INTRODUCCIÓN
Las “abejas sin aguijón” constituyen un grupo de abejas melíferas que se encuentran localizadas en los diversos ecosistemas del mundo. La mayor diversidad de especies estimadas se distribuye en el Neotrópico con 400 especies y 33 géneros aproximadamente desde México hasta Argentina (Nates-Parra et al., 2013; Vit et al., 2015; Arnold, et al., 2018), En Ecuador se han identificado las especies; Scaptotrigona ederi, Melipona mimética, M. indecisa, Paratrigona aff. y Nannotrigona cf., basándose en análisis taxonómicos y morfométricos (Vit et al., 2018).
Las Meliponas en la región de Tumbes, se encuentran dispersas en el bosque seco de la zona Reserva de Biosfera del Noroeste Amotapes-Manglares (RBNAM), así como en las poblaciones rurales cercanas a la reserva. Siendo muy apreciadas por las propiedades terapéuticas de su miel, sin embargo, su situación es muy delicada, debido a la sobreexplotación por parte de la población rural, por lo que debería catalogarse en la lista de especies en estado crítico o vulnerable. En ese contexto, surge la necesidad de realizar estudios concernientes a su identificación, biología y conservación.
Los pocos estudios de identificación que se han realizado en el Perú a nivel taxonómico de distintas especies de abejas sin aguijón, fueron realizados de características morfológicas por; (Elizalde et al., 2016; Rasmussen et al., 2016; Vásquez-García, et al., 2021), El uso de herramientas moleculares permite caracterizar especies de distintos organismos y sustancias activas de una manera rápida y eficaz (Hebert et al., 2010)
Estudios recientes de diversidad de microbiota intestinal para ser utilizados como estrategias de control, pese a que es un sistema complejo por la relación entre hongos, bacterias y el huésped (en los intestinos de las abejas), (Chanbusarakum et al., 2008). Se comprobó un crecimiento ilimitado de baterías intestinales en la alimentación de larvas, llegando al 100 % de infección de bacterias, disminuyendo en prepupa, pupa y, aumentando en adulto (Paludo et al., 2019)
La literatura no reporta estudios de identificación de abejas y su microbiota a nivel molecular en el Perú, por lo que esta investigación muestra los primeros antecedentes de una secuencia genómica y los microorganismos bacterianos encontrados a nivel de intestino de estos insectos para programas de desarrollo de una meliponicultura y apicultura sostenible.
MATERIAL Y MÉTODOS
Zonas de ejecución y colección de material biológico
Las evaluaciones se realizaron en las poblaciones rurales cercanas a Reserva de Biosfera del Noroeste de Amotapes-Manglares (RBNAM), las muestras fueron obtenidas de las localidades de Rica playa, Pampas de Hospital, Cabuyal, La Angostura, Papayal, Isla Noblecilla y La Totora, la colecta de abejas se realizó haciendo uso de una red entomológica donde estas realizaban el pecoreo sobre flores y cercanas a la entrada de la colonia (piquera), así como directamente de las cajas racionales de pequeños meliponarios, siendo depositadas en tubos falcón de 50 ml conteniendo buffer twin al 2%, siguiendo protocolos establecidos y luego llevadas, en Criobox con GelPack al Laboratorio de Biología Molecular de la empresa INCA’BIOTEC S.A.C.
Identificación de Melipona mimética
Las muestras se desinfectaron siguiendo el protocolo, el proceso se inició seccionándole la pata trasera para abejas grande, patas y tórax para medianas y cuerpo entero para especímenes pequeños, el procedimiento utilizado fue una modificación al método del acetato de potasio, para las reacciones de PCR se utilizaron primers del gen COI, LCO1490 y HCO2198, del (PM 7/129 (1) DNA., 2016), del gen 28S los primers 28s D2F y 28s D3R, así mismo del gen 16S con los primers 16SWb y 16SWa para preparar el mix usado en PCR con un volumen final de 24 μL, que contenían 19,7 μL de agua libre de nucleasas, 2,5 μL de buffer 10X, 0.5 μL de dNTP’s 10mM, 0,6 μL de cada primers: Forward 15μM, Reverse15μM y 0,1 μL de Taq DNA polymerase 5U/μL; agregándoseles a cada una 1 μL de ADN genómico (Josefsen et al., 2015).
Se utilizó un termociclador TurboCycler 2 de Blue-Ray Biotech para la amplificación, realizándose un paso inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 30 seg, con un alineamiento a 50 °C por 45 seg, y dos extensiones a 72 °C, una por 1 min y la final por 7 min.
Los productos de PCR se tiñeron con 2 µl de azul de bromofenol + 8 µl del amplicón, estos fueron migrados en gel de agarosa al 1% a 90 Voltios por 25 min y posteriormente se visualizaron bajo luz UV. Posteriormente, se visualizaron en un transluminador. UV TMW-20
Los amplicones obtenidos en la PCR, fueron secuenciados en la empresa Magrogen-EE.UU. Las secuencias obtenidas, fueron comparadas con la base de datos de GenBank del NCBI (Basic Local Alignment Search Tool) para determinar mayor porcentaje de homología.
Identificación de comunidad bacteriana
Se colectaron muestras de los estados de desarrollo: huevo, larva pupa y adulto, de M. mimética de un meliponario ubicado en el distrito de Pampas de Hospital, región Tumbes, se utilizaron bolsas ziploc para llevarlas al laboratorio, en discos de cría conteniendo tubos eppendorf.
Microbiota intestinal mediante técnicas independientes del medio de cultivo.
Las muestras biológicas fueron congeladas y depositadas por separado en tubos eppendorf de 2 ml, posteriormente fueron llevadas a cámara con UV donde se desinfectaron superficialmente adicionando etanol al 70 % por 3 min, luego se eliminó y se adicionó NaClO al 1% por 30 seg, se les enjuago 3 veces con agua destilada y esterilizada, posteriormente las muestras fueron maceradas, utilizándose una parte para la extracción de ADN (metagenómica) (Díaz et al., 2018).
Microbiota intestinal mediante técnicas dependientes del medio de cultivo
Parte de las muestras maceradas, fueron agregadas por separado a 1 ml de agua destilada, se homogenizo y se tomaron 20 µl de las muestras para ser esparcidas en cajas petri conteniendo el medio de cultivo TSA, las cuales fueron incubadas por 24 horas, posteriormente purificadas y cultivadas en caldo LB por 24 horas (Díaz et al., 2018).
Extracción de ADN de la microbiota intestinal mediante técnicas independientes y dependientes del medio de cultivo
Para extraer el ADN metagenómico de la microbiota intestinal mediante técnicas independientes del medio de cultivo, se tomó una parte de cada muestra macerada y se procedió con la aplicación del protocolo recomendado por el kit comercial PowerSoil® DNA Isolation Kit, (Josefsen et al. 2015). Así mismo para la microbiota intestinal mediante técnicas dependientes del medio de cultivo, se usaron cepas bacterianas purificadas las cuales fueron centrifugadas a 13,000 rpm, el sobrenadante fue eliminado y el sedimento fue resuspendido en 1 ml de solución tampón TE (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA). Las bacterias fueron sometidas a una locis celular por adición de 30 µl de SDS (10%) y 3 µl de proteinasa K (37 °C, 1 hora), se añadió 100 µl de NaCl (5M) y 80 µl de CTAB/NaCl (previamente calentado a 65 °C) y se incubaron a 65 °C por 10 min. Posteriormente, se adicionó cloroformo/alcohol isoamil (24:1) y tras centrifugarse a 13,000 rpm por 5 min, se añadió 0,6 ml de isopropanol, volviéndose a centrifugar a 1,200 rpm por 5 min, se descartó al sobrenadante y al precipitado se le adicionó 1ml de etanol frío, y nuevamente se centrifugó a 12,000 rpm 5 min, se eliminó el etanol mediante secado a temperatura ambiente por 5 min, y se obtuvo los ácidos nucleicos a los cuales se les adicionaron 30 𝑢l de tampón TE y 1 µl de solución de RNAsa a 37 °C por 1 hora para eliminar el ARNs y obtener el ADN puro (Díaz et al., 2018 y Ribière et al., 2019).
Amplificación del gen del ADNr 16S
Se utilizaron los primers universales 27-f Forward 5'AGAGTTTGATCMTGGCTC- 3' y 1492-r Reverse 5' - TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3' (Belkaid et al. 2017), para lo cual se utilizó un mix de reacción para la amplificación del gen del ADNr 16S compuesto de Buffer Taq 10X 2,5µL, MgCl₂ 25mM 2,5µL, dNTP’s 10mM 0,5µL, Taq Polimerase 5U/ µL 0,1µL, 16s ARNr F 0,6, 16s ARNr R 0,6, Agua ultra pura 16,2µL, ADN 3µL, con un volumen final 25µL. La PCR con un programa de desnaturalización inicial 94 °C en 5 min 1 ciclo, y otro por 30 seg, Hibridación 49 °C en 60 seg, Elongación de 72°C por 1 min con 35 ciclos, y la final 72 °C por 4 min por 1 ciclo y a temperatura final de conservación de 4 °C (Díaz et al. 2018).
Obtención de la secuencia parcial del gen del ADN ribosómico 16S
La secuenciación nucleotídica se realizó empleando primers internos 16S ADNr 518F y 16S ADNr 800R, las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron analizadas con el software BLAST usando la base de datos del 16S ADNr del GEN BANK y el programa MEGA 6. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information - USA).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La identificación molecular de las “abejas sin aguijón”, fue mediante tres locis genéticos distintos: Citocromo c oxidasa (COI), 28S ribosomal RNA y gen 16S rRNA, utilizados en la identificaciones de hymenópteros (González et al., 2019; Engel, et al., 2020) y para la identificación de los géneros: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp., Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp., Trigona sp. y Trigonisca sp., mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y el uso del análisis bioinformático. Resultados concordantes con los reportados por (Engel et al., 2017; Rasmussen et al., 2017; Delgado et al., 2019; Álvarez, et al., 2020; Janio et al., 2020; Pazmiño-Palomino et al., 2021).
En la comunidad bacteriana
a. Microbiota intestinal independiente de medio de cultivo
Mediante metagenómica se identificó 85 géneros de bacterias que conforman la microbiota interna del estado de huevo en M. mimetica (Tabla 1), siendo Acinetobacter sp. 17,663%, Lactobacillus sp. 13,411%, Alishewanella sp. 11,350%, Shewanella sp. 11.039% y Pseudomonas sp., 8,547%, siendo los de mayor porcentaje los 5 primeros de la tabla; en el estado de larva fueron identificados 14 géneros (Tabla 2), de los cuales Lactobacillus sp. 55,213%, Coprobacillus sp. 25,489%, Clostridium sp. 12,754% y Pediococcus sp. 6,536%, los porcentajes más representativos; en pupa 79 géneros (Tabla 3), Acinetobacter sp. 21,188%, Staphylococcus sp. 8,118%, Lactobacillus sp. 7,909%, Planomicrobium sp. 6,531%, Corynebacterium sp. 5,785%, Micrococcus sp. 5,670%, Kocuria sp. 5,42% y Brevundimonas sp. 5,402%, siendo los 8 primeros los de mayor porcentaje; para estado adulto (obrera) (Tabla 4), se identificó 53 géneros bacterianos, siendo los 3 primeros los de mayor porcentaje Lactobacillus sp. 91,81%, Pediococcus sp. 5,10% y Halospirulina sp. 2,4%. Además, se identificó 6 géneros de bacterias presentes en la microbiota de los estados de desarrollo (Tabla 5), siendo Lactobacillus sp., el de mayor porcentaje, resultados que concuerdan con los reportados por (Dürre et al., 2014; Forsgren et al., 2017; Belkaid et al., 2017; Ngalimat et al., 2019; Ribière et al., 2019; Romero et al., 2019; Rouzé et al., 2019).
Tabla 1. Géneros de bacterias identificados en la microbiota interna del estado de huevo de M. mimetica
N° | Género | Porcentaje | N° | Género | Porcentaje |
---|---|---|---|---|---|
1 | Acinetobacter sp. | 17,663 | 44 | Haliscomenobacter sp. | 0,010 |
2 | Lactobacillus sp. | 13,411 | 45 | Polaribacter sp. | 0,010 |
3 | Alishewanella sp. | 11,350 | 46 | Thalassomonas sp. | 0,010 |
4 | Shewanella sp. | 11,039 | 47 | Roseovarius sp. | 0,010 |
5 | Pseudomonas sp. | 8,547 | 48 | Thalassobius sp. | 0,010 |
6 | Cloacibacterium sp. | 3,705 | 49 | Bdellovibrio sp. | 0,006 |
7 | Kaistobacter sp. | 3,497 | 50 | Clostridium sp. | 0,006 |
8 | Intestinibacter sp. | 3,381 | 51 | Demequina sp. | 0,006 |
9 | Corynebacterium sp. | 2,960 | 52 | Escherichia sp. | 0,006 |
10 | Finegoldia sp. | 2,707 | 53 | Granulosicoccus sp. | 0,006 |
11 | Streptococcus sp. | 2,687 | 54 | Lewinella sp. | 0,006 |
12 | Ruminococcus sp. | 2,498 | 55 | Sagittula sp. | 0,006 |
13 | Paracoccus sp. | 2,476 | 56 | Spongiimonas sp. | 0.006 |
14 | Bacillus sp. | 2,293 | 57 | Verrucomicrobium sp. | 0,006 |
15 | Aliihoeflea sp. | 2,090 | 58 | Agarivorans sp. | 0,003 |
16 | Brevundimonas sp. | 1,865 | 59 | Alkaliphilus sp. | 0,003 |
17 | Peptoniphilus sp. | 1,438 | 60 | Bergeyella sp. | 0,003 |
18 | Lysobacter sp. | 1,243 | 61 | Chloroflexus sp. | 0,003 |
19 | Rhodobacter sp. | 1,072 | 62 | Citreicella sp. | 0,003 |
20 | Pantoea sp. | 0,857 | 63 | Coxiella sp. | 0,003 |
21 | Sphaerobacter sp. | 0,822 | 64 | Dechloromarinus sp. | 0,003 |
22 | Rhodovulum sp. | 0,482 | 65 | Desulfuromusa sp. | 0.003 |
23 | Actinotalea sp. | 0,462 | 66 | Donghicola sp. | 0,003 |
24 | Thiovirga sp. | 0,231 | 67 | Dyella sp. | 0,003 |
25 | Empedobacter sp. | 0,228 | 68 | Enterococcus sp. | 0,003 |
26 | Pediococcus sp. | 0,128 | 69 | Flexibacter sp. | 0,003 |
27 | Roseobacter sp. | 0,125 | 70 | Haliea sp. | 0,003 |
28 | Candidatus sp. | 0,096 | 71 | Haloferula sp. | 0,003 |
29 | Helicobacter sp. | 0,058 | 72 | Holospora sp. | 0,003 |
30 | Spongiibacter sp. | 0,058 | 73 | Imtechella sp. | 0,003 |
31 | Vibrio sp. | 0,045 | 74 | Jannaschia sp. | 0.003 |
32 | Cronobacter sp. | 0,042 | 75 | Marivita sp. | 0,003 |
33 | Kwoniella sp. | 0,039 | 76 | Mycoplasma sp. | 0,003 |
34 | Pedobacter sp. | 0,032 | 77 | Oleispira sp. | 0,003 |
35 | Raoultella sp. | 0,029 | 78 | Oligoflexus sp. | 0,003 |
36 | Flavobacterium sp. | 0,029 | 79 | Owenweeksia sp. | 0,003 |
37 | Olleya sp. | 0,026 | 80 | Pinguiococcus sp. | 0,003 |
38 | Tenacibaculum sp. | 0,026 | 81 | Pirellula sp. | 0,003 |
39 | Phaeobacter sp. | 0,016 | 82 | Synechococcus sp. | 0,003 |
40 | Rubritalea sp. | 0,016 | 83 | Terasakiella sp. | 0,003 |
41 | Ruegeria sp. | 0,013 | 84 | Tropicibacter sp. | 0,003 |
42 | Tabrizicola sp. | 0,013 | 85 | Ulvibacter sp. | 0,003 |
43 | Chlorella sp. | 0,010 |
Tabla 2. Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de larva de M. mimetica
N° | Genero | Porcentaje |
---|---|---|
1 | Lactobacillus sp. | 55,213 |
2 | Coprobacillus sp. | 25,489 |
3 | Clostridium sp. | 12,754 |
4 | Pediococcus sp. | 6,536 |
5 | Stenotrophomonas sp. | 0,003 |
6 | Streptococcus sp. | 0,001 |
7 | Algoriphagus sp. | 0,001 |
8 | Barnesiella sp. | 0,001 |
9 | Candidatus stoquefichus sp. | 0,001 |
10 | Halospirulina sp. | 0,001 |
11 | Pseudomonas sp. | 0,001 |
12 | Stakelama sp. | 0,001 |
13 | Staphylococcus sp. | 0,001 |
14 | Acinetobacter sp. | 0,001 |
Tabla 3. Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de pupa de M. mimetica
N° | Genero | Porcentaje | N° | Genero | Porcentaje |
---|---|---|---|---|---|
1 | Acinetobacter sp. | 21,188 | 41 | Pediococcus sp. | 0,238 |
2 | Staphylococcus sp. | 8,118 | 42 | Peptoniphilus sp. | 0,226 |
3 | Lactobacillus sp. | 7,909 | 43 | Oceanicola sp. | 0,221 |
4 | Planomicrobium sp. | 6,531 | 44 | Marmoricola sp. | 0,198 |
5 | Corynebacterium sp. | 5,785 | 45 | Jannaschia sp. | 0,182 |
6 | Micrococcus sp. | 5,670 | 46 | Pantoea sp. | 0,165 |
7 | Kocuria sp. | 5,421 | 47 | Shigella sp. | 0,156 |
8 | Brevundimonas sp. | 5,402 | 48 | Thermincola sp. | 0,120 |
9 | Pseudomonas sp. | 3,907 | 49 | Cronobacter sp. | 0,084 |
10 | Massilia sp. | 2,375 | 50 | Sulfurimonas sp. | 0,081 |
11 | Vibrio sp. | 1,979 | 51 | Raoultella sp. | 0,073 |
12 | Lentibacillus | 1,836 | 52 | Tropicibacter sp. | 0,070 |
13 | Streptomyces sp. | 1,624 | 53 | Ruegeria sp. | 0,070 |
14 | Loktanella sp. | 1,557 | 54 | Anoxybacillus sp. | 0,067 |
15 | Turicella sp. | 1,478 | 55 | Rothia sp. | 0,061 |
16 | Blastococcus sp. | 1,428 | 56 | Pectobacterium sp. | 0.059 |
17 | Tabrizicola sp. | 1,425 | 57 | Poseidonocella sp, | 0,059 |
18 | Comamonas sp. | 1,333 | 58 | Roseivivax sp. | 0,048 |
19 | Rhodovulum sp. | 1,216 | 59 | Serratia sp. | 0,048 |
20 | Streptococcus sp. | 1,012 | 60 | Roseobacter sp. | 0,042 |
21 | Cellulomonas sp. | 0,794 | 61 | Legionella sp. | 0,031 |
22 | Tropicimonas sp. | 0,794 | 62 | Enhydrobacter | 0,022 |
23 | Escherichia sp. | 0,782 | 63 | Candidatus saccharimonas | 0,020 |
24 | Eubacterium sp. | 0,771 | 64 | Planococcus sp. | 0,020 |
25 | Halospirulina sp. | 0,721 | 65 | Roseburia sp. | 0,020 |
26 | Paracoccus sp. | 0,679 | 66 | Lysinibacillus sp. | 0,011 |
27 | Anaerococcus sp. | 0,668 | 67 | Pseudoruegeria sp. | 0,011 |
28 | Enterobacter sp. | 0,592 | 68 | Aquabacterium sp. | 0,008 |
29 | Rhodobacter sp. | 0,590 | 69 | Hydrogenophaga sp. | 0,008 |
30 | Chryseobacterium sp. | 0,539 | 70 | Pelomonas sp. | 0,006 |
31 | Collinsella sp. | 0,456 | 71 | Phaeobacter sp. | 0,006 |
32 | Sphingobium sp. | 0,422 | 72 | Roseinatronobacter sp. | 0,006 |
33 | Prevotella sp. | 0,411 | 73 | Sagittula sp. | 0,006 |
34 | Flavobacterium sp. | 0,377 | 74 | Barnesiella sp. | 0,003 |
35 | Clostridium sp. | 0,360 | 75 | Bordetella sp. | 0,003 |
36 | Citrobacter sp. | 0,313 | 76 | Maritimibacter sp. | 0,003 |
37 | Bacillus sp. | 0,296 | 77 | Marivita sp. | 0,003 |
38 | Wohlfahrtiimonas sp. | 0,277 | 78 | Phyllobacterium sp. | 0,003 |
39 | Ornithinimicrobium sp. | 0,260 | 79 | Synechococcus sp. | 0,003 |
40 | Achromobacter sp. | 0,249 |
Tabla 4. Géneros de bacterias identificados en la microbiota intestinal del estado de adulto (obrera) de M. mimetica
N° | Género | Porcentaje | N° | Género | Porcentaje |
---|---|---|---|---|---|
1 | Lactobacillus sp. | 91,809 | 28 | Weissella sp. | 0,001 |
2 | Pediococcus sp. | 5,101 | 29 | Achromatium sp. | 0,001 |
3 | Halospirulina sp. | 2,399 | 30 | Algoriphagus sp. | 0,001 |
4 | Acetobacter sp. | 0,422 | 31 | Anoxybacillus sp. | 0,001 |
5 | Herbiconiux sp. | 0,094 | 32 | Arthrobacter sp. | 0,001 |
6 | Streptococcus sp. | 0,060 | 33 | Bradyrhizobium sp. | 0,001 |
7 | Bacillus sp. | 0,024 | 34 | Candidatus bacilloplasma | 0,001 |
8 | Staphylococcus sp. | 0,011 | 35 | Comamonas sp. | 0,001 |
9 | Acinetobacter sp. | 0,009 | 36 | Donghicola sp. | 0,001 |
10 | Azospirillum sp. | 0,007 | 37 | Enterobacter sp. | 0,001 |
11 | Clostridium sp. | 0,006 | 38 | Escherichia sp. | 0,001 |
12 | Barnesiella sp. | 0,006 | 39 | Eubacterium sp. | 0,001 |
13 | Enterococcus sp. | 0,005 | 40 | Granulosicoccus sp. | 0,001 |
14 | Asaia sp. | 0,003 | 41 | Helicobacter sp. | 0,001 |
15 | Candidatus odyssella | 0,003 | 42 | Hyphomicrobium sp. | 0,001 |
16 | Kocuria sp. | 0,003 | 43 | Lentibacillus sp. | 0.001 |
17 | Pseudomonas sp. | 0,003 | 44 | Lyticum sp. | 0,001 |
18 | Lachnoclostridium sp. | 0,003 | 45 | Massilia sp. | 0,001 |
19 | Brevundimonas sp. | 0,002 | 46 | Micrococcus sp. | 0,001 |
20 | Loktanella sp. | 0,002 | 47 | Paracoccus sp. | 0,001 |
21 | Pseudoalteromonas sp. | 0,002 | 48 | Photobacterium sp. | 0,001 |
22 | Turicella sp. | 0,002 | 49 | Planomicrobium sp. | 0,001 |
23 | Candidatus Stoquefichus | 0,001 | 50 | Shewanella sp. | 0,001 |
24 | Chryseobacterium sp. | 0,001 | 51 | Spongiibacter sp. | 0,001 |
25 | Conexibacter sp. | 0,001 | 52 | Tabrizicola sp. | 0,001 |
26 | Corynebacterium sp. | 0,001 | 53 | Vibrio sp. | 0,001 |
27 | Rubellimicrobium sp. | 0,001 |
Tabla 5. Géneros de bacterias identificados en la microbiota de los estados de desarrollo de M. mimetica
Género | Huevo | Larva | Pupa | Adulto |
---|---|---|---|---|
Acinetobacter sp. | 17,663 | 0,001 | 21,188 | 0,009 |
Clostridium sp. | 0,006 | 12,754 | 0,360 | 0,006 |
Lactobacillus sp. | 13,411 | 55,213 | 7,909 | 91,809 |
Pediococcus sp. | 0,128 | 6,536 | 0,238 | 5,101 |
Pseudomonas sp. | 8,547 | 0,001 | 3,907 | 0,003 |
Streptococcus sp. | 2,687 | 0,001 | 1,012 | 0,060 |
Tabla 6. Especies bacterianas identificadas molecularmente a partir de colonias aisladas en medios de cultivo
Nº | Especie bacteriana | Muestra | Total score | Query Cove | Evalué | Per. Ident | Accesión |
---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | Bacillus subtilis subsp. subtilis | larva | 1338 | 100% | 0.0 | 100,00% | CP051466,1 |
2 | Paenibacillus xylanilyticus | Pupa | 2304 | 100% | 0.0 | 99,62% | CP044310,1 |
3 | Humibacter sp. | Adulto | 2469 | 99% | 0.0 | 98,99% | CP031192,1 |
4 | Acinetobacter nectaris | Adulto | 422 | 97% | 5e-114 | 98,33% | MG645311,1 |
5 | Acinetobacter sp. | Adulto | 1269 | 100% | 0.0 | 99,29% | HQ284953,1 |
6 | Fructobacillus sp. | Adulto | 409 | 100% | 4e-110 | 96,39% | JN167936,1 |
b. Microbiota intestinal pendiente de medio de cultivo
Mediante técnicas de medio de cultivo (Tabla 6), fueron identificadas seis cepas bacterianas provenientes de los estados de desarrollo de M. mimetica con su respectiva homología para huevo, Bacillus subtilis subsp. Subtilis con 100%, pupa Paenibacillus xylanilyticus con 99,62% y adulto cuatro especies con su respectiva homología, Humibacter sp. 98,99%, Acinetobacter nectaris con 98,33%, Acinetobacter sp., y Fructobacillus sp. con 100%.
Los resultados obtenidos muestran una variada microbiota en los estados de vida de M. mimetica, donde se aprecia seis géneros muy relacionados a estos, de los cuales Acetinobacter sp., es reportado que habita en el agua y suelo, siendo un importante patógeno de infecciones hospitalarias; Clostridium sp., habitante de la flora intestinal de animales y humanos reportados por degradar azúcares, alcoholes, aminoácidos, purinas, pirimidinas y polímeros como el almidón y la celulosa, (Dürre et al., 2014); Pseudomonas presente en el suelo, agua dulce, filosfera y rizosfera de plantas e insectos, así mismo; Lactobacillus sp., Pediococcus sp. y Streptococcus sp., que pertenecen al grupo de bacterias del ácido láctico (BAL) de gran importancia en la salud de las abejas, (Díaz et al., 2017; Kwong et al., 2016 y Ribière et al., 2019), y la mayor presencia de Lactobacillus sp., como indicador de la buena salud de las abejas, (Ribbera et al., 2013).
Los microrganismos que forman parte de la microbiota de las abejas sin aguijón, provienen en gran parte de las fuentes de alimento como el polen y néctar colectados para la alimentación de los miembros de la colonia, así como también de agua y materiales que usan y manejan para la construcción de sus nidos, envases para almacenar la miel y el polen. Resultados que concuerdan con los reportados por; (Bárbara et al., 2015; Zheng et al., 2019., Vit et al., 2018; Voulgari-Kokota et al., 2019).
La presencia de estos géneros de bacterias en la microbiota de M. mimetica al igual que en otros animales es de importancia de la salud de los miembros de la colonia cumpliendo funciones metabólicas en la digestión, transformación de los alimentos y el mejoramiento del sistema inmune, estos resultados concuerdan con los reportados por (Hansen et al., 2014; Leonhardt et al., 2014; Shanks et al., 2017., Alberoni et al., 2018; Endo et al., 2018; Menegatti et al., 2018; Zheng et al., 2019).
Los resultados de esta investigación nos permitirán realizar otros trabajos como la biología, comportamiento y formas de conservación de M. mimética y su relación con su microbiota.
CONCLUSIONES
A nivel molecular, se identificaron los géneros de “abejas nativas sin aguijón”: Cephalotrigona sp., Geotrigona sp., Lestrimelitta sp., Melipona sp., Nannotrigona sp., Oxytrigona sp., Plebeia sp., Scaptotrigona, sp., Trigona sp. y Trigonisca sp. Mediante el uso de tres locis genéticos distintos: Citocromo c oxidasa (COI), 28S ribosomal RNA y gen 16S rRNA y del análisis bioinformático.
En la microbiota interna de M. mimetica de los géneros de bacterias identificados, los de mayor porcentaje en los estados de desarrollo fueron: en huevo 85 géneros, donde Acinetobacter sp. 17,663%, Lactobacillus sp. 13,411%, Alishewanella sp. 11,350%, Shewanella sp. 11,039% y Pseudomonas sp. 8,547%; en larva: 4 géneros, siendo Lactobacillus sp. 55,213%, Coprobacillus sp. 25,489%, Clostridium sp. 12,754% y Pediococcus sp. 6,536%; en pupa 79 géneros: Acinetobacter sp. 21,188%, Staphylococcus sp. 8,118%, Lactobacillus sp. 7,909%, Planomicrobium sp. 6,531%, Corynebacterium sp. 5,785%, Micrococcus sp. 5,670%, Kocuria sp. 5,421% y Brevundimonas sp. 5,402%; y en adulto (obrera) se identificaron 53 géneros bacterianos; Lactobacillus sp. 91,81%, Pediococcus sp. 5,10% y Halospirulina sp. 2,4%, los de mayor porcentaje respectivamente.
Estos resultados conducen a realizar un programa de conservación y valorización mediante la crianza masal de “abejas nativas sin aguijón”, generando así una fuente de ingreso para agricultores y ganaderos.