INTRODUCCIÓN
El selenio es un oligoelemento esencial para la salud humana y en los últimos años, se han reconocido gradualmente sus beneficios para la salud1. La deficiencia del nutriente selenio provoca con frecuencia la incidencia de diversos trastornos, como diabetes, la enfermedad de Keshan, disfunción tiroidea y limitación cognitiva2.
El selenio existe en el cuerpo humano en forma de selenoproteínas, que pueden derivarse del selenio orgánico o inorgánico ingerido. El selenio orgánico (principalmente selenometionina) y el selenio iónico (p. ej., selenito y selenato) son altamente biodisponibles, pero el selenio elemental es difícil de absorber por el tracto gastrointestinal a menos que sea de tamaño nanométrico3. El selenio orgánico de los alimentos es relativamente seguro para el cuerpo humano, mientras que el inorgánico complementado con productos químicos exhibe una ventana estrecha desde el efecto terapéutico hasta el efecto tóxico4. Una vez absorbido en el sistema circulatorio, el selenio se unirá con varias proteínas in vivo para formar complejos Se/proteína, es decir, selenoproteínas, para ejercer las acciones fisiológicas. Sin embargo, los residentes en el área que carece de selenio tienen dificultad para asimilar suficiente selenio natural de la dieta diaria, por lo tanto, se producen algunas enfermedades asociadas con la deficiencia de selenio5,6,7,8,9. Para estas personas, la suplementación con selenio se convierte en una medida crucial que debe llevarse a cabo. Actualmente, el selenio no solo se utiliza como suplemento nutricional para la prevención y el tratamiento de enfermedades, sino que también se aplica para la administración de fármacos en forma de nanopartículas para potenciar las terapias transportadas. A menudo se complace en anticipar un efecto sinérgico que se produce entre el selenio y la carga útil10,11.
En el desarrollo de un producto farmacéutico es necesario utilizar un método analítico especifico que permita cuantificar el principio activo en una formulación, y para asegurar su confiabilidad es necesario validarlo12,13,14. Esta validación consiste en determinar diversos parámetros, que van a depender de la categoría a la que pertenezcan 15,16. Diversos organismos reguladores como la Food and Drug Administration (FDA), Agencia Nacional de vigilancia Sanitaria (ANVISA), Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS), así como las referencias The United States Pharmacopeia (USP), International Conference on Harmonisation (ICH) y Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI), exigen y recomiendan la validación como requisito para el cumplimiento de la Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL)15. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) posee diversas aplicaciones y por ser una técnica automatizada permite analizar de forma rápida y eficiente la separación, cuantificación y detección de las muestras por medio de la identificación de picos en los cromatogramas, que se pueden optimizar mediante el ajuste de múltiples variables en el método (pH de la fase móvil, concentración del buffer, flujo, temperatura de la columna, longitud de onda del detector, etc.)17,18,19,20,21,22. Al obtener un método rápido y confiable, puede ser aplicado en uso rutinario en el análisis de control de calidad y determinación de la estabilidad del medicamento23,24,25,26,27,28. En la presente investigación se tiene como objetivo establecer un método analítico por cromatografía liquida de alta resolución para la cuantificación de selenio en cápsulas blandas y para ello establecer parámetros de validación que permitan tener la confiabilidad para el uso rutinario en la determinación de calidad de medicamentos.
PARTE EXPERIMENTAL
Reactivos: Se utilizó 2,3 diaminonaftaleno de Merck (Darmstadt, Alemania), ácido clorhídrico 37% de Merck (Darmstadt, Alemania), Cloruro de sodio de Merck (Darmstadt, Alemania), Selenio solución patrón de Merck (Darmstadt, Alemania), Sodio Selenato de DC Fine Chemicals (London, United Kingdom) y acetonitrilo de Merck (Darmstadt, Alemania)
Condiciones cromatográficas: Como fase móvil se utilizó una solución filtrada y desgasificada de Acetonitrilo y Agua purificada en proporción de 86:14. La columna cromatográfica utilizada fue L1 Octadecil silano de 300 mm x 3,9 mm x 10 µm, el detector UV a 330 nm, la temperatura del horno a 30 ºC, el volumen de inyección de 100 µL, la velocidad de flujo de 0,9 mL/minuto, el tiempo de retención del pico principal es de 6,0 minutos y el tiempo de cada corrida es de 10 minutos.
Preparación de estándar: Se utilizó un estándar de referencia de solución patrón certificada de 1000 ppm de Selenio, a partir de esta se preparó otra transfiriendo una alícuota de 4 mL a una fiola de 200 mL, luego llevar a volumen con ácido clorhídrico 0.1 N y homogeneizar. Luego transferir 5.0 mL a un vaso de precipitación de 250 mL a una concentración aproximada de 0,40 µg/mL. Luego se realizará el proceso para la formación del Complejo.
Preparación de la muestra: Se utilizó una cantidad de muestra equivalente a 1000 µg de Selenio en un matraz volumétrico de 1000 mL y se llevó a volumen con agua purificada. Luego se transfirió 20 mL a una fiola de 50 mL para diluir a volumen con agua purificada a una concentración aproximada de 0,40 µg/mL. Luego se realizará el proceso para la formación del Complejo.
Formación del complejo: Se utilizaron 3 mL de las soluciones estándar y muestra a una fiola de 25 mL para agregarles 5 mL de una solución de 2,3 diamino naftaleno (concentración de 4 mg/mL en ácido clorhídrico). Luego se llevó a volumen con acido clorhídrico. El complejo es estable por un periodo de 4 horas.
Determinación de algunos parámetros de validación
Especificidad: Para la determinación de posibles interferencias, se analizó el placebo con el principio activo al 100% y se determinó el grado de interferencia con respecto al análisis del principio activo con y sin placebo debiendo obtener resultados ± 2 % del teórico. En la determinación de interferencias de productos de degradación, se expusieron tanto placebo muestra y principio activo a diferentes tipos de estrés como luz UV, calor a 80°C por 24 horas, hidrolisis acida por 2 horas a 80°C, hidrolisis alcalina por 2 horas a 80°C, oxidación con peróxido al 30% por 2 horas.
Exactitud: Para determinar este parámetro se utilizaron se prepararon soluciones con placebo enriquecida con principio activo para tres niveles al 75%, 100% y 125%.
Precisión: En la repetibilidad se evaluaron 6 muestras independientes. Para la precisión intermedia un segundo analista lo analizó usando el mismo método analítico en diferentes equipos cromatográficos.
Robustez: Se consideraron tres muestras del análisis de repetibilidad como análisis inicial las cuales estuvieron 24 horas a temperatura ambiente y luego se volvió a analizar con un estándar preparado recientemente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para la evaluación de la especificidad se consideraron las posibles interferencias originadas en la muestra debido al estrés forzado sometido por fotolisis y termólisis, se encontraron los siguientes resultados según tabla 1.
Especificidad | Muestra | Selenio | ||||
Añadido (mg) | Hallado (mg) | Promedio hallado (mg) | % Recuperación | |||
Determinación de posibles interferentes | Placebo | Pb1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
Pb2 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | |||
Principio activo + placebo | M1 | 1,07 | 1,08 | 1,07 | 101,36% | |
1,06 | ||||||
M2 | 1,1 | 1,12 | 1,13 | |||
1,13 | ||||||
Fotólisis | Placebo | Pb1 | 0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
0,00 | ||||||
Pb2 | 0 | 0,00 | 0,00 | |||
0,00 | ||||||
Principio activo | PA 1 | 1,08 | 1,07 | 1,07 | 99,06 | |
1,07 | ||||||
PA2 | 1,04 | 1,02 | 1,03 | |||
1,04 | ||||||
Principio activo + Placebo | M1 | 1,06 | 1,06 | 1,05 | 99,53 | |
1,04 | ||||||
M2 | 1,05 | 1,04 | 1,05 | |||
1,06 | ||||||
Termólisis | Placebo | Pb1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
0,00 | ||||||
Pb2 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | |||
0,00 | ||||||
Principio activo | PA1 | 1,02 | 1,03 | 1,03 | 100,94 | |
1,03 | ||||||
PA2 | 1,1 | 1,11 | 1,11 | |||
1,12 | ||||||
Principio activo + Placebo | M1 | 1,06 | 1,06 | 1,06 | 100,95 | |
1,05 | ||||||
M2 | 1,05 | 1,08 | 1,07 | |||
1,05 |
Pb: placebo PA: principio activo M: muestra
En la tabla 2 se muestran los resultados del ensayo de Especificidad en Selenio capsulas blandas sometidas a estrés forzado por hidrólisis acida, hidrolisis alcalina y estrés oxidativo.
Especificidad | Muestra | Selenio | ||||
Añadido (mg) | Hallado (mg) | Promedio hallado (mg) | % Recuperación | |||
Hidrólisis ácida | Placebo | Pb1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
Pb2 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | |||
Principio activo | PA1 | 1,03 | 1,01 | 1,03 | 99,06 | |
1,04 | ||||||
PA2 | 1,06 | 1,04 | 1,04 | |||
1,04 | ||||||
Principio activo + placebo | M1 | 1,03 | 1,02 | 1,02 | 98,13% | |
1,01 | ||||||
M2 | 1,08 | 1,06 | 1,05 | |||
1,04 | ||||||
Hidrólisis alcalina | Placebo | Pb1 | 0,00 | 0,00 | 0,0 | 0,00 |
0,00 | ||||||
Pb2 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | |||
0,00 | ||||||
Principio activo | PA 1 | 1,07 | 1,08 | 1,07 | 99,52 | |
1,06 | ||||||
PA2 | 1,04 | 1,02 | 1,03 | |||
1,03 | ||||||
Principio activo + Placebo | M1 | 1,03 | 1,02 | 1,02 | 100,46 | |
1,01 | ||||||
M2 | 1,06 | 1,07 | 1,08 | |||
1,09 | ||||||
Oxidación | Placebo | Pb1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
0,00 | ||||||
Pb2 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | |||
0,00 | ||||||
Principio activo | PA1 | 1,02 | 1,04 | 1,04 | 100,98 | |
1,03 | ||||||
PA2 | 1,05 | 1,04 | 1,05 | |||
1,06 | ||||||
Principio activo + Placebo | M1 | 1,04 | 1,05 | 1,05 | 100,98 | |
1,06 | ||||||
M2 | 1,01 | 1,03 | 1,02 | |||
1,00 |
Pb: placebo PA: principio activo M: muestra
En la tabla 3 se muestran los resultados de la evaluación del parámetro de Exactitud del método, para lo que se elaboraron 3 concentraciones en un rango de trabajo establecido para luego analizar los porcentajes de recuperación obtenidos y demostrar de esta forma si el método cumple con los criterios para demostrar su exactitud.
Concentración | Muestras | Selenio añadido (mg) | Selenio hallado (mg) | Promedio Selenio hallado (mg) | Recuperación % |
75% | M1 | 0,77 | 0,77 | 0,78 | 101,3 |
0,78 | |||||
M2 | 0,75 | 0,74 | 0,74 | 98,67 | |
0,73 | |||||
M3 | 0,78 | 0,78 | 0,79 | 101,28 | |
0,79 | |||||
100% | M1 | 1,02 | 1,03 | 1,03 | 100,98 |
1,03 | |||||
M2 | 1,06 | 1,07 | 1,06 | 100 | |
1,08 | |||||
M3 | 1,03 | 1,04 | 1,05 | 101,94 | |
1,05 | |||||
125% | M1 | 1,24 | 1,24 | 1,25 | 100,81 |
1,25 | |||||
M2 | 1,25 | 1,24 | 1,24 | 99,2 | |
1,23 | |||||
M3 | 1,25 | 1,26 | 1,27 | 101,6 | |
1,27 | |||||
Promedio: | 100,64% | ||||
Desviación Estándar Relativa: | 1,05 | ||||
Coeficiente de Variación (%): | 1,04% |
En la tabla 4 se muestran los resultados del parámetro Precisión del método y para ello se evaluó la repetibilidad de los resultados del análisis en las mismas condiciones de seis muestras y la precisión intermedia utilizando el mismo método realizado por diferentes analistas calificados.
Analista 1 | | | Analista 2 | | | |
---|---|---|---|---|---|---|
Muestras | Selenio mg/cap | Promedio selenio mg/cap | % | Selenio mg/tab | Promedio selenio mg/cap | % |
M1 | 1,02 | 1,02 | 102 | 1,03 | 1,03 | 103 |
| 1,01 | | | 1,03 | | |
M2 | 1,03 | 1,03 | 103 | 1,02 | 1,02 | 102 |
| 1,03 | | | 1,01 | | |
M3 | 1,04 | 1,04 | 104 | 1,03 | 1,03 | 103 |
| 1,03 | | | 1,02 | | |
M4 | 1,04 | 1,03 | 103 | 1,01 | 1,03 | 103 |
| 1,02 | | | 1,05 | | |
M5 | 1 | 1,01 | 101 | 1,02 | 1,02 | 102 |
| 1,01 | | | 1,02 | | |
M6 | 1,03 | 1,02 | 102 | 1 | 1,01 | 101 |
| 1,01 | | | 1,02 | | |
| | Promedio: | 102,50% | | Promedio: | 102,30% |
| | RSD: | 0,96 | | RSD: | 0,75 |
| | C.V. (%): | 0,93% | | C.V. (%) | 0,73 |
Promedio analista 1 y 2: | | | | | | 102,40% |
RSD del analista 1 y analista 2: | | | | | | 0,86 |
C.V. (%) del analista 1 y analista 2: | | | | | | 0,83% |
C.V.: coeficiente de variación RSD.: desviación estándar relativa M: muestra
En la tabla 5 se puede observar los resultados del parámetro de Robustez del método evaluando una misma muestra en condiciones de almacenamiento de refrigeración después de 24 horas, analizados frente a estándares recientemente preparados con iguales condiciones y lograr determinar si el método cumple con el parámetro requerido.
Muestra | Inicio | | | Final (después de 24 horas refrigerado) | | | |
---|---|---|---|---|---|---|---|
| Selenio mg/cap. | Promedio selenio mg/cap. | % (y0) | Selenio mg/cap. | Promedio selenio mg/cap. | % (y1) | Diferencia ly1 - y0l |
M1 | 1,03 | 1,03 | 103 | 1,02 | 1,03 | 103 | 0 |
| 1,03 | | | 1,03 | | | |
M2 | 1,01 | 1,01 | 101 | 1,03 | 1,02 | 102 | 1 |
| 1 | | | 1,01 | | | |
M3 | 1,04 | 1,04 | 104 | 1,02 | 1,03 | 103 | 1 |
| 1,03 | | | 1,03 | | | |
| Promedio | 1,03 | 102,7 | Promedio | 1,03 | 102,67 | |
| RSD | 0,01 | 1,25 | RSD | 0,004 | 0,47 | |
| C.V. (%) | 1,21% | 1,21% | C.V. (%) | 0,46% | 0,46% | |
Promedio de inicio y final (después de 24 horas refrigerado): | | | | | | | 102,69% |
RSD de inicio y final (después de 24 horas refrigerado): | | | | | | | 0,86 |
C.V. (%) de inicio y final (después de 24 horas refrigerado): | | | | | | | 0,84% |
C.V.: coeficiente de variación RSD.: desviación estándar relativa M: muestra
En las Tablas 1 y 2 que reflejan los ensayos para verificar la especificidad del método ante los diferentes agentes que generan un estrés forzado, se puede observar que no tuvo un impacto considerable en los resultados obtenidos y además no presenta interferencias con el pico de principio activo en evaluación selenio. Siendo el resultado de variación menor al 2 % encontrándose dentro de lo sugerido por la AEFI16 para el caso de una validación de método analítico.
En la Tabla 3 se puede observar que el resultado promedio del porcentaje de recuperación del parámetro de exactitud es de 100,64 %, con un Coeficiente de Variación de 1,05 %. Podríamos decir que estos resultados se encuentran dentro de lo recomendado por AEFI16 ya que tienen como criterios de aceptación para la recuperación valores entre 98,0 - 102,0 % y en referencia al coeficiente de variación tomamos lo señalado por la USP NF 202212 que debe ser menor a 2 %.
En la evaluación del parámetro de robustez se determinó la estabilidad de la muestra después de 24 horas en refrigeración, la misma que evidenció que a la muestra no sufre cambios con el método analítico y no afectan la reproducibilidad de los resultados, siendo el porcentaje de Coeficiente de Variación C.V. (%) de 0,84 %
CONCLUSIONES
Se logró establecer parámetros de validación sobre un método analítico para cuantificar selenio en cápsulas blandas por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con una adecuada separación, una pureza de pico cromatográfico de 99,98 % para el pico del estándar y 99,96 % para el pico de la muestra, para lo cual se utilizó una columna cromatográfica de L1 (Octadecil silano), 300 mm x 3,9 mm x 10 µm. Se estableció un tiempo de retención de 6,0 minutos aproximadamente para el pico principal, a una longitud de onda de 330 nm, y con un volumen de inyección de 100 µL. El flujo se estableció en 0,9 mL/minuto. Se determinaron algunos parámetros importantes de validación de un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), demostrando que es especifico, después de determinar las interferencias una vez sometida a estrés. La precisión se determinó con una repetibilidad y precisión intermedia que tiene un Coeficiente de Variación (C.V.) menor al 2 %. La exactitud mostró un porcentaje de recuperación de 100,64 % y la robustez con un coeficiente de variación de 0,84 % después de 24 horas.