COMUNICACIÓN

 

Evaluación de dos métodos para medir la sensibilidad de inhibición de crecimiento de la cepa certificada de Staphylococcus aureus subsp. aureus

Evaluation of two methods for measuring the sensitivity of growth inhibition of the certified Staphylococcus aureus subsp. aureus strain

 

Mayra Montero-Recalde^1,2, Lorena Vayas1, Diana Avilés-Esquivel¹, Pilar Pazmiño¹, Vinicio Erazo-Gutierrez¹

1 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Ambato, Cevallos, Tungurahua, Ecuador

2 E-mail: ma.montero@uta.edu.ec

 

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RESUMEN

La investigación tuvo como objetivo evaluar dos métodos de sensibilidad para la inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 11632), el método de Kirby-Bauer y el de pozos modificados de agar, mediante la utilización de miel de abeja pura de Apis mellifera en una concentración al 100%. El método modificado en pozos de agar formó halos de inhibición de 25.04 mm y el de Kirby-Bauer de 21.15 mm, indicando que el método modificado en pozos de agar es más sensible que el de KirbyBauer.

Palabras clave: Apis mellifera; Kirby-Bauer; método modificado en pozos de agar; halos de inhibición

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ABSTRACT

The aim of this research was to evaluate two methods of sensitivity for the inhibition of the growth of Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 11632), the Kirby-Bauer method and the modified agar wells, using honey 100% from Apis mellifera. The modified method in agar wells formed inhibition halos of 25.04 mm and that of Kirby-Bauer of 21.15 mm, indicating that the modified method in agar wells is more sensitive than the KirbyBauer method.

Key words: Apis mellifera; Kirby-Bauer; modified method in agar wells; inhibition halos

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INTRODUCCIÓN

La introducción de elevadas cantidades de antibióticos en el mercado mundial y el abuso irracional de los mismos ha provocado una alteración ecológica de los gérmenes, produciendo que estos agentes desarrollen la capacidad de inactivarlos (Patiño, 2003). Actualmente, su impacto es considerable con los fracasos de tratamiento asociados con bacterias multirresistentes y se ha convertido en una preocupación mundial para la salud pública (Martin et al., 2015).

La emergencia de la resistencia bacteriana ha generado nuevos intereses en la búsqueda de medicamentos con poder antibacteriano, prueba de ello es el aumento del número de publicaciones relacionando productos naturales y actividad antimicrobiana (Redo et al., 1989; Silver y Bostian, 1993). Por esta razón, los productos naturales siguen siendo una de las principales fuentes de nuevas moléculas de fármacos en la actualidad (Berdy, 2005).

En la actualidad, las investigaciones se centran en terapias alternas mediante la utilización de extractos microbianos, plantas, aceites esenciales, metabolitos secundarios y nuevas moléculas sintetizadas como agentes antimicrobianos potenciales (Nazzaro et al., 2013). Se puede utilizar una variedad de métodos de laboratorio para evaluar o analizar la actividad antimicrobiana in vitro de un extracto o un compuesto puro. Varios bioensayos como la difusión en disco, la difusión de pozos y la dilución en caldo o en agar son de uso común, pero otros como los métodos citofluorométricos y bioluminiscentes de flujo no son ampliamente utilizados porque requieren equipo especializado y una evaluación adicional para reproduci-bilidad y estandarización (Balouri et al., 2016).

Los ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyar la terapia antimicrobiana en procesos infecciosos por bacterias, donde la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su sensibilidad. Los mecanismos de resistencia incluyen la producción de enzimas que inactivan la droga, que alteran el objetivo, o que alteran la acción del agente etiológico (Malbrán, 2012).

Debido a la creciente necesidad de conocer las propiedades de nuevos productos antimicrobianos para el combate a bacterias multirresistentes, es importante desarrollar una mejor comprensión de los métodos actuales que se usan a nivel de laboratorio; por lo tanto, en este estudio se evaluaron dos métodos de sensibilidad sobre una cepa certificada de Staphylococcus aureus.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en el Laboratorio de Bacteriología de la Universidad Técnica de Ambato, Facultad de Ciencias Agropecuarias, sector Querochaca, Ecuador, ubicado a una altitud de 2865 m, latitud: 1º 22' 2'’ S, longitud: 78º 36' 20'’ W.

Material Experimental

Se utilizó la miel de abeja pura de Apis mellifera, procedente de la parroquia Santa Rosa Barrio Lomas de Garcés de la ciudad de Ambato, provincia de Tungurahu, Ecuador. El pH de la miel de abeja se determinó con un pHmetro (Bante 900 multi-parameter meter). Así mismo, se obtuvo una cepa certificada de Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 11632).

Preparación del Inóculo

Para el aislamiento se activó la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 11632) en agar sal manitol. Se cultivó mediante el método de estriación escocés y se incubó a 37 °C por 24 h, en posición invertida en la incubadora.

Para la preparación del inóculo se tomaron cinco colonias bien definidas con un hisopo estéril y se inocularon en 5 ml de caldo cerebro corazón, incubándose a 37 °C por 2 h hasta que se observó una turbidez ligeramente visible. Se estandarizó la densidad del inóculo mediante el espectofotómetro a 620 nm comparándola con la turbidez estándar del tubo número 5 de la escala de McFarland, dando como resultado una suspensión final de 1-2 x 108 unidades formadoras de colonias (CFU) por mililitro (UCF/ml) (NCCLS, 2012).

Discos de Sensibilidad

Se tomaron 0.5 ml de miel de abeja pura homogenizada y se impregnó cada disco con la concentración al 100% de miel de abeja durante 24 h (Becerra et al., 2016).

Cultivo Bacteriano

Difusión en agar

Un hisopo estéril se sumergió en el inóculo estandarizado al 0.5 de la escala de McFarland y se llevó a siembra en agar Mueller Hinton estriándose en forma paralela y compacta abarcando toda la superficie del agar, repitiendo el proceso rotando la placa 60° en dos oportunidades más y dejando secar durante 5 min antes de colocar los discos. Estos se ubicaron en la placa de agar.

Los discos se ubicaron en la placa de agar con una pinza anatómica estéril a 15 mm del borde de la placa, presionando suavemente sobre el agar para permitir su adherencia. Se colocaron cuatro discos impregnados con miel de abeja al 100% en cada placa, sumando un total de 24 repeticiones con cuatro tratamientos. Se incubaron a 37 °C en grupos no mayores a cinco placas durante 24 h, de manera invertida. La lectura de la prueba de sensibilidad se hizo por medio de una regleta de medición y se interpretaron los resultados como sensible (S), intermedio (I) o resistente (R) (NCCLS, 2012).

Pozos modificados de agar

La siembra se hizo siguiendo el procedimiento indicado para la prueba de difusión en agar. Antes de dejar secar el inóculo se hicieron los pozos en las placas con una cuchareta sacabocados de 6 mm. En cada pozo se vertió 50 µl de miel de abeja pura, dejándose reposar por 30 min y se incubó a 37 °C por 24 h. Se realizó la lectura de sensibilidad igual que en el método Kirby-Bauer (Gamboa y Figueroa, 2009).

RESULTADOS

Los resultados de los halos de inhibición (en mm) fueron sometidos a la prueba de Shapiro-Wilk, determinándose que tienen juna distribución normal. Es así, que se aplicó la prueba paramétrica de «t» Student para muestras independientes para comparar las medias de los dos métodos de cultivos (KirbyBauer y pozos modificados de agar).

Los halos de inhibición fueron de 21.16 ± 3.12 mm para el método Kirby-Bauer y de 25.04 ± 2.71 mm para el método de pozos modificados de agar (t=-4.59; p=0.000), indicando que el método de pozos modificados de agar mostró mayor sensibilidad para el uso de miel de abeja de Apis mellifera contra la cepa bacteriana de Staphylococus aureus subsp. aureus (ATCC® 11632). Así mismo, la prueba de Levene indicó que las varianzas de ambos grupos fueron similares.

DISCUSIÓN

Los resultados concuerdan con los estudios de Gamboa y Figueroa (2009), quienes utilizaron miel de abeja en pozos a volúmenes de 100 µl, y de Zamora y Arias (2011) con el mismo procedimiento, pero en pozos de 120 µl, donde se demuestra la efectividad de la miel de abeja en altas concentraciones sobre Staphylococcus aureus.

Rojas et al. (2005), con base a su estudio, recomiendan utilizar el método modificado de pozos en agar para realizar ensayos de actividad antimicrobiana debido a su alta sensibilidad; aspecto que fue confirmado en el presente estudio. Los halos de inhibición entre 15 y 28 mm de este estudio obtenidos con el método Kirby-Bauer fueron similares a los obtenidos por Elijah et al. (2015) utilizando miel de abeja al 100% a una dosis de 0.2 ml. Es importante mencionar que Rodríguez-Baño et al. (2008) observaron que S. aureus fue el microorganismo cuyo crecimiento se vio mayormente afectado por la miel de abeja, obteniéndose halos de inhibición de 25 mm. Conclusiones similares fueron reportadas por Cabrera et al. (2006) utilizando diferentes concentraciones de miel de abeja, aunque los halos de inhibición para S. aureus fueron menores (17 mm).

Se utilizó la máxima concentración (100%) debido a que se quería evaluar los métodos de sensibilidad. En este sentido, Lavandera (2011) menciona que cuanto mayor sea la concentración de miel mayor será su utilidad como agente antibacteriano. De la misma manera, Zamora y Arias (2011) y Efem et al. (1992) destacaron que el 90% de las muestras con miel de abeja a una concentración del 100% ejercieron un efecto inhibidor sobre S. aureus y que muestras de miel diluidas al 25% también presentaron actividad contra S. aureus. Así mismo, Malika et al. (2004) reportan inhibición del crecimiento de S. aureus con concentraciones de 25 y 50%.

El efecto bactericida de la miel de abeja de Apis mellifera estaría asociado al pH de 3.42 que presentó, el cual es lo suficientemente bajo para inhibir a varios patógenos bacterianos (Koochak et al., 2010).

CONCLUSIONES

El método en pozos modificados de agar presentó mayor sensibilidad que el método Kirby-Bauer para determinar la inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus.

 

Literatura citada

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Recibido: 1 de febrero de 2018

Aceptado para publicación: 4 de julio de 2018