INTRODUCCIÓN
El Allium-test constituye uno de los modelos biológicos donde se puede determinar con alta precisión el efecto citotóxico y genotóxico de diferentes sustancias. Hoy en día se conocen los parámetros del desarrollo celular de Allium cepa L. (Amaryllidaceae), constituyendo un excelente modelo biológico para detectar variaciones de sus índices (Rodriguez et al., 2018). Al exponer a hidratación un bulbo de "cebolla" se estimula el crecimiento del tejido meristemático radicular; pero cuando se expone al bulbo en presencia de sustancias orgánicas o inorgánicas tóxicas la división celular de los meristemos radiculares puede inhibirse, ya sea retardando el proceso de mitosis o destruyendo las células (Correa et al., 2016).
Las alteraciones de la división celular generalmente se asocian al bajo crecimiento de la raíz, pero sobre todo a la alteración del desarrollo normal del tejido meristemático radicular que se puede comprobar con el diagnóstico microscópico, para establecer el índice mitótico e índice de aberraciones cromosómicas presentes (Kumari et al., 2009). A. cepa L. al presentar pocos cromosomas (2n=16) facilita la evaluación de los posbiles daños y/o alteraciones cromosómicas en el ciclo de la división celular (Correa et al., 2016; Rodriguez et al., 2018).
Cuando las células del tejido meristemático de A. cepa se encuentran en equilibrio proliferativo, la duración de cada uno de los períodos del ciclo celular permanece constante; de esta forma, el número de células que están en una fase determinada es también constante y proporcional a la duración en tiempo de la misma; pero cuando se lleva a cabo en presencia de sustancias de desconocido efecto, la división celular de los meristemos radiculares puede inhibirse o acelerarse (Correa et al., 2016; Kumari et al., 2009).
La nanociencia se define como el estudio de los fenómenos y la manipulación de materiales a escala nanométrica, abarcando el diseño, caracterización y aplicación de estructuras, dispositivos y sistemas complejos mediante el control de forma, tamaño y propiedades de la materia a escala nanométrica (Uribe & Rodriguez, 2007). En esta escala, la materia exhibe algunas propiedades que pueden ser diferentes de las propiedades tanto de átomos y moléculas como del material macroscópico. La aparición de estas propiedades se relaciona con la gran energía superficial y el mayor número de átomos superficiales, ya que cuanto más pequeña es una partícula, la fracción de átomos en la superficie aumenta (Gómez, 2013; Guozhong, 2004).
Las nanopartículas se caracterizan por tener un tamaño muy pequeño, en el orden de 1 a 100 nm y poseen propiedades únicas en relación con su naturaleza, tamaño, distribución, morfología y tendencia a la aglomeración (Uskokovic, 2013). Son utilizadas en diversos ámbitos como la industria, medicina, cosméticos, y otros productos comerciales, siendo liberadas potencialmente en diversas concentraciones al medio ambiente lo que puede convertirse en un problema ecotoxicológico en un corto tiempo (Weiss & Diabaté, 2011) teniendo además un riesgo directo para la salud humana (IRSLL, 2001).
Las nanopartículas de diferentes metales como las nanopartículas de cobre (NPsCu), exhiben excelentes propiedades físicas, químicas y biológicas, intrínsecas a su tamaño nanométrico. Las propiedades antimicrobianas del cobre, en general, han sido ampliamente demostradas frente a Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Clostridium difficile y Mycobacterium tuberculosis. Por otro lado, presenta acción antiviral a bajas concentraciones, contra virus influenza A y virus de inmunodeficiencia humana; además, tiene acción antifúngica demostrada contra Candida albicans (Quaranta et al., 2011). Esta característica ha permitido que puedan ser utilizadas y aplicadas en diversas áreas como industrial, sanitaria y médica (Prado et al., 2012; Ren et al., 2009).
Todo ello sumado a su bajo costo hace que las NPsCu despierten un gran interés en multitud de campos, pero especialmente en los sectores biomédico y alimentario. Sin embargo, la absorción, transporte y toxicidad son parámetros en los cuales no se ha estudiado a profundidad (Krug & Wick, 2011), pero por sus características físicas y químicas podrían tener efectos tóxicos (Dietz & Herth, 2011). Metales como el Au, Cd, Hg, Ni y Zn, se unen a componentes celulares incluyendo proteínas con posibilidad de desnaturalizarlas, y otros metales como Cu y Fe forman reactivos aumentando el estrés oxidativo (Hall, 2002).
Corredor et al. (2009) en su investigación concluyen que las nanopartículas magnéticas son capases de penetrar los tejidos vivos y de migrar a diferentes regiones de las plantas causando toxicidad. Otras investigaciones como los de Asli & Neumann (2009) en raíz de "maíz" (Zea mayz L.) empleando nanopartículas de TiO determinaron que la conductividad hidráulica es inhibida en un 10 por ciento. Kumari et al. (2009) analizaron el efecto de nanopartículas de plata en cebolla (Allium cepa) encontrando una disminución del índice mitótico cerca al 50%. Vannini et al. (2010) concluyen que las nanopartículas reducen la germinación de semillas de cebada (Hordeum vulgare), y en lino (Linum asitatissmun) reduce en el crecimiento de los brotes.
Es importante entonces determinar el efecto de las diferentes nanopartículas en sistemas biológicos ya que su reciente y creciente empleo nos hace propensos al contacto con ellas, ya sea por bioacumulación en los vegetales que consumimos o por contacto directo; por lo que en la presente investigación se buscó determinar el efecto citotóxico y genotóxico de diferentes concentraciones de NPsCu sobre poblaciones celulares de tejido meristemático radicular de Allium cepa.
MATERIAL Y MÉTODO
La obtención de las nanopartículas de cobre se realizó mediante la técnica de ablación láser pulsada en medios líquidos (Agreda & Aldama, 2016; Aldama et al., 2018). Se irradió una placa de cobre de alta pureza sumergida en agua bidestilada durante 10 minutos, con disparos de láser pulsado (Nd:YAG) a longitud de onda IR de 1064 nm y 37,5 mJ/pulso a una razón de repetición de 10 Hz, obteniéndose nanopartículas esféricas de cobre con un tamaño promedio de 22 nm a una concentración de 2,0 ng/L obtenida por espectroscopia de absorción atómica (Rivera et al., 2016).
El sistema biológico consistió en 40 bulbos de A. cepa "cebolla", en los cuales se promovió el desarrollo de raíces nuevas por estimulación en el disco germinativo e hidratación del bulbo, se utilizó agua declorinada con renovación por cada 24 horas, aireación en relación a una hora por día y ausencia de iluminación. Seleccionándose más tarde aquellos bulbos que contengan más de 20 raicillas con longitud promedio de 2,5 cm. a fin de asegurar la cinética del ciclo celular (Miñano,2016; Rodriguez et al., 2018).
Se desarrolló un diseño experimental completamente al azar con tres repeticiones para cada tratamiento (0ppm; 1,0ppm;1,5ppm; 2,0ppm). La aplicación de los tratamientos fue de una hora y la evaluación del efecto citotóxico pasado una hora de recuperación y la evaluación del efecto genotóxico pasado cuatro horas de recuperación. Posteriormente, las raicillas fueron cortadas y fijadas en solución de Carnoy´s. Luego se aplicó el método de Tjio & Levan (1956) para la coloración celular y en microscopio óptico se procedió al conteo celular determinándose el efecto citotóxico en base al índice mitótico y el efecto genotóxico por el índice de anomalías (Rodriguez et al., 2018). Con los datos obtenidos se aplicó el respectivo análisis de varianza y comparación de medias.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con la finalidad de determinar el efecto de los tratamientos (0 ppm; 1,0 ppm; 1,5 ppm y 2,0 ppm.) sobre el ciclo celular en meristemos radiculares de Allium cepa L. se enfrentó a las raicillas de “cebolla” a una hora de exposición a las NPsCu y a un tiempo de recuperación de una y cuatro horas, obteniéndose los índices mitóticos, de fases y de anomalías (Tabla 1 y Tabla 2) localizando a microscopio células en interfase y en división celular ( y ). El análisis de varianza mostró diferencias significativas entre los diferentes tratamientos y para cada una de las fases de la mitosis.
En la Tabla 1como en la Tabla 2 los índices mitóticos del tejido meristemático radicular de A. cepa expuesto a diferentes concentraciones de NPsCu, con una y cuatro horas de recuperación respectivamente, mostraron una disminución significativa a razón de un aumento en la concentración de NPsCu. El T4 (2.0ppm) alcanzó un índice mitótico a una y cuatro horas de recuperación de 4,9% y 1,2% respectivamente, frente al testigo con 13,0% y 13,4%. Esta disminución significativa obedecería a que las NPsCu, a dichas concentraciones y tiempos evaluados, al entrar en el sistema biológico inducen la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Khalid,2015), las que actúan bajo el correspondiente, complejo ciclina B - CDK 1(FPM: Factor Promotor de la Mitosis), el mismo que ser afectado evita el tránsito normal de las células del periodo G2 hacia la mitosis (Klug et al., 2013), observándose menor número de células en división. Es importante anotar que los índices a las cuatro horas son más reducidos que los de una hora de recuperación, lo que nos indica que la recuperación del índice mitótico del ciclo celular no se ha restablecido, sino que el efecto va en aumento.
En referencia a los índices de fases frente al testigo, a una y cuatro horas de recuperación (Tabla 1 y Tabla 2),se observa el aumento significativo del índice profásico y la consecuente disminución significativa de los índices metafásicos, anafásicos y telofásicos. A mayor concentración de NPsCu las disminuciones se hacen más notorias y significativas. Este comportamiento obedecería a que las NPsCu actuarían directamente sobre el ensamblaje del huso mitótico, específicamente sobre la formación de los centros de organización de microtúbulos (COMT) evitando el paso de profase a metafase, teniendo así mayor número de células en profase y menor número en metafase. Asimismo, las NPsCu estarían interviniendo sobre el accionar del complejo promotor de anafase (APC) (Andrioli & Mudry, 2011; Kalcheva et al., 2009; Rodriguez et al., 2018). Similares tendencias a una hora de recuperación se obtuvieron al evaluar el efecto citotóxico de otras sustancias sobre el mismo tejido radicular (Otiniano, 2014).
Las anomalías contabilizadas en la evaluación del tejido meristemático radicular de A. cepa obedecería a los posibles efectos genotóxicos inducidos por NPsCu, que por sus propiedades de forma y tamaño pueden se unirían a la molécula de ADN desdoblando su molécula bicatenaria a su presentación simple (Gallego et al., 2017; Railsback et al.,2012), aumentando la citotoxicidad e inestabilidad genómica (Khalid, 2015) que se puede traducir con la presencia de puentes anafásicos, células binucleadas y telofases amorfas (Fig.2).
El efecto cleistogénico a nivel de las regiones teloméricas del DNA como resultado de la interacción con las NPsCu provocaría la presencia de puentes anafásicos (Fajardo,2011). La inhibición por parte de las NPsCu a la fusión de vesículas del Aparato de Golgi obstaculizaría la formación del fragmoplasto, y por ende de la nueva pared celular, lo que daría por resultado la presencia de células binucleadas (Beltran & Gonzales, 1995; Prieto et al., 2005), en tanto la presencia de telofases amorfas se debería al accionar nocivo de las NPsCu en las diferentes estancias proteicas (Rodriguez et al., 2018).
CONCLUSIÓN
Las nanopartículas de cobre, a las concentraciones trabajadas,tienen efecto citotóxico y genotóxico sobre el tejido meristemático radicular de Allium cepa L. “cebolla”. A mayor concentración de nanopartículas el índice mitótico disminuye significativamente y el índice de anomalías aumenta; así mismo el número de horas de recuperación evaluadas no restableció los valores de índices mitóticos ni de anomalías.