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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versión impresa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.26 no.4 Lima dic. 2015

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i4.11220 

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i4.11220

ARTÍCULOS PRIMARIOS

Estudio serológico y molecular de Ehrlichia canis en perros de una comunidad del estado Aragua, Venezuela

A serological and molecular survey of Ehrlichia canis in dogs from a community in Aragua state, Venezuela

 

María del Carmen Martínez A.1,2,3, Cruz María Arraga-Alvarado4, Francisco Javier Triana-Alonso1 , Johanny Alejandra Ruiz C. 1,2, Clara Nancy Gutiérrez G.1,2,5,6

1 Instituto de Investigaciones Biomédicas «Dr. Francisco J. Triana-Alonso», Universidad de Carabobo (BIOMED-UC), Venezuela

2 Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas «Dr. Carlos Palacios», Departamento de Microbio- logía, 3 Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud-Sede Aragua, Universidad de Carabobo, Venezuela

4 Unidad de Investigaciones Clínicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Zulia, Vene- zuela

5 E-mail: claranancy88@hotmail.com; claranancy@gmail.com

6 Financiamiento: Proyecto de Inversión Mayor CDCH-UC 96-014 y Proyecto de Inversión Menor CDCH-UC 335-07


Resumen

Los objetivos de esta investigación fueron determinar la prevalencia de anticuerpos anti-E. canis y la detección molecular de E. canis, así como determinar el nivel de infestación y especies de garrapatas en perros de una comunidad rural del estado Aragua, Venezuela. Se recolectaron muestras sanguíneas de 110 perros domésticos y fueron evaluadas por inmunofluorescencia indirecta (IFI) y por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR). La seroprevalencia resultó en 77.3% y la detección molecular fue de 45.2%. El porcentaje de perros infestados por garrapatas fue de 69%, identificándose mayormente a Rhipicephalus sanguineus. Se determinó que 80% (68/85) de los perros seropositivos y el 32% (8/25) de los seronegativos estaban infestados por garrapatas (OR=8.5, IC 95%: 3.19-22.6; p<0.00001).

Palabras claves: Ehrlichia canis, ehrlichiosis, IFI, PCR, Rhipicephalus sanguineus, Venezuela


Abstract

The aims of the study were to determine the prevalence of antibodies anti-E canis and the molecular detection of E. canis as well as to determine the species and level of tick infestations in dogs from a rural community in Aragua state, Venezuela. Blood samples from 110 domestic dogs were obtained and analyzed by Indirect Immunofluorescence (IFI) and Nested Polymerase Chain Reaction (PCR). The seroprevalence was 77.3% and the molecular detection was 45.2%. The percentage of dogs infested with ticks was 69%, mostly with Rhipicephalus sanguineus. The results showed that 80% (68/85) of seropositive dogs and 32% (8/25) of seronegative dogs were tick infested (OR=8.5, 95%, CI 3.19 to 22.6; p<0.00001).

Keywords: Ehrlichia canis, ehrlichiosis, IFI, PCR, Rhipicephalus sanguineus, Venezuela


Introducción

La ehrlichiosis canina es una enfermedad importante, considerada emergente que afecta a los perros y otros cánidos, y cuyo agente etiológico es primordialmente Ehrlichia canis (Little, 2010; Neer et al., 2002); sin embargo, hay reportes de ehrlichiosis canina causada por E. chaffeensis (Breitschwerdt et al., 2014).

E. canis es una bacteria intracelular obligatoria, Gram negativa y pleomórfica que tiene tropismo por células mononucleares (Harrus y Waner, 2011), clasificada en la familia Anaplasmataceae (Dumler et al., 2001). Se transmite principalmente por la garrapata marrón del perro, Rhipicephalus sanguineus, de amplia distribución mundial (Groves et al., 1975). La alta prevalencia de esta garrapata en las regiones tropicales y subtropicales es favorecida por las condiciones climáticas que le permiten mantenerse activas durante todo el año, determinando que en estas regiones también se observe una mayor prevalencia de E. canis en perros (Vieira et al., 2011). R. sanguineus adquiere E. canis al alimentarse de perros infecta- dos, pudiendo transmitir la infección por lo menos durante 155 días (Groves et al., 1975).

La enfermedad se caracteriza por presentar tres etapas: aguda, subclínica y crónica. La etapa aguda se presenta entre 1 y 3 semanas después de la picadura de garrapatas infectadas. Los perros presentan fiebre, anorexia, pérdida de peso, conjuntivitis, descargas oculares y nasales, linfadenomegalia y esplenomegalia; así como anemia normocítica y normocrómica, leucopenia y trombocitopenia entre los hallazgos hematológicos. En la etapa subclínica hay persistencia del microorganismo en el huésped en ausencia de signos clínicos, pudiendo permanecer desde semanas a años, donde puede ocurrir anemia no regenerativa, leucopenia y trombocitopenia moderada. La hipoplasia de la médula ósea es un hallazgo característico de la fase crónica y puede resultar en pancitopenia marcada. Al igual que en la etapa aguda, hay tendencia a hemorra- gias, debido a la trombocitopenia y la trombopatía (Harrus et al., 1999; Preziosi y Cohn, 2002; Procajlo et al., 2011). En el perro es muy común la enfermedad asintomática, constituyendo un factor epidemiológico importante para la diseminación de la infección.

En Venezuela, E. canis se encontró por primera vez en Maracaibo, Zulia, en 1992 (Arraga, 1992); sin embargo, se dispone de escasa información local, a diferencia de otros países donde se dispone de numerosas publicaciones sobre su seroprevalencia y detección molecular (Silva et al., 2010; Nazari et al., 2013; Rojas-Triviño et al., 2013; Pérez- Vera et al., 2014). La presente investigación reporta la prevalencia serológica y la detección molecular de E. canis y de otras posibles especies de la familia Anaplasmateceae en la comunidad de Jobalito, municipio Ribas del estado Aragua, debido al reporte de casos de ehrlichiosis humana en esta zona. También informa sobre las especies de garrapatas encontradas en los perros infestados.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área del Estudio

La comunidad de Jobalito está localizada en el municipio Ribas, estado Aragua, en el centro-norte de Venezuela, con características de bosque seco premontano. El clima es marcadamente estacional, con periodos de lluvia y sequía, esta última de noviembre a abril. El promedio de temperatura anual es de 25 °C (20-30 °C) y la precipitación pluvial es de 850 a 1000 mm.

Población y Muestras

En la comunidad habitaban 203 familias y un total de 210 perros. De estos, se analizaron las muestras de 110 canes entre marzo y septiembre de 2012. El número de perros por vivienda era de 0 a 5; sin embargo, solo se tomó una muestra por vivienda, de modo que en aquellas casas con más de un perro, se seleccionó uno al azar mediante un muestreo aleatorio simple.

De cada perro se obtuvieron dos muestras de sangre por punción de la vena cefálica. Una muestra en un tubo sin anticoagulante, la cual se centrifugó a 2500 g durante 5 min, y el suero resultante fue almacenado a -20 °C. La otra muestra se colocó en un tubo con anticoagulante EDTA, desde donde se distribuyó en alícuotas de 1 ml y se almacenaron a -70 °C. Asimismo, se recolectaron garrapatas por tracción ligera a contrapelo. Los especímenes fueron preservados en alcohol isopropílico al 70% para su posterior identificación con las claves de Jones et al. (1972) y Guerrero (1996).

Para la identificación por PCR de las especies E. chaffeensis y E. canis, se procesaron 31 muestras seleccionadas de manera aleatoria, lo cual representa el 28% de perros que participaron en el estudio.

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

La prueba de IFI fue realizada de acuerdo a lo reportado por Rikihisa et al. (1992). Los sueros fueron diluidos 1:40 en buffer fosfato salino (PBS, pH 7.2). Se utilizaron láminas de 12 círculos con antígeno de E. canis (las células infectadas con E. canis fueron cedidas por Jacqueline Dawson, CDC de Atlanta). En cada ensayo se incluyeron controles positivos y negativos, además de un control de PBS. Se consideraron positivas aquellas muestras en las que se observaban mórulas fluorescentes y negativas aquellas con ausencia de fluorescencia.

Extracción de ADN y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La extracción del ADN y el PCR se realizaron de acuerdo a técnicas descritas previamente utilizando kits comerciales (Gutiérrez et al., 2009).

Para la PCR de género se utilizó 1.75 ± 0.84 µg (contenidos en 10 µl) de las muestras de ADN. Cada muestra fue amplificada en un volumen de reacción de 50 µl, el cual contenía 5 mmol/l MgCl2, 0.2 mmol/l de una mezcla de dexoxinucleósidos trifosfato, 1.25 U de Taq polimerasa (Promega, Madison, WI, EEUU) y 2 pmol de los siguientes cebadores: ECB (5´-CGTATTACC GCGGCTGCT- GGCA3´) y ECC (5´-AGA-ACGAACG- CTGGCGGCCAAGC-3´).

Se inició con 94 °C durante 4 min y luego 40 ciclos de 94 °C durante 1 min para la desnaturalización, 68 °C por 1 min para la hibridización y 72 °C por 1 min para la extensión en un termociclador (PTC-200 MJ Research, GMI Inc., Ramsey, MN, EEUU). Para la PCR anidada, la mezcla de reacción y condiciones fueron las mismas que la anterior PCR, excepto por los cebadores, temperatura de hibridación y templete de ADN.

Para la amplificación de E. canis se utilizaron 2 pmol de los cebadores: «canis» ( 5 ´ - C A AT T AT T T AT A G C C T C T - GGCTATAGGA-3´) y HE3 (5´-TATAG- GTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3´).

Para la amplificación de E. chaffeensis se utilizaron 2 pmol de los cebadores: HE1 (5´-CAATTGCTTATA-ACCTTTTGGTT ATAAAT-3´) y HE3.

La temperatura de hibridación fue de 60 °C por 1 min y 1 µl del producto de la primera amplificación se utilizó como molde de ADN. Como control positivo de ADN se emplearon purificados de células DH82 infectadas con E. canis y E. chaffeensis. Asimismo, se utilizó ADN purificado de cultivo Escherichia coli como control positivo para los cebadores ECB y ECC y como control de especificidad para el par de cebadores «canis»/HE3 y HE1/HE3. Como control negativo se utilizó ADN purificado de muestras sanguíneas obtenidas de cuatro cachorros recién nacidos sin contacto con garrapatas. Se incluyó un control negativo sin templete de ADN, usando agua en su lugar. Los productos de las reacciones de amplificación se separaron en geles de agarosa al 1.2 %, se colorearon con bromuro de etidio y se fotografiaron con iluminación UV.

Análisis Estadístico

Para calcular la prevalencia de anticuerpos IgG anti-E. canis en perros, se asumió que existía una prevalencia de al menos 50%, por lo cual se requirió un tamañomínimo de muestra de 96 perros para una población total de 210 caninos, probabilidad de error tipo I de 0.05 y una potencia de 80%. El cálculo del tamaño de muestra se hizo a través del programa Epi Info (Fleis, 1981). Se calculó la seroprevalencia de anticuerpos anti-E. canis e identificación molecular utilizando la distribución de frecuencias y porcentajes.

Las variables perros seropositivos y tenencia de garrapatas se analizaron utilizando la razón de suertes (OR) cruda y la prueba de asociación estadística se hizo a través de la distribución Chi cuadrado. El nivel de significancia (α) para las pruebas estadísticas fue de 0.05. Para el análisis de los datos se utilizaron los paquetes estadísticos Epi Info v. 6.04c y Stata v. 5.0.

RESULTADOS

En el análisis serológico en busca de anticuerpos IgG anti-E. canis, se detectaron 85 muestras positivas (85/110; 77.3%) y 25 muestras negativas (25/110; 22.7%).

Se colectaron cerca de 500 garrapatas de 76 perros (76/110; 69%). Todas las garrapatas eran de cuerpo duro (Ixodidae) y la mayoría de la especie R. sanguineus (garrapata marrón del perro), tanto adultos (machos y hembras) como ninfas. Además, se identificaron dos ejemplares adultos (macho y hembra) de Amblyomma cajennense, un adulto (hembra) de A. maculatum, un adulto (hembra) de Amblyomma sp y una ninfa, probablemente, de A. cajennense.

El 80% (68/85) de los perros seropositivos y el 32% (8/25) de los seronegativos estaban infestados por garrapatas. El OR estimado fue de 8.5 (IC 95%; 3.19-22.6); es decir, los perros que tenían garrapatas tuvieron más probabilidad de ser seropositivos que los perros que no las tenían (p<0.00001).

Al examinar las muestras de perros con la PCR de género (cebadores ECC/ECB), 51.6% (16/31) fueron positivas. La PCR anidada para E. canis (cebadores HE3/ECA) resultó positiva en 45.2% (14/31). Con respecto a los resultados de la PCR para E. chaffeensis (cebadores HE1/HE2) ninguna de las muestras resultó positiva (Cuadro 1). Es importante resaltar que 19.3 (6/31) y 51.6% (16/31) de las muestras fueron positivas a género y negativas a las especies E. canis y E. chaffeensis, respectivamente (Cuadro 1).

Con relación al resultado serológico, las 14 muestras PCR anidadas positivas fueron seropositivas y de las 17 muestras PCR anidadas negativas, 10 fueron seronegativas y 7 fueron seropositivas (Cuadro 2).

DISCUSIÓN

En diversas publicaciones se evidencia la seroprevalencia y detección molecular de E. canis. En un estudio reciente se encontró 0.3% (10/340) de seropositividad para E. canis en Finlandia, utilizando Dot-ELISA SNAP 4DX® (Pérez-Vera et al., 2014). Asimismo, Qurollo et al. (2014) reportaron una seropositividad de 1.8% en perros de Estados Unidos (n=6582), 3.2% en Canadá (n=285) y 27.6% en la región del Caribe (n=29), utilizando el ELISA SNAP, en tanto que se ha reportado una seropositividad de 7.1% en áreas rurales y urbanas de Italia utilizando el método de IFI (Ebani et al., 2014).

En regiones tropicales como Brasil, se encontraron estudios con seropositividades muy similares, de 42.4% (Vieira et al., 2013) y 42.5% (Silva et al., 2010). Recientemente, en Venezuela se realizó un estudio serológico en el caserío «La Isla», del estado Lara, encontrando una prevalencia del 46.2% utilizando la prueba de ELISA SNAP 4DX® (Almao et al., 2013). El 77.3% de seroprevalencia del presente estudio fue mayor que el obtenido en estos estudios. Las diferencias encontradas entre la seroprevalencia de E. canis en países de climas más fríos o templados con los de zonas tropicales podrían deberse a la alta prevalencia de la garrapata R. sanguineus en estos últimos.

En trabajos de detección molecular de E. canis, Nazari et al. (2013) obtuvieron una prevalencia del 2% en perros de clínicas veterinarias y de refugios de Malasia. Esta baja prevalencia molecular en un país tropical, según los autores, pudo deberse a que la infección se encontraba en etapa subclínica o crónica o que las garrapatas de la zona no estaban lo suficientemente infectadas.

En un estudio en Brasil con 320 perros de áreas urbanas y rurales, se encontró una prevalencia molecular general del 15% (Santos et al., 2013). Asimismo, Silva et al. (2010), trabajando con 472 perros en el noreste brasilero encontraron el 34.5% de los perros positivos. Es así que el 45.2% de perros positivos en el presente estudio fue superior a estos reportes. No obstante, Rojas-Triviño et al. (2013), trabajando en Colombia con perros abandonados, encontraron la más alta prevalencia revisada (92.8%) sobre esta investigación.

Las diferencias encontradas entre las muestras positivas a género y negativas a las especies de E. canis y E. chaffeensis, probablemente se deban a que los cebadores usados en la primera PCR de género (ECC/ ECB) amplifican, además, a otras especies, lo que podría indicar infección por otras especies de Ehrlichia (E. ewingii u otras), otras especies de la familia Anaplasmataceae (A. platys, A. phagocytophilum) e incluso por Rickettsia rickettsii.

De las 17 muestras PCR anidadas negativas, 10 fueron seronegativas, lo que podría indicar que estos perros nunca estuvieron en contacto con E. canis, mientras que los siete perros seropositivos en algún momento fueron positivos, y posiblemente tratados y libres de la bacteria en el momento del muestreo. Asimismo, los resultados del presente estudio, tanto serológicos como de PCR, evidencian que la mayoría de los positivos son consecuencia de la infección a E. canis, pero existe la posibilidad de que otras especies de Ehrlichia pudieran estar presentes.

El 69% de infestación de perros por garrapatas encontrado en el presente estudio resultó alto en comparación con el 6.8% (32/472) en Brasil (Silva et al., 2010) donde todas las garrapatas encontradas fueron R. sanguineus, y el 53% (278/525) obtenido por Abd Rani et al. (2011), donde, igualmente, la mayoría fue Rhipicephalus sp, seguido de especímenes del género Haemaphysalis. En Venezuela hay pocos estudios de garrapatas en perros diferentes a R. sanguineus; sin embargo, en el estado Aragua se identificaron dos especies del género Amblyoma: A. maculatum, especie también identificada en la presente investigación y A. parvum (Manzanilla et al., 2002).

Los resultados presentados en esta investigación son aportes de gran importancia para Venezuela. No obstante, se hace necesario seguir indagando acerca del papel del perro como potencial reservorio de E. chaffeensis, ya que existen reportes de esta especie en caninos (Gutiérrez et al., 2009; Breitschwerdt et al., 2014) y humanos (Martínez et al, 2008). Además, los perros son frecuentemente infectados por A. platys, una bacteria intraplaquetaria que causa trombocitopenia cíclica en los caninos (Harvey et al., 1978) y se ha demostrado recientemente, mediante pruebas moleculares, la presencia de esta bacteria en sangre humana en EEUU (Maggi et al., 2013, Breitschwerdt et al., 2014) y en Venezuela (Arraga-Alvarado et al., 2014).

CONCLUSIONES

  • En la comunidad de Jobalito del municipio Ribas (estado Aragua) existe una elevada prevalencia de anticuerpos anti- E.canis (77.3%) en perros domésticos, siendo la detección molecular de 45.2%.

  • El 69% de los perros se encuentra infestado por garrapatas, mayormente Rhipicephalus sanguineus.

  • Se encontró una asociación significativa entre la presencia de garrapatas en los perros y la serorreactividad a E. canis.

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 9 de febrero de 2015 2015

Aceptado para publicación: 15 de junio de 2015