TRABAJOS ORIGINALES

Genotipificación de aislamientos de Bartonella bacilliformis por amplificación de elementos repetitivos mediante el uso de REP-PCR y ERIC-PCR

Carlos Padilla R ¹; Gladis Ventura E ²

¹ División de Biología Molecular. Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú
² División de Bacteriología. Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú

RESUMEN

Objetivos: Genotipificar los aislamientos de Bartonella bacilliformis a través de la amplificación de elementos repetitivos mediante el uso de ERIC-PCR y REP-PCR, y determinar si existe variabilidad genética entre aislamientos de varias zonas endémicas. Materiales y Métodos: Se evaluaron mediante el uso del ERIC-PCR y REP-PCR 17 aislamientos de B. bacilliformis de Lima, Cusco y Ancash. Los aislamientos fueron realizados durante los años 1998 y 1999. Para el análisis de los patrones de bandas se usó el software GelCompar 4,0. Resultados: Fueron identificados en los 17 aislamientos 10 genotipos. Los genotipos D, E y H fueron detectados en Cusco; mientras que los genotipos B, C, G, J e I en Lima; y el genotipo F en Ancash. Conclusiones: Nuestros resultados sugieren que REP-PCR y ERIC-PCR son métodos útiles para genotipificar aislamientos de B. bacilliformis. La variabilidad genética debe ser tomada en cuenta en estudios epidemiológicos y clínicos de Bartonelosis; así como el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas y de vacunas.

Palabras clave: Bartonella bacilliformis; Reacción en Cadena de la Polimerasa; Infecciones por Bartonella; Genotipo. (fuente: BIREME)

ABSTRACT

Objetive: To genotype Bartonella bacilliformis isolates by repeated elements amplification using ERIC-PCR and REP-PCR, and to determine if there is any genetic variability among isolates from several endemic areas. Materials y Methods: 17 B. bacilliformis isolates from Lima, Cusco and Ancash were assessed using ERIC-PCR and REP-PCR. Fingerprintings of the samples were obtained, and they were analyzed using GelCompar 4,0 software. Results: 10 genotypes were identified. Genotypes D, E and H were detected in Cusco; while genotypes B, C, G, J and I were detected in Lima; and genotype F was found in Ancash. Conclusions: Our results indicate that REP-PCR and ERIC-PCR are useful methods for genotyping B. bacilliformis isolates. Genetic polymorphism should be taken into account in epidemiological and clinical studies, as well as for the development of new vaccines and diagnostic methods.

Key words: Bartonella bacilliformis, Polymerase Chain Reaction; Bartonella infections; Genotype. (source: BIREME)

Para la extracción de ADN genómico se usó 200 mL de cultivo bacteriano usando el kit comercial Qiamp Tissue Kit (QIAGEN Inc. Valencia, California.) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Se usó 400 mg de proteinasa K (Sigma Inc. St. Louis, MO) y la solución para lisar los cultivos (ATL) de este kit. Las muestras fueron incubadas a 65 ºC durante 12 horas y luego el ADN genómico fue recuperado en 50 mL de agua bidestilada libre de ADNsas (Sigma Inc. St. Louis, MO).

ERIC-PCR Y REP-PCR

En la genotipificación de los aislamientos de B. Bacilliformis se utilizaron las técnicas de REP-PCR y ERIC-PCR. Los oligonucleótidos usados para realizar ERIC-PCR (ERIC1R y ERIC2) y para REP-PCR (Rep1R-Dt y Rep2-D) fueron los mismos que los reportados por Versalovic 13. El volumen final de las mezclas de reacción fue 25 mL, con 200 mM de cada nucleótido trifosfato (A, C, G y T), 2 U de ADN polimerasa termoestable Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, California.), 2,5 mM de MgCl 2 y 1 mM de cada oligonucleótido. Se usó 50 ng de ADN genómico purificado de los aislamientos por reacción.

Los ciclos de amplificación usados para REP-PCR fueron: una denaturación inicial de 95 ºC por 7 minutos; seguidos de 30 ciclos de 90 ºC por 30 segundos, 43 ºC por 1 minuto, y 65 ºC por 8 minutos, y una extensión final de 65 ºC por 16 minutos.

Los ciclos de amplificación usados para ERIC-PCR fueron: una denaturación inicial de 95 ºC por 7 minutos, seguido de 30 ciclos de denaturación a 94 ºC por 1 minuto, temperatura de hibridación de 40 ºC por 1 minuto, y una extensión de 65 ºC por 8 minutos, con una extensión final de 65 °C por 16 minutos.

Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,5%, las condiciones de la electroforesis fueron 75 V por 2 horas en solución TAE 1X, los geles se tiñeron con bromuro de etidio, visualizados en una cámara de luz ultravioleta y fotografiados en una cámara automática MP4+ Polaroid (Polaroid Co. Waltham, MA).

Además, para cada experimento se usó como control el ADN genómico purificado de B. hensenlae y B. vinsonii.

ANÁLISIS DE LOS PATRONES DE BANDAS

Para el análisis de los patrones de bandas obtenidas se usó el software GelCompar 4,0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Los patrones producidos por ERIC-PCR y REP-PCR fueron comparados usando el coeficiente de correlación de Pearson, el cual considera el número de bandas y su intensidad. Se usó una tolerancia de 1,2% en la posición de las bandas tal como es para B. hensenlae 9. Para el agrupamiento de los perfiles se usó el algoritmo UPGMA (siglas de unweighted to pair group method with arithmetic means).

Fueron considerados como un genotipo aquellos aislamientos cuyos perfiles se agruparon en un cluster que presentó una similitud superior a 75%.

RESULTADOS

Se obtuvieron perfiles o patrones de banda (fingerprints) usando REP-PCR y ERIC-PCR de los 17 aislamientos de B. bacilliformis. Cada perfil presentó múltiples bandas de amplificación. Usando REP-PCR se obtuvieron bandas con tamaños entre 500 pb y 3 500 pb, mientras que usando ERIC-PCR las bandas presentaron un tamaño entre 200 pb y 2 500 pb. Ambas técnicas producen perfiles muy complejos, REP-PCR produce un perfil más complejo (mayor número de bandas) que ERIC-PCR. Ambos sistemas produjeron resultados muy reproducibles en diferentes días, siendo aplicados por diferentes técnicos (datos no presentados).

Ambos métodos presentaron alto grado de resolución entre los aislamientos. Los aislamientos de B. bacilliformis fueron agrupados en grupos o clusters importantes y las cepas dentro de estos clusters presentaban un índice de similitud mayor a 75%. Las cepas de B. hensenlae y B. vinsonii que fueron usadas como controles se ubicaron fuera del grupo de cepas de B. bacilliformis (Figuras 1 y 2).

Para clasificar mejor los aislamientos, los resultados tanto del ERIC-PCR como del REP-PCR se combinaron de la misma manera como se ha reportado para aislamientos de B. hensenlae y otras bacterias 9,14-21, lográndose obtener una agrupación de 10 genotipos (Tabla). Hubo una tendencia de los genotipos a estar asociados al área de origen de los aislamientos. Los genotipos D, E y H fueron detectados en Cusco, mientras que los genotipos B, C, G, J e I en Lima y el genotipo F en Ancash. El genotipo A fue ubicado tanto en Cusco como en Ancash.

DISCUSIÓN

El análisis de variabilidad genética usando los marcadores REP-PCR y ERIC-PCR han sido útiles para genotipificar varios géneros de bacterias 14-21, siendo aplicados con éxito para caracterizar aislamientos de B. hensenlae 8-10. Demostramos también su utilidad en la caracterización genética de aislamientos de B. bacilliformis, nuestros resultados son compatibles con otros hallazgos obtenidos por AFLP y secuenciamiento de genes 7. Sin embargo, REP-PCR y ERIC-PCR son técnicas más fáciles de realizar, lo cual le otorga una ventaja frente a otras técnicas de genotipificación.

Los patrones de bandas obtenidos con REP-PCR presentaron mayor resolución (generaron más bandas) que aquellos obtenidos con ERIC-PCR, esto también fue observado en B. hensenlae 9. Sin embargo, como se ha observado en otros microorganismos, es mejor combinar los resultados de ambos marcadores 8-21.

Se pudo observar una gran variedad genética entre aislamientos de B. bacilliformis, pudiendo definirse 10 genotipos, los cuales se distribuyen en diversas áreas endémicas de Bartonelosis: los genotipos A, D, E y H en Cusco; los genotipos B, C, G, J y I en Lima; y los genotipos A y F en Ancash.

Sin embargo, debido al pequeño número de aislamientos analizados, no es posible determinar que sólo existan 10 genotipos de B. bacilliformis en el Perú, ni medir asociaciones entre los aislamientos y los datos epidemiológicos. Pero sí es posible determinar que durante el brote de Urubamba de 1998 circuló el genotipo A; mientras que los genotipos D, E y H estuvieron presentes en Cusco en 1999.

Aunque se ha observado diferencias en las manifestaciones clínicas de los casos en Cusco con respecto a otras zonas endémicas como Ancash o Lima 6, no existe evidencia suficiente de que este fenómeno sea causado por diferencias en los aislamientos analizados de estas zonas, probablemente, estas manifestaciones clínicas sean explicadas por múltiples factores como el polimorfismo de los aislamientos, la variabilidad genética del vector y estado inmunológico de los pobladores peruanos.

La variabilidad genética de aislamientos de B. Bacilliformis debe ser tomada en cuenta en futuros trabajos clínicos y epidemiológicos, en el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas y en el desarrollo de una vacuna para esta enfermedad.

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AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la ayuda y cooperación del Dr. José Bernable, de la Bióloga Karina Jaramillo y de la Bióloga Antonia Calvo por la obtención de las muestras para este estudio y también al Dr. Angel Rosas Aguirre.