INTRODUCCIÓN

El uso de antibióticos ha sido útil para el control de infecciones bacterianas en el cultivo de peces; sin embargo, producen un impacto negativo en la conformación de la microbiota y la morfología intestinal (^{Shi et al., 2022}). Además, su uso inadecuado supone un riesgo a la salud pública debido a su persistencia en productos alimenticios de origen acuícola, el cual conduce al desarrollo de resistencia antimicrobiana y contaminación ambiental (^{De et al., 2014}; ^{Hasan et al., 2022}).

Una de las alternativas para reducir la dependencia al uso de antibióticos son los probióticos, que en su mayoría son bacterias ácido-lácticas (BAL) (^{Zorriehzahra et al., 2016}). Los mecanismos de acción incluyen la competencia por nutrientes, contribución a la digestión, la regulación positiva de la respuesta inmunológica del huésped y la exclusión competitiva (^{El-Saadony et al., 2021}). Esta última hace referencia a la producción de péptidos antimicrobianos (AMPs) capaces de hacer frente a otras bacterias manteniendo una microbiota balanceada (^{Oulas et al., 2021}).

El género Enterococcus forma parte del grupo de las BAL y contiene 36 especies. Además, forma parte de la microbiota gastrointestinal de animales y algunas de estas son capaces de producir AMPs, motivo por el cual son ampliamente utilizados en la actividad acuícola (^{Ness et al., 2014}; ^{Cui et al., 2017}). Los AMPs actúan sobre la membrana celular, generando su disrupción y posterior lisis, pudiendo además ingresar a la célula y unirse a los ácidos nucleicos y proteínas cruciales para el correcto funcionamiento celular (^{Benfield y Henriques, 2020}).

Para la identificación de los AMPs se utilizan diversas técnicas, entre ellas, la espectrometría de masas (MS) que se caracteriza por su alta rapidez y confiabilidad (^{Girolamo et al., 2013}). Por otro lado, la técnica de ionización/desorción láser asistida por matriz con detección de masas por tiempo de vuelo (MALDI-TOF) se ha utilizado para caracterizar péptidos de diferente origen como microalgas (^{Guzmán et al., 2019}), mucus de peces (^{Okella et al., 2021}) y bacterias potencialmente probióticas (^{Feria Zevallos et al., 2019}). Ante esto, el presente estudio tuvo como objetivo identificar péptidos de interés antimicrobiano a partir de la cepa Enterococcus faecium IP5-2a aislada de la microbiota de tilapia del Nilo mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la extracción de proteínas celulares se cultivó la cepa E. faecium IP2a previamente aislada (^{Castañeda et al., 2018}) en caldo Man Rogosa Sharpe (MRS) a 28 ºC durante 24 h. Se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min, al pellet se le agregó 100 µl de buffer de lisis (1 ml de buffer nativo, 10 µl de lizosima y 1 µl benzonasa/nucleasa), se sometió a ultrasonido por 5 min y se incubó a -20 ºC durante 30 min. Finalmente se centrifugó a 14 000 g y se recuperó 20 µl del sobrenadante.

Para la extracción de proteínas extracelulares, la cepa E. faecium se cultivó en caldo MRS, se centrifugó a 3500 rpm a 4 ºC durante 10 min, el sobrenadante fue pasado por filtros de membrana de 0.22 µm. Posteriormente se agregó 10% de ácido trifluroacético (TFA) y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), dejándose precipitar a -20 ºC por 8 h. El sobrenadante libre de células se centrifugó a 3500 rpm a 4 ºC por 30 min, el pellet obtenido se lavó dos veces con acetona helada y se rehidrató en buffer con 5 M de urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 40 mM Tris-HCl pH 8.5, 1 mM MgCl2, 65 mM DTT, 1 mM PMSF.

Las proteínas extraídas se migraron por electroforesis en gel SDS-PAGE 1D (12%) a 90 V por 2 h. Posteriormente, las bandas de proteínas fueron coloreadas con azul de Coomassie y observadas en un transiluminador de luz blanca. Luego fueron escindidas del gel y colocadas en 100 µl de bicarbonato de amonio 100 mM/acetonitrilo (v:v). Los procesos de decoloración y digestión se realizaron siguiendo el protocolo de ^{Shevchenko et al. (2007}). Finalmente, las muestras fueron depositadas en la placa OPTI-TOF para su análisis por espectrometría de masas.

El análisis de proteínas se realizó mediante un espectrómetro de masas MALDI AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800 (AB Sciex) y los espectros captados en modo MS/MS Reflector Positive con un Láser Nd:YAG de ë a 335 nm, frecuencia 200 Hz. El análisis de datos se realizó mediante el software ProteinPilot^TM, basado en el algoritmo Paragon™ 4.5.0.0 (Matrix Science, Boston, USA) y considerando las condiciones de alquilación con yodoacetamida y la digestión con tripsina. Los péptidos obtenidos del procesamiento por doble fragmentación (MS/MS) fueron analizados en función a sus características de longitud, porcentaje de confianza y valor de expectación en el software ProteinBLAST y ProteinPilot.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados del estudio muestran secuencias de aminoácidos de la cepa Enterococcus faecium IP5-2a relacionadas con péptidos antimicrobianos (Cuadro 1). En coincidencia con ^{Choeisoongnern et al. (2021}), se mostró la capacidad de la bacteria ácido-láctica E. faecium para producir AMPs incluyendo proteínas que participan en su síntesis.

Cuadro 1. Secuencias de aminoácidos identificas por MALDI-TOF/TOF de la cepa Enterococcus faecium IP5-2a 

Se identificaron secuencias de aminoácidos con 99 y 100% de identidad con la proteína SagA (P54 para E. faecium) por el software ProteinPilot y Protein BLAST, respectivamente (Cuadro 1). Así mismo, de los 509 aminoácidos que conforman dicha proteína, se identificaron 36 aminoácidos divididos en dos secuencias que representan el 7% del total (Figura 1A). De manera similar, ^{Roy et al. (2015}) lograron identificar el 30% de aminoácidos de la proteína P54 mediante LCMS/MS en E. faecium. Por su parte, ^{Paganelli et al. (2015}) la determinaron como la proteína más abundante en el sobrenadante de E. faecium formador biofilm. Esta proteína pertenece a la familia NlpC/60 y está relacionada a la pared celular de E. faecium, tiene la capacidad de hidrolizar la pared celular, inhibir la expresión de genes de virulencia de patógenos, modular indirectamente la microbiota intestinal, así como mejorar la función de barrera e inmunidad intestinal (^{Roy et al., 2015}; ^{Kim et al., 2019}).

Figura 1. Análisis bioinformático de secuencias de aminoácidos identificadas. A: Secuencias identificadas (en rojo) que hacen «match» con la secuencia de aminoácidos de la proteína P54; B: estructura tridimensional del dominio hidrolasa de peptidoglucano de la proteína SagA (P54) (morado) y en amarillo la región de residuos de aminoácidos que hacen «match» con la secuencia de aminoácidos de la proteína SagA (P54) 

Una segunda secuencia tuvo un 77% de identidad con una proteína similar a bacteriocina (BLPs) (Cuadro 1). Estas contribuyen a la funcionalidad de los probióticos de tres maneras, como péptidos colonizadores que facilitan la competición bacteriana, péptidos de destrucción que eliminan patógenos de manera directa y péptidos de señalización a través de otras bacterias o del sistema inmune (^{Dobson et al., 2012}). Además, se identificó una tercera secuencia como lantibiótico con una identidad del 99% (Cuadro 1). ^{Sawa et al. (2012}) aislaron y caracterizaron un lantibiótico (enterocin W) con gran actividad inhibitoria producido por E. faecalis, sugiriendo su utilidad en diferentes industrias.

Se identificó una secuencia perteneciente a RNAase J family beta-CASP ribonuclease con una identidad del 100%, similar a los reportados por ^{Sánchez et al. (2017)}, quienes la identificaron en el sobrenadante de BAL aisladas del sistema digestivo de lechón, Estos autores la describieron como un péptido con acción enzimática frente a bacterias patógenas; sin embargo, ^{Bugrysheva y Scott (2010}) la describen como una endo y exo ribonucleasa con participación en la degradación y regulación del ARN mensajero (ARNm) y como componente esencial para el crecimiento de las bacterias.

Por lo tanto, se concluye que las secuencias de aminoácidos detectadas por MALDI TOF/TOF de la cepa Enterococcus faecium IP5-2a son altamente homólogas a proteínas con capacidad antagónica resaltando la proteína SagA (P54) y bacteriocinas, sugiriendo su uso como potencial probiótico en la acuicultura.