INTRODUCCIÓN
La maduración y fertilización in vitro de ovocitos y el cultivo y trasferencia embrionaria tiene por finalidad lograr crías de alto merito genético, mejorando así los índices productivos y reproductivos. No obstante, el desarrollo embrionario natural presenta una compleja serie de procesos fisiológicos que son difíciles de replicar in vitro, condicionando de manera significativa la producción de embriones, de allí que solo se logra hasta un 30% para el estadio de blastocisto (López et al., 2007; Ahuja et al., 2009), estadio en que se define la calidad y mayor porcentaje de pérdidas embrionarias (Enrigh et al., 2000; Rizos et al., 2002; Galli et al., 2003, Lonergan et al., 2004).
Fisiológicamente, la fecundación del ovocito se realiza en la región ampular del oviducto, quien proporciona el ambiente biofísico adecuado y los elementos orgánicos e inorgánicos necesarios para la sobrevida y desarrollo. En cambio, la fecundación in vitro (FIV) emplea medios de cultivos enriquecidos, que proveen un ambiente simulado al ovocito maduro y a los espermatozoides, donde pueda darse el proceso de la penetración espermática (Adeoya-Osiguwa y Fraser, 2002; Fraser y Adeoya-Osiguwa, 2001; Gordon, 2003). En consecuencia, la formulación de medios para FIV debe incluir componentes que promuevan la motilidad y capacitación espermática, la fusión de los gametos y el inicio del desarrollo embrionario. Muchos de estos medios para fertilización, como el FERT-TALP, son medios simples, que priorizan condiciones favorables para los espermatozoides, sin considerar los requerimientos para los ovocitos (Nedambale et al., 2006).
A diferencia de los medios tradicionales de fertilización que contienen pocos componentes (FERT- TALP), los medios de maduración como TCM-199, son más apropiados para el desarrollo de ovocitos y embriones (Nedambale et al., 2006). El TCM-199 posee en su composición antioxidantes como glutatión y ácido ascórbico, que juegan un rol importante durante la fecundación, protegiendo al ovocito y espermatozoides del efecto de los radicales libres (Bilodeau et al., 2001). Los radicales libres, como el peróxido de hidrógeno, disminuyen la motilidad de los espermatozoides bovinos (Aitken et al., 1989) y la capacidad espermática para penetrar el ovocito (Aitken et al., 1989; Irvine, 1996). Por ello, en el presente estudio se utilizó el medio de maduración TCM-199 modificado (con adición de gentamicina, piruvato de sodio 0.2 mM y BSA Faty free) en comparación con el medio FERT-TALP en la etapa de fertilización, cultivado en el medio BOEC (células epiteliales oviductal bovino) (Xu et al., 1992) a partir de ovocitos recolectados por aspiración folicular.
MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo experimental se realizó en el laboratorio de Cirugía y Biotecnología Reproductiva de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Hermilio Valdizán, en Huánuco, Perú.
Recolección de Ovocitos
Se recolectaron ovarios, cuernos uterinos y oviductos de vacas criollas beneficiadas en el camal municipal de Huánuco. Los ovarios se colocaron en termos con 1 L de solución fisiológica con albúmina sérica bovina (BSA) y antibiótico (Bovi Flush-Minitube), a una temperatura de 38.5 °C y llevados al laboratorio en un tiempo no mayor a las 4 horas. Los ovarios en el laboratorio fueron lavados empleando la misma solución y mantenidos en baño maría a la misma temperatura. Los ovocitos se obtuvieron por aspiración de folículos de 2-6 mm de diámetro, mediante una jeringa de 10 ml con aguja 21G. El contenido de la aspiración se recuperó en tubos Falcon de 50 ml y se dejó decantar a 38.5 °C en baño maría por 5 minutos. Luego con pipeta Pasteur de vidrio se recuperó el contenido (pellet) del fondo de los tubos y se depositaron en placas Petri temperadas, que contenía una solución Buffer Fosfato Salino (PBS, Gibco) adicionada con 0.3% de albúmina sérica bovina (BSA Fracción V, Sigma) y 50 µg/ml de gentamicina (Sigma).
Selección y Maduración de Ovocitos
Los ovocitos se seleccionaron siguiendo los criterios descritos por Leibfried y First (1979), con cúmulo complejo oophorus (CCO), citoplasma granulado y homogéneo, sin manchas oscuras ni espacios claros (Figura 1A), visualizados con una lupa estereoscópica (Nikon SMZ445). Los ovocitos se maduraron en placas Petri de 60x15 (Falcon) con gotas de 50 µl del medio de maduración TCM-199 (Sigma), en grupos de 13 por gota durante 24 horas. El medio de maduración fue suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado (Sigma), 50 µg/ml de gentamicina (Sigma), 0.2 mM de piruvato (Sigma), 40 mg/ml de FSH (Folltropin), 5 µg/ml de LH (Lutropin) y 1 µg/ml de estradiol 17β (Sigma), siendo la incubación a 38 °C por 24 horas en alta humedad.
Preparación BOEC
Los cuernos uterinos y oviductos fueron transportados en cajas de poliestireno expandido con hielo seco. En el laboratorio, se separaron los ligamentos y tejido adyacente, con una tijera de iris y pinza de disección estéril, dejando libre el oviducto. Para la ex- tracción de las células oviductales, el conducto se colocó sobre una placa de Petri, el extremo de la unión útero-tubárica se sujetó con la pinza y con un portaobjeto estéril se ejerció ligera presión de proximal a distal hasta el infundibulum. Se obtuvo un material de aspecto cremoso-amarillento, que fue introducido en un tubo plástico Falcón de 15 ml con 7 ml del medio TCM-199 enriquecido con 1% de SFB y 50 µg/ml de gentamicina, incubado por 10 min a 38.5°C y lavado por decantación. Este procedimiento se realizó tres veces. Las células oviductales se suspendieron nuevamente en un frasco de cultivo de tejido con 10 ml de TCM-199, enriquecido con 10% de SFB, 50 µg/ml de gentamicina (Sigma), 0.2 mM de priruvato (Sigma), e incubado con 5.5% de concentración de CO2 con alta humedad a 38.5 °C por 48 h. Luego de la incubación, el sobrenadante fue decantado quedando una suspensión que corresponde a las células oviductales. La motilidad de las vesículas era superior al 70%, lo cual fue considerado como un signo de viabilidad y aptas para el cultivo (Ratto et al., 1999).
Preparación de Espermatozoides
Los espermatozoides provinieron de pajuelas de semen congelado, de un mismo toro con fertilidad comprobada, descongelados en baño maría a 38 °C por 1 min. El semen se colocó en un microtubo de 1 ml, para luego pasar el contenido al tubo de la columna de Percoll, de manera lenta, conservando el orden de la columna. Los gradientes se prepararon según el método Percoll (Parrish et al., 1995). Se centrifugó a 800G por 20 minutos, se extrajo la columna y el pellet se lavó con 5 ml del medio SP-TALP suplementado con 50 µg/ml gentamicina (Sigma), piruvato 1 mM (Sigma) y 6 mg/ml de BSA Fracción V (Sigma). La solución fue centrifugada a 400 G durante 6 min, se extrajo el sobrenadante y el pellet se resuspendió en el medio de fertilización, ya sea FERT-TALP o TCM-199 modificado, a una concentración final para inseminación de 1x106 espermatozoides/ml. Por último, se depositó gotas de 50 µl de la suspensión en placas Petri temperadas a 38.5 °C, con 5.5% de CO2 y alta humedad, para luego ser cubiertos con parafina líquida.
Fertilización de los Gametos in vitro
Posterior a la maduración in vitro, los ovocitos fueron asignados al azar a los medios de fertilización FERT-TALP (tratamiento 1) o TCM-199 modificado (tratamiento 2) y co-incubados con los espermatozoides durante 18 h a 38 °C, CO2 5.5% y alta humedad.
Cultivo de Embriones in vitro con Células Oviductales
Finalizada la co-incubación, los ovocitos fecundados se colocaron en microtubos de 1 ml y fueron denudados mediante agitación en vórtex por 3 min. Los cigotos pelados se cultivaron en microgotas con 50 µl del medio de cultivo TCM-199, suplementado al 10% con SBF inactivado (Sigma), 50 µg/ml de gentamicina, 0.2 mM de piruvato (Sigma) y 1 µl de BOEC durante 8 días en la misma condición de humedad, CO2 y temperatura que el empleado para la fertilización.
Se evaluó la fecundación y desarrollo embrionario in vitro, observando la tasa de segmentación a las 18 y 48 h pos-fecundación, estadio mórula y de blastocisto entre los días 6 y 8. Los blastocistos expandidos fueron evaluados según los criterios descritos por Lindner y Wright (1983). Se analizaron los resultados mediante la prueba no paramétrica de Chi cuadrado (X2) y Z de proporciones, dentro una tabla de contingencia de 2x2, utilizando el software SPSS v. 21.
RESULTADOS
De los 281 ovocitos madurados (Figura 1B), 155 se fertilizaron con el medio FERT-TALP y 126 con el medio TCM-199 modificado. La tasa de clivaje de los ovocitos a las 18 h fue de 25.8% (n=40) en el medio FERT-TALP, mientras que solo 2.4% (n=3) en el medio TCM-199 modificado. Asimismo, a las 48 h pos-fertilización se obtuvo 87.7% (n=136) de clivaje en FERT-TALP, mientras que con el TCM-199 modificado se obtuvo 40.5% (n=51) (Figura 1C), cuyo porcentaje de embriones con 4-8 células fue de 64.5% (n=100) y 26.2% (n=33) respectivamente. Se encontró diferencia significativa (p=0.001) entre medios en ambas etapas.
En el estadio de mórula y blastocisto se obtuvo 10.3% (n=16) y 3.9% (n=6) de embriones, respectivamente, con el medio FERT-TALP (Figura 1D), en tanto que el resultado fue nulo para los embriones cultivados en el medio TCM-199 modificado (p<0.05; Cuadro 1).
DISCUSIÓN
Las frecuencias de obtención de embriones en los estadios de mórula y blastocisto fueron superiores con el medio FERT-TALP en comparación con el medio TCM-199 modificado, en el cual no llegaron a desarrollar los embriones. Estos valores resultan bajos en contraste a los reportados por otros investigadores. Berland et al. (2011) obtuvieron 28.4% de blastocistos usando el medio TALP en fertilización y BOEC en cultivo, en tanto que Ratto et al. (1999) lograron 15.7% con medio de fertilización BO (Brackett y Oliphant) y BOEC para para cultivo embrionario, y Pahuara, mientras que Noveros (2014) obtuvieron 11.6% de blastocistos con medio de cultivo KSOMaa y 17.66% con SOFaa, empleando FERT-TALP en ambos casos para la fertilización. De otra parte, Nedambale et al. (2006) utilizando BO y TCM para la fertilización y SOF (Fluido Oviductal Sintético) para el desarrollo embrionario, lograron una tasa de 16 y 36% de blastocistos, respectivamente.
Si bien es cierto, el porcentaje de blastocitos obtenidos con FERT-TALP fue similar al obtenido por Fernandez et al. (2007) utilizando el medio de fertilización y maduración HTF (Fluido Oviductal Humano) con 10% de suero fetal bovino (SFB), los resultados se encuentran relativamente lejos del 10% mínimo que debería de obtenerse en la maduración de ovocitos in vitro en el estadio de blastocisto (Arav, 2001; Gutiérrez-Adán et al., 2001; Mayes y Sirad, 2001).
Los resultados del estudio, obteniendo 64.5% de embriones de 4 a 8 células en FERT-TALP y 26.6% con TCM-199 modificado, son similares al reportado por Nedambale et al. (2006), quienes mencionan una tasa de 61% con TCM-199 y 60% con medio BO, siendo este último un medio de fertilización convencional empleado en FIV. Asimismo, fue superior en 10.8% a los resultados obtenidos por Berland et al. (2011) utilizando FERT-TALP y evaluando en el mismo tiempo (53.7% embriones de 4-8 células).
La baja producción de embriones hasta el estadio blastocisto se pudo deber a una reducción de las competencia de los ovocitos recuperados de ovarios de bovinos criollos o simplemente esté relacionado a las condiciones del co-cultivo para el desarrollo embrionario (BOEC), el cual no siempre logra proporcionar las condiciones óptimas ni las sustancias moduladoras presentes en el oviducto, necesarios para el inicio del desarrollo del embrión bovino (García et al., 2017); bloqueándose de esta manera el desarrollo temprano, aunque no implica la muerte inmediata del embrión, pero sí constituye un punto de inflexión irreversible en el crecimiento futuro (Valleh et al., 2014). En el caso del bovi- no, el bloqueo en el desarrollo ocurre cuando el embrión pasa de 8 a 16 células (Tarazona et al., 2010), de allí que la tasa de embriones obtenidas de 4 a 8 células fue similar a los reportados por otros autores, pero posterior a esta etapa no se logró el desarrollo deseado.
El TCM-199 modificado, empleado como medio de fertilización y cultivado con BOEC, no logró los resultados esperados, a diferencia de Nedambale et al. (2006), quienes obtuvieron una mayor tasa de embriones, usando el mismo medio y el medio SOF para el desarrollo embrionario.
CONCLUSIONES
Con el medio FERT TALP se obtuvo un mayor porcentaje de clivaje a las 18 y 48 horas pos- fertilización y embriones bovinos de 4 a 8 células en comparación con el medio TCM-199 modificado.
Con el medio de fertilización TCM-199 modificado no se logró desarrollar embriones en etapa de mórula ni blastocisto, mientras que con el medio FERT-TALP se obtuvo 10.3% en estadio de mórula y 3.9 % en blastocisto.