INTRODUCCIÓN
E. coli es un comensal que coloniza el intestino del hombre y animales pocas horas después del nacimiento y, aunque forma parte de la microbiota normal, algunas cepas pueden ser patógenas (Cardozo et al., 2012). Ha sido demostrado ampliamente que las infecciones en el humano son mayormente a consecuencia del consumo de alimentos contaminados (Padola et al., 2002; Peng et al., 2019).
La serotipificación constituye un importante complemento en el estudio bacteriano, y desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geográficas. También es de utilidad para el estudio de brotes, así como para conocer la fuente de infección y vías de transmisión (Hakim et al., 2017; Peng et al., 2019). Este procedimiento ha permitido identificar comportamientos epidemiológicos de las cepas de E. coli en base a la presencia de los antígenos somáticos de la pared celular (O) y los flagelares (H) . Se conoce la existencia de 185 grupos de antígenos somáticos (O), denominados desde 01 a 0185 y se reconocen 56 grupos de antígenos flagelares (H), denominados H1 a H56 (Lazo et al., 2009; Hakim et al., 2017).
Reuben et al. (2003) reportaron el serotipo O157:H7 en el 3% de muestras de carne de pollo de mercados en Costa Rica, Treviño et al. (2009) reportaron la presencia de E. coli O157:H7 en el 5% de muestras de carne fresca en México, mientras que Zamudio et al. (2011) reportaron 4 cepas positivas para E. coli O157:H7 y 2 para E. coli O157 en el Perú. Asimismo, otros estudios en el país han demostrado la presencia de patotipos de E. coli potencialmente patógenos (Mora et al., 2007; Carranza et al., 2012; Méndez et al., 2013; Morales et al. , 2017).
Los cuadros producidos por E. coli enterotoxigénica (ETEC) son los que aparecen con mayor frecuencia asociados a la diarrea aguda en niños en países en desarrollo y a la diarrea del viajero en adultos visitantes de áreas endémicas (Bueris et al., 2007). Los niños menores de 2 años son la población infantil con mayor susceptibilidad a la infección, y de ellos, la mayor prevalencia se ha observado en lactantes hasta seis meses (Vidal et al., 2007). Estos patógenos son frecuentemente asociados con la ingestión de alimentos contaminados con el patógeno (Seo et al., 2016).
Los serotipos con mayor porcentaje de aislamientos son O6:H16, O8:H9, O9:H21 (Beatty et al., 2006). El serotipo más detectado es O142:H34 (Bueris et al., 2007) y pertenece a E. coli enteropatógena (EPEC). El serotipo O157:H7 está relacionada al patotipo E. coli productor de toxina Shiga (STEC) (Lim et al., 2010). El serotipo de mayor impacto clínico es O157:H7; sin embargo, otros serotipos no-O157 como O26:H11, O55:H7, O55:H10, O111:H8 y O111:H30 pueden provocar infección intestinal y SUH (Prado et al., 2008).
El presente estudio tuvo por objetivo identificar y serotipificar cepas aisladas a partir de manos de vendedores, tablas de picar y mesas de expendio de puestos de venta de carne de pollo de un mercado de Lima, Perú.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de Estudio y Muestras
El estudio se desarrolló en un Mercado Cooperativo del distrito de San Juan de Miraflores, en Lima. La toma de muestra fue realizada en 50 puestos de venta de carne de pollo en marzo del 2013 (Lucas et al.., 2016). Se realizaron hisopados de la superficie de las manos de los trabajadores, de las tablas de picar y de las mesas de expendio, siendo un total de 150 muestras. Las muestras fueron transportadas en medio de transporte bacteriano Stuard (Merck), en condiciones de refrigeración (4 °C, aproximadamente) al laboratorio de microbiología de la Universidad Científica del Sur, Lima. Estas cepas aisladas e identificadas como E. coli fueron conservadas en agar tripticasa de soya (TSA), para su envío al laboratorio de bacteriología de la Universidad Nacional Autónoma de México donde fueron serotipificadas.
Identificación Bacteriana
La identificación de E. coli se realizó por el método microbiológico convencional (MINSA, 2005). Para esto, se hizo un enriquecimiento de la muestra en caldo tripticasa de soya (TSB) por 18-24 h a 37 °C, y aislamiento en agar McConkey por 18-24 h a 37 °C, reconociendo las colonias lactosa positiva, y la posterior identificación por bioquímica convencional descrita por Lucas et al. (2016). Las cepas positivas a E. coli, se almacenaron en tubos con agar tripticasa de soya (TSA).
Serotipificación
La identificación serológica (serotipificación) de las cepas aisladas de E. coli se realizó siguiendo el procedimiento descrito por Orskov y Orskov (1984). Se utilizaron antisueros producidos en modelos de conejo, usándose 182 antisueros frente a los antígenos somáticos (O) y 56 antisueros frente a los antígenos flagelares (H) (SERUNAM, México DF). Para la expresión de los resultados se empleó la fórmula de antígeno somático y flagelar (O:H).
La primera fase de la serotipificación de antígenos somáticos de E. coli presenta cuatro etapas: En la etapa I se preparan los medios de cultivo y dilución bacteriana, y se llevan a temperatura ambiente. En la etapa II, se preparan los antígenos somáticos, se identifica la colonia resultante como E. coli y se siembra por pareado (tubo de trabajo y de control) en tubos con agar TSA por 24 h a 37°C. Se añade 10 ml de solución salina 0.85% y la suspensión bacteriana se transfiere a otro tubo de ensayo y se calienta con vapor de agua durante 1 h para la liberación del antígeno somático (O). Una vez enfriado, se conserva con una solución de formalina al 0.06% (Merck). En la etapa III, la solución se resuspende y se homogeniza las diluciones, se pipetea 50 µl de los antisueros somáticos (186 grupos de antígenos somáticos [O], denominados desde 01 a 0186), y 50 µl de los antígenos somáticos, y se incuba a 50 °C por 24 h. En la etapa IV se hace la lectura del resultado, donde se considera positivo si se encuentra un precipitado en el fondo del pozo (unión antígeno-anticuerpo).
En la segunda fase se realiza la titulación de reacción con antisueros cuando hay reacción cruzada. Se efectúa a través de las diluciones 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400 y 1: 12 800 del antisuero en solución salina al 0.85%. En caso continuaran las reacciones cruzadas, se utilizan los sueros puros realizando diluciones de 1:50 hasta 1:6400.
Para la serotipificación de antígenos flagelares (H), las cepas aisladas se inocularon en TSA semisólido con tubo Durham e incubadas a 30 °C hasta por 15 días, esperando observar la turbidez respectiva. Del cultivo de cepas móviles se toma una azada y se inoculó en 5 ml de caldo biotriptasa (Merck) al 2%, llevándose a incubación (30 °C durante 24 horas). Al final, se le agregó formaldehido al 0.06%.
La reacción de aglutinación se desarrolla con 50 µl de los sueros específicos y 50 µl del antígeno flagelar e incubada a 50 °C por 3 horas. En caso de observarse reacciones cruzadas se enfrentaron a diluciones de sueros anti-H desde 1:100 hasta 1:12 800, y luego contra sueros puros en diluciones desde 1:50 hasta 1:6400.
RESULTADOS
En el presente estudio se aisló 42% (63/ 150) de cepas positivas para E. coli de un total de 150 muestras, de las cuales se logró mantener viables a 58 cepas, las que fueron incluidas en el proceso de serotipificación. De allí se identificaron 40 serotipos, siendo los de mayor frecuencia O6:H10 (10.3%, 6/58), O105abH30 (8.6%, 5/58) y O62:H10 (6.9%, 4/58) (Cuadro 1).
De las manos de los trabajadores se hallaron 20 muestras positivas para E. coli y se identificaron 14 serotipos, en la tabla de picar se encontraron 19 muestras positivas y se identificaron 17 serotipos, y en la mesa de expendio se encontraron 18 muestras positivas y se identificaron 15 serotipos (Cuadro 2). Manos y tabla tuvieron en común el serotipo O6H10 mientras que en manos y mesa de expendio fueron los serotipos O62H10 y O105abH30.
DISCUSIÓN
En el presente estudio se serotipificaron 58 cepas de E. coli, identificándose 40 serotipos (Cuadro 2), las cuales representan riesgos diversos para la salud pública. Esta diversidad de serotipos puede deberse a que la contaminación a nivel de centros de expendio presenta diversas vías, tales como deficiencias en la manipulación de las carcasas, la manipulación de billetes y monedas, ausencia de guantes o mascarillas, pollos sin eviscerar, inadecuada refrigeración, y el comercio mixto de otros alimentos como verduras, entre otros (Lucas et al., 2016).
Los serotipos de mayor frecuencia fueron O6:H10 (10.3%), O105abH30 (8.6%) y O62:H10 (6.9%), estando presentes la mayoría de los demás serotipos en una sola muestra (1.7%; Cuadro 1). Morales et al. (2017) reportan 46 serotipos, siendo los más frecuentes O8:H8, O105ab:H8, y O22:H1 a partir de muestras de hisopados rectales de alpacas; Hakim et al. (2017) reportan cuatro serogrupos O78 (10.3%), seguidos de O125 (4 aislamientos, 6.9%), además de O158 (3 aislamientos, 5.2%) y un aislado O8 (1.7%), mostrando la diversidad de los aislados; en tanto que Méndez et al. (2013) en un estudio en 195 muestras de carne fresca molida de bovino provenientes de tres centros de abasto reportó 87.2% de muestras positivas para E. coli, donde el 1.5% presentó el serotipo O157:H7. En el presente estudio, la baja frecuencia de muestras positivas y la ausencia de serotipos de alta patogenicidad no permite caracterizar a un brote epidémico con presencia de serotipos como contaminantes, sino a errores en las buenas prácticas de manufactura o circulación de patógenos oportunistas. Estos reportes muestran el papel que pueden jugar estos hospedadores, tejidos o secreciones en la actividad patógena de la E. coli, como amenaza para la población humana (Hakim et al., 2017).
Los resultados muestran una amplia variedad de serotipos, tanto en las manos de los operarios como en las tablas de picar y en las mesas de trabajo (Cuadro 2), lo que demuestra una amplia distribución de serotipos de E. coli, los cuales representan un riesgo potencial para la salud pública. No obstante, los serotipos encontrados en este estudio no son los comúnmente asociados a enfermedades transmitidas por alimentos, probablemente debido a las medidas de higiene realizadas por los trabajadores para evitar la contaminación de la carne de expendio o la potencial emergencia de serotipos antes no reportados relacionados con aves.
No se dispone de otros estudios de serotipificación de E. coli en el Perú realizado en muestras de carne de ave; sin embargo, Morales et al. (2017), a partir de hisopados rectales de alpacas, reportaron 43 serotipos en individuos con diarrea y 35 serotipos en individuos sin diarrea. En Argentina se aisló STEC O157:H7 y no-O157 en muestras de carne molida fresca en áreas de expendio (Jure et al., 2010), así como cepas de STEC O157:H7 en el 1.2% (3/250) de muestras de carne picada y hamburguesas (Martorelli et al., 2017), y STEC O157 en 25.5% (23/90) en muestras de carne y 4.4% (16/363) en muestras inertes (Brusa et al., 2013).
CONCLUSIONES
Los serotipos de E. coli que presentaron mayor frecuencia en manos de los operarios y en las tablas de picar y mesas de trabajo de 50 puestos de venta de carne de pollo en un mercado cooperativo de la ciudad de Lima fueron el O6:H10 (10.34%), O105abH30 (8.6%) y O62:H10 (6.9%), correspondientes a serotipos no-O157.