género Aeromonas sp, y que provoca retraso en el crecimiento, mortalidad de peces y perjuicios económicos significativos (Zepeda-Velásquez, 2015). Las principales especies patógenas involucradas en la aeromoniasis son: Aeromonas salmonicida, agente etiológico de la forunculosis, y Aeromonas hydrophila, patógeno principal en la Septicemia por Aeromonas Móviles (MAS) (Cipriano, 2001; Janda y Abbott, 2010). En el Perú se han aislado cepas de Aeromonas; así, IMARPE (2008) y Baca (2012) aislaron A. s almonicida y A. hydrophila provenientes de truchas arcoíris clínicamente enfermas de piscigranjas de Junín. Al ser un problema sanitario constante, el Organismo Nacional de Sanidad Pesquera (SANIPES) incluyó la aeromoniasis dentro del Programa de Control de Enfermedades en Animales Acuáticos (SANIPES, 2016).
Las bacterias patógenas Aeromonas sp son cocobacilos gramnegativos que producen una signología que incluye nado errático, letargia e inapetencia, melanosis, lesiones externas (ulceraciones, lesiones necro-hemorrágicas de aletas y distención abdominal) e internas (septicemia y hemorragia en diversos órganos) (Noga, 2010). Las investigaciones previas sobre A. salmonicida en truchas realizaron aislamiento y caracterización bioquímica de las cepas; sin embargo, aún no se ha identificado molecularmente a A. salmonicida, A. hydrophila y otras Aeromonas patógenas. La diversidad fenotípica y genética de estos patógenos (Cipriano, 2001) reafirma la necesidad de realizar más estudios para controlarlos y prevenirlos. El objetivo del presente estudio fue caracterizar e identificar Aeromonas sp patógenas de truchas arcoíris presentes en varias regiones del país.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tipo y Lugar de Estudio
El estudio fue de tipo descriptivo, e incluyó seis piscigranjas de truchas arcoíris ubicadas en las regiones de Junín (2), Pasco (2), Cajamarca (1) y Ancash (1) durante 2017 y 2018. El procesamiento de las muestras y la realización de las pruebas bioquímicas y moleculares se realizó en la Sección de Ictiopatología de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos (FMV- UNMSM), en Lima.
Material Biológico
Se seleccionaron 60 truchas arcoíris juveniles (O. mykiss) de cultivo mediante muestreo de tipo no probabilístico (De Blas et al., 2020) provenientes de Junín (20), Pasco (20), Cajamarca (12) y Ancash (8). Se tomó como criterios de inclusión a truchas juveniles de 4 a 5 meses, con signología sugerente de brotes de aeromoniasis (lesiones ulcerosas en la piel, melanosis, necrosis y hemorragias en aletas, distensión abdominal y comportamiento anómalo). En este caso, un muestreo intencionado es adecuado en el diagnóstico de enfermedades en poblaciones de peces que han presentado brotes de enfermedad o mortalidad reciente (Noga, 2010).
Toma de muestras
Los peces fueron anestesiados siguiendo las recomendaciones de CCAC (2010). Para esto, se realizó baños de inmersión en Eugenol por 3-5 minutos, con dosis de 60 mg disuelto en un 1 L de agua. El estado de anestesia se confirmó mediante la descoordinación en el nado y reducción de la ventilación (opercular). Para el sacrificio de los peces se realizó el corte medular entre el cráneo y la médula espinal. La superficie del pez se desinfectó con torundas y alcohol al 70% previo a la necropsia. Se realizó una incisión estéril en la superficie del bazo y el riñón anterior, se efectuaron piquetes con asa de siembra bacteriológica estéril, para luego sembrar por agotamiento en placas Petri con agar TSA (Agar de Soja Tríptica) y GSP (Glutamate Starch Phenol Agar). Para la identificación se usaron las siglas: T (trucha), B (bazo), R (riñón anterior) y se enumeraron según el orden de necropsia de cada espécimen y rotulados con lugar y fecha.
Las placas se transportaron al laboratorio de la FMV-UNMSM a temperaturas entre 10 y 15°C dentro de un cooler con geles refrigerantes. Una vez en el laboratorio, las superficies de las placas fueron desinfectadas y se almacenaron en estufa a temperatura de incubación (25 °C) por 24-48 horas.
Luego, las colonias resultantes fueron observadas y se seleccionaron aquellas con características similares a Aeromonas en medios TSA y GSP. Se debe observar colonias blanquecinas y circulares de 2-3 mm, el viraje amarillo del agar selectivo GSP producido por bacterias del género Aeromonas, así como la presentación del pigmento marrón en el medio TSA típico de A. salmonicida, aunque no todas las cepas la generan. Para asociar las colonias al género Aeromonas se utilizaron pruebas preliminares como la tinción Gram y las pruebas de oxidasa y catalasa (Buller, 2014).
Las bacterias con características similares a Aeromonas fueron sometidas a pruebas bioquímicas posteriores, siguiendo un esquema de caracterización bioquímica no automatizado conveniente en el estudio de bacterias del género Aeromonas (Buller, 2014) (Cuadro 1). La lectura de los resultados se realizó de 24-48 horas posteriores a la siembra de las pruebas bioquímicas e incubación en estufa (25 °C). Para la elaboración, uso de reactivos e interpretación de las pruebas bioquímicas se emplearon las descripciones de Brenner et al. (2005) y Buller (2014). Se priorizó la caracterización y diferenciación de cepas A. salmonicida subsp. salmonicida y de las Aeromonas móviles, principalmente A. hydrophila.
Estudio Molecular
Se realizó PCR convencional para la confirmación de las cepas Aeromonas sp caracterizadas por pruebas bioquímicas. Se utilizaron cebadores específicos del gen ARNr 16S para identificar cepas Aeromonas sp con un producto de 480 pb. Para A. salmonicida los cebadores Fer3 (Forward) y Fer4 (Reverse) amplificaron el gen fstA (gen del receptor sideróforo férrico) de 404 pares de base (pb), y para A. hydrophila se emplearon cebadores a partir del gen gyrB (subunidad B de la ADN girasa) con un amplicón de 144 pb, como se detalla en el Cuadro 2.
Para la extracción de ADN bacteriano se empleó el kit comercial PureLink Genomic DNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) y para la ejecución de la técnica de PCR se usó el kit comercial GoTaq Green Master Mix (Promega, USA). Para ambos kits se siguieron las recomendaciones de los fabricantes.
Los productos amplificados fueron sometidos a electroforesis (90 v durante 1-1.5 horas), utilizando gel de agarosa al 1.5% en buffer TBE 1X, marcador de peso molecular o «ladder». Adicionalmente se incluyeron controles positivos (cepas de A. salmonicida ATCC 33658 y de A. hydrophila ATCC 7966) y control negativo «NTC» (agua libre de nucleasas). Las bandas de ADN se visualizaron en un transiluminador (DNR Bio-Imaging Systems, USA).
Se extrajeron y purificaron los productos obtenidos de la PCR de las cepas A. salmonicida y A. hydrophila con el kit comercial Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA). Los productos se secuenciaron empleando el servicio de Macrogen Inc. (Corea del Sur). Las secuencias obtenidas se alinearon y contrastaron con la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) empleando BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
RESULTADOS
Las truchas juveniles fueron seleccionadas por presentar signos clínicos y lesiones asociados a aeromoniasis, lesiones que fueron corroboradas de estar presentes durante la necropsia (Figura 1). Se registraron lesiones externas como melanosis (78.3%), necrosis de aletas (68.3%), ulceraciones epiteliales variadas (53.3%), hemorragia petequial o equimótica en aletas (46.7%) y distención del abdomen (28.3%). Asimismo, lesiones internas (Figura 2) como hepatomegalia (71.7%), esplenomegalia (63.3%), hemorragias petequiales en hígado (43.3%) y hemorragias petequiales en ciegos pilóricos (16.7%) y grasa peritoneal (16.7%) (Cuadro 3).
El cultivo y aislamiento bacteriano se efectuó en los medios TSA y GSP. En el medio TSA se obtuvieron 60 cepas bacterianas, de las cuales solo una desarrolló un pigmento color café tenue, tanto en los aislados de riñón anterior como en los de bazo. En el medio GSP, medio selectivo para Aeromonas, se pudo evidenciar el crecimiento de 12 aislados que viraron el medio rojo del agar a un color amarillo evidenciando la presencia de bacterias de este género (Cuadro 4).
R= Riñón anterior; B= Bazo; PM= Forma pigmento marrón; SPA= Sin pigmentación aparente; NP= No forma pigmentos; VA = Viraje amarillo; OX=oxidasa; CAT= catalasa
En la caracterización fenotípica de aislados del género Aeromonas se apreciaron colonias que presentaban desarrollo rápido (entre 24 y 48 horas), tamaño de 2-3 mm de diámetro, formas circulares con bordes definidos y coloración blanquecina o cremosa. La tinción Gram permitió la visualización de morfología bacteriana bacilar o cocobacilar y de coloración acidófila o gramnegativa típicas.
Las pruebas bioquímicas de oxidasa y catalasa resultaron positivas para los 12 aislados de Aeromonas que, previamente, habían virado a amarillo el medio del agar GSP. Estas cepas provinieron de muestras de Junín (7 aislados) y Cajamarca (5 aislados), tanto de riñón anterior como de bazo. Todas las cepas Aeromonas sp presentaron similitudes en las siguientes pruebas bioquímicas: oxidasa y catalasa positivas, hemólisis beta en agar sangre, arginina deshidrogenasa positivas, reducción de nitratos, metabolismo de la glucosa, manitol, degradación de la gelatina y ureasa negativa.
Las cepas R3, B4, R14 y R17 de Junín no presentaron motilidad (MOT) en medio SIM y eran indol negativas (presuntivos a A. salmonicida), mientras las cepas R5, B19, B20 de Junín y R9, B9, R10, B11 y B12 de Cajamarca eran móviles e indol positivas (característico de Aeromonas móviles). Las cepas Aeromonas sp presentaron resultados que diferían o eran variables para las pruebas bioquímicas: lisina descarboxilasa (LDC), ornitina descarboxilasa (ODC), lactacto (LAC), citrato (CIT) y producción de sulfuro de hidrógeno (H S) relacionado a lo descrito por Abbott et al. (2003) y Buller (2014).
La interpretación de los resultados de las pruebas bioquímicas permitió discriminar las cepas de Aeromonas no móviles (como las cepas típicas de A. salmonicida subsp. salmonicida) de las Aeromonas móviles (como las cepas de las presuntas A. hydrophila, A. veronii y A. bestiarum). Además, dentro de las cepas caracterizadas como Aeromonas móviles se observaron perfiles bioquímicos similares a cepas de A. hydrophila (posteriormente confirmadas mediante técnicas moleculares), así como cepas presuntivas a A. veronii y A. bestiarum (Buller, 2014).
Se realizó PCR convencional a partir de las colonias de las presuntas Aeromonas obtenidas en la caracterización bioquímica. Para la identificación molecular se buscó obtener un producto de 480 pb. Para detectar A. salmonicida se generó un producto de 404 pb y para A. hydrophila un producto de 144 pb. Los resultados indican que siete cepas de Junín (R3, B4, R5, R14, R17, B19 y B20) y cinco cepas de Cajamarca (R9, B9, R10, R11 y B12) se engl oban dentro del género Aeromonas (Figura 3). Posteriormente, se identificó que las cepas R3, B4, R14 y R17 de Junín fueron positivas a A. salmonicida, mientras que la cepa B11 de Cajamarca fue positiva a A. hydrophila (Figura 4).
Se realizó el secuenciamiento de los productos de PCR y se realizó el alineamiento mediante el software ClustalX. El análisis bioinformático efectuado a través de BLAST (NCBI) confirmó las cepas Aeromonas spp y A. salmonicida utilizando los marcadores moleculares ARNr 16S y fstA respectivamente, las cuales mostraron un porcentaje de similitud de 98 a 100% con las secuencias almacenadas en la base de datos NCBI. Además, la cepa de Cajamarca identificada previamente como A. hydrophila mediante pruebas bioquímicas y PCR convencional (empleando el marcador molecular gyrB), evidenció una identidad de 9 5. 6% con Aeromonas hydrophila subespecie dhakensis con los genes de gyrB presentes en el GenBank.
DISCUSIÓN
Esta investigación se orientó principalmente a la caracterización e identificación de cepas patógenas causantes de aeromoniasis en la truchicultura peruana: A. salmonicida (forunculosis) y A. hydrophila (Septicemia por Aeromonas móviles). Austin B y Austin D (2007) y Dallaire-Dufresne et al. (2013) indican que este problema sanitario genera retraso en el crecimiento, inmunosupresión, signología diversa, alta morbilidad (80-100%) y mortalidad (entre 0 y 80%). Los experimentos realizados por Zepeda-Velásquez et al. (2017) en México, resaltan la patogenicidad de A. salmonicida y A. hydrophila.
Las lesiones externas encontradas en la necropsia fueron similares a las descritas por Cipriano (2001), Noga (2010) y Baca (2012). Además, como indica Zepeda-Velásquez (2015), las lesiones externas halladas son compatibles tanto para forunculosis como para la septicemia por Aeromonas móviles. De otra parte, las lesiones internas halladas se correlacionan con las descripciones de Roberts (2001), Koziñska (2007) y Baca (2012) en t ruchas afectadas con aeromoniasis. Las alteraciones más resaltantes son las hemorragias de tipo petequial o equimótica en riñón, bazo, hígado y tracto intestinal, tal y como lo describen Cipriano (2001) y Noga (2010).
Austin B y Austin D (2007) y Koziñska (2007) mencionan que en la patología ocasionada por A. salmonicida, no siempre conlleva la formación del forúnculo, sobre todo en infección aguda o subaguda en peces juveniles y en brotes epidemiológicos; lo que coincide con los hallazgos de este estudio. De hecho, A. hydrophila también puede ocasionar lesiones forunculosas (Zepeda- Velásquez, 2015). Además, en salmónidos como la trucha arcoíris la presentación de signos clínicos frente a una infección bacteriana cursa con signología general , no patognomónica (Kumar et al. 2015), y que se asemeja a lo ocasionado por Yersinia ruckeri (Sierralta, 2011) o Flavobacterium psychrophilum (León et al., 2008) que cursan con melanosis, esplenomegalia, hepatomegalia, lesiones hemorrágicas multifocales, entre otras anomalías del comportamiento.
La caracterización bioquímica se separó en dos fases. La primera fase buscó aislar cepas Aeromonas spp en agar TSA y GSP (selectivo), y caracterizarlas observando la morfología macroscópica y microscópica, tinción de Gram, prueba de oxidasa y catalasa. Así, 12 cepas de Aeromonas sp provenientes de Junín y Cajamarca se desarrollaron en el agar GSP. El aislamiento de cepas de Aeromo n as e n la región J un í n se correlacionan a lo hallado por IMARPE (2008) y Baca (2012). Sin embargo, hasta el momento no se habían reportado Aeromonas en truchas de cultivo en Cajamarca. La presentación del pigmento marrón soluble en TSA observado en una de las cuatro cepas A. salmonicida, descrito por Baca (2012) y Buller (2014), varía por el contenido de triptona y la termolabilidad de la hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, según lo descrito por Qiao et al. (2018).
La segunda fase usó un sistema no automatizado para caracterizar bioquímicamente cepas Aeromonas spp y separarlas por especies, ya que los sistemas automatizados aún no discriminan las especies de Aeromonas con las de Vibrio (Janda y Abbott, 2010; Latif-Eugenín, 2016). Además, las Aeromonas presentan una diversidad genética, bioquímica y antigénica que dificulta su caracterización patogénica (Cipriano, 2001). Así, la diferenciación se basó en la prueba de motilidad (en medio SIM) e indol, ya que A. salmonicida es una bacteria no móvil e indol negativa, todo lo contrario a las Aeromonas móviles, como A. hydrophila. Se diferenciaron cuatro cepas de Junín presuntivas a A. salmonicida y ocho Aeromonas móviles de Cajamarca. Las Aeromo n as móviles reaccionaron variablemente a las pruebas ODC, LDC, LAC, CIT y H2S, lo que sugirió la presencia de A. hydrophila, además de perfiles bioquímicos similares a las cepas patógenas A. veronii y A. bestiarum como los descritos por Abbott et al. (2003), Baca (2012) y Buller (2014).
Latif-Eugenín (2016) menciona que para la caracterización e identificación de Aeromonas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas (ICSP) recomienda un estudio polifásico que incluya estudios de fenotipo, genotipo y, actualmente, estudios filogenéticos. Así, Baca (2012) caracterizó bioquímicamente siete cepas A. salmonicida y una cepa de A. hydrophila de Junín, pero, en el país aún no se ha n identificado bioquímica o molecularmente otras especies de Aeromonas móviles que afectan las truchas arcoíris de cultivo. Así, en el presente estudio se desarrollaron tres protocolos de detección molecular para Aeromonas sp, A. salmonicida y A. hydrophila.
Se emplearon cebadores específicos para la detección molecular de Aeromonas spp (ARNr 16S) y A. hydrophila (gyrB), basándose en el estudio efectuado por Persson et al. (2015). Para el caso de A. salmonicida se amplificó el gen fstA, diseñado por Beaz-Hidalgo et al. (2008), ya que marcadores moleculares como ARNr 16S o gyrB incluso identifican genotípicamente a otras Aeromonas (Beaz-Hidalgo et al., 2013a). La secuenciación de los productos del PCR y el análisis BLAST (NCBI) confirmaron las cepas A. salmo ni c i da y Aeromonas spp, presentando una similitud de 9 8-1 00 %, mientras la cepa B11 A. hydrophila de Cajamarca demostró una identidad de 95.6% con Aeromonas hydrophila subespecie dhakensis, siendo porcentajes de identidad aceptables, como se indica en los estudios de Martínez-Murcia et al. (2009) y Latif-Eugenín (2016).
Este estudio utilizó cebadores para identificar las principales Aeromonas patógenas que afectan la truchicultura, como lo describe Cipriano (2001), Noga (2010) y Baca (2012). Para esclarecer la divergencia genética a nivel intraespecie o interespecie de A. hydrophila y de otras Aeromonas móviles, Martínez-Murcia et al. (2011) recomiendan el empleo de genes como gyrB (empleado en este estudio), rpoD, recA, dnaJ, gyrA, dnaX y atpD. Así, Beaz-Hidalgo et al. (2013b) y Colston et al. (2014) empleando estudios filogenéticos reclasificaron A. hydrophila subsp. d hakensis en A. dhakensis (estrechamente relacionado a A. hydrophila). Chen et al. (2016) indican que este microorganismo se distribuye en ambiente s acuáticos de área s tropicales y subtropicales, aislado de muestras de peces y humanos enfermos, demostrando una marcad a virulencia para el desarrollo de bacteriemias e infecciones clínicas, descripciones que se asocian a la cepa aislada en Cajamarca.
Las siete cepas de Aeromonas móviles (identificadas como Aeromonas sp) presentaban perfiles bioquímicos similares a las cepas patógenas A. veronii y A. bestiarum. Esto se conjetura por las diferencias en las pruebas bioquímicas: ODC positivo y LAC negativo como presuntivo a A. veronii mientras LAC positivo y H2S positivo como presuntivo a A. bestiarum, de acuerdo con lo descrito por Buller (2014). La idea de una infección natural ocasionada por distintas especies de Aeromonas es descrita por Baca en Junín (2012) y se ve reforzada por las descripciones de coinfección en peces de cultivo realizadas por Koziñska y Pekala (2012) y por Zepeda-Velásquez et al. (2015), quienes identificaron molecular e histopatológicamente A. salmonicida, A. hydrophila y A. veronii cohabitando e infectando truchas arcoíris de cultivo con signos clínicos de enfermedad.
El elevado aislamiento de colonias gramnegativas en medio TSA (42/60) se debió a Yersinia ruckeri, enterobacteria de frecuente presentación en la truchicultura del Perú, causante de yersiniosis («enfermedad de la boca roja») que genera signología similar (melanosis, esplenomegalia, hepatomegalia y hemorragias multifocales) y ha sido reportada en diversos estudios (Fernández, 2011; Sierralta, 2011; Sirvas et al., 2011). Así, en la casuística del Laboratorio de Ictiopatología (FMV-UNMSM) se ha identificado Y. ruckeriademás de Flavobacterium psychrophilum, causante de la enfermedad bacteriana del agua fría, ambas con signología similar; de allí que debe efectuarse el diagnóstico diferencial con estas enfermedades bacterianas, la caracterización por bioquímica y la identificación molecular.
Para concluir, el estudio demostró que distintas especies de Aeromonas causan aeromoniasis en truchas arcoíris en una misma piscigranja, y que puede existir infecciones mixtas, especialmente con Yersinia ruckeri, tornándose un problema sanitario relevante que afecta a la incipiente y poco tecnificada truchicultura nacional. Se precisan más estudios que identifiquen molecularmente, e incluso filogenéticamente, las especies de Aeromonas que afectan el desarrollo de la acuicultura peruana, en especial Aeromonas patógenas de truchas arcoíris.
CONCLUSIONES
Aeromonas salmonicida está presente en las piscigranjas de Junín mientras Aeromonas hydrophi la sub especie dhakensis, en las de Cajamarca. Ambas bacterias causan signología asociada a aeromoniasis en las truchas arcoíris juveniles y se presentan en baja frecuencia.
Se detecta la presencia de otras especies de Aeromonas móviles, distintas a A. hydrophila, en las piscigranjas de Junín y Cajamarca; las cuales están involucradas en el desarrollo de aeromoniasis en truchas arcoíris juveniles y se presentan en baja frecuencia.