Rev. perú. med. exp. salud publica v.20 n.2 Lima abr./jun. 2003 ®download el artículo en el formato PDF

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COMUNICACIÓN CORTA

Estandarización de una prueba de PCR  para la detección de Brucella sp. 

Carlos Padilla R¹; Ysabel Montoya P¹; Carlos Carrillo P².

1 División de Biología Molecular. Instituto Nacional de Salud. Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, Perú
2 Departamento de Microbiología. Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú.

RESUMEN

Objetivo: Estandarizar una prueba de PCR para la detección de Brucella spp. Materiales y métodos: Se usó oligonucleótidos reportados que amplifican la secuencia de 16S rRNA de Brucella spp. Fueron evaluados dos métodos de extracción de ADN: fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y un kit comercial basado en columnas con afinidad. Para determinar la sensibilidad de la prueba se usó 8 cepas peruanas de Brucella y para determinar la especificidad de la prueba se usó otras cepas bacterianas peruanas de E. coli, Shigella, Proteus mirabilis, Salmonella aratyphi, Salmonella typhi, Citrobacter freundii y Vibrio cholerae. Resultados: Los 2 métodos de extracción de ADN evaluados fueron efectivos. La sensibilidad analítica de la prueba es alta, lográndose detectar 80 femtogramos de ADN de Brucella spp. purificado. Todas las cepas peruanas de Brucella spp. fueron detectadas por la prueba. Además, la prueba es negativa para cepas peruanas de otras especies bacterianas. Conclusión: Se ha estandarizado las condiciones de una prueba de PCR para la detección de cepas peruanas de Brucella spp., la cual es muy sensible y específica en el laboratorio.

Palabras clave: Reacción en Cadena de la Polimerasa; Brucella; ADN (Fuente: BIREME) 

ABSTRACT

Objetive: To standardize a PCR assay for detecting Brucella spp. Materials and methods: Reported primers targeted at the 16S rRNA gene of Brucella were used. Two DNA isolation methods were assessed: phenol-chloroform-isoamyl alcohol method and a comercial kit based on DNA affinity column. Eight Peruvian isolates of Brucella spp. were used to assess sensitivity and 7 different bacterial isolates, including E. coli, Shigella, Proteus mirabilis, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Citrobacter freundii and Vibrio cholerae were used to assess specificity. Results: Both DNA isolation methods were effective for DNA isolation. The analytical sensitivity of the test was high as we were able to detect at least 80 femtograms of purified DNA. All isolates of Brucella spp. were detected by the assay. Furthermore, the test was negative with 7 bacteria species evaluated in this study. Conclusion: The conditions of a PCR assay to detect Peruvian isolates of Brucella spp, which has been shown to be very sensitive and specific in the laboratory have been tandardized.

Key words: Polymerase Chain Reaction; Brucella; DNA (Source: BIREME)

INTRODUCCIÓN

La brucelosis es una enfermedad zoonótica adquirida por exposición directa a animales infectados o por el consumo de alimentos contaminados con Brucella ^1-2 . En el Perú Brucella melitensis biotipo 1 causa 97,0% de los casos en el Perú ³ ; por otro lado, en los últimos años 90,0% de los casos son registrados en Lima y la Provincia Constitucional del Callao. Los reportes obtenidos por el Programa Nacional de Control de Zoonosis señalan que en el año 2002 el número de casos fue de 2 566 (tasa: 10,61 x 100 000 hab). 

Los procedimientos serológicos usados rutinariamente en el diagnóstico de brucelosis tanto para humanos como para animales muestran reactividad cruzada con ciertos enteropatógenos y otras bacterias como: Stenotrophomonas maltophilia, Salmonella, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae y E. coli ^4-7 . La causa de esta reactividad cruzada es la gran similitud del lipopolisacárido (LPS) presente en la superficie de estas bacterias.

El diagnóstico más seguro es indudablemente el aislamiento de la bacteria por cultivo in vitro, sin embargo, este género es difícil de aislar, y su crecimiento es lento llegando a durar hasta 30 días ⁸. 

Proponemos que la reacción en cadena de polimerasa (PCR) puede ser aplicada en el Perú como una prueba complementaria para diagnóstico rápido, específico y sensible de esta enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS 

CEPAS BACTERIANAS

Para la estandarización de esta prueba se utilizó una cepa referencial de Brucella melitensis Rev1 y una cepa referencial de Brucella abortus, estas cepas fueron obtenidas del cepario del Instituto Nacional de Salud. También se usó 8 aislamientos peruanos de Brucella melitensis colectadas en Lima, proporcionados por el Dr. Carrillo, UPCH. Además, las bacterias peruanas de las especies E. coli, Shigella, Proteus mirabilis, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Citrobacter freundii y Vibrio cholerae fueron obtenidas del cepario del Laboratorio de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud.

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO

El ADN genómico de las cepas de Brucella, previamente inactivadas durante 15 minutos a 100°C, fue purificado por 2 métodos. 

Se empleó el método convencional de fenol y cloroformo como ha sido descrito previamente ⁹ . Los pellets bacterianos fueron resuspendidos en 1 mL de buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) y lisados por la incubación con 200 µg de lisozima y SDS al 1%. Luego, los restos proteícos fueron digeridos con 500 ug de proteinasa K a 65°C durante 1 hora. Posteriormente, las muestras fueron mezcladas con 1 volumen de fenol-cloroformo- alcohol isomílico (25:24:1) durante 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugados a 10000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante fue colectado y mezclado con 2 volúmenes de cloroformo. Luego, el sobrenadante de las muestras fue colectado y el ADN fue precipitado usando 0,3 M de acetato de sodio y etanol absoluto frío. Finalmente, el ADN genómico fue resuspendido en 100 µL de agua tridestilada. 

También se usó el kit comercial QIAamp Tissue kit (QiaGen Inc, Valencia, CA) siguiendo las recomendaciones de los fabricantes ¹⁰ . Los pellet bacterianos fueron resuspendidos en la solución ATL, luego para provocar las lisis y digerir las proteínas se añadió 200 µg de Proteinasa K y la solución AL incubándose las muestras a 65°C por 1 hora. Luego de añadir etanol absoluto se colocó las muestras en las columnas de purificación. Después de lavados de las columnas, se eluyó el ADN genómico en 100 µL de agua tridestilada. La concentración y la pureza del ADN genómico purificado obtenido fueron calculados mediante espectrofotometría a 260 y 280 nm ⁹ . 

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La reacción fue realizada utilizando 50 nanogramos de ADN purificado, los ligonucleótidos F4 (5’-TCGAGCGCCCGCAAGGGG- 3’) y R2 (5’-AACCATAGT- GTCTCCACTAA-3’) dirigidos al gen 16S rRNA reportados previamente 11 , ADN polimerasa termoestable (Amplitaq DNA Gold Polymerase, Perkin Elmer Inc), mezcla de nucleótidos a 200 uM, MgCl 2 a 2 mM y soluciones buffer adecuadas. El volumen final de cada reacción fue de 25 µL. Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: una denaturación inicial de 95°C por 10 minutos; 30 ciclos de: 95°C por 30 segundos, 54°C por 90 segundos, 72°C por 90 segundos; y una extensión final a 72°C por 10 minutos. Se usó un termociclador modelo Perkin Elmer 9600 (Perkin Elmer Inc.). Los productos de amplificación fueron observados en geles de agarosa al 1%, coloreados durante 10 minutos en una solución de 2 µg/mL de bromuro de etidio y luego fotografiados.

RESULTADOS

Los 2 métodos de extracción analizados fueron eficientes para la purificación de ADN genómico, produciendo ADN en buena cantidad (entre 10 a 500 ng) y de buena calidad (con una proporción de OD ₂₈₀ /OD ₂₆₀ entre 1,5 a 1,8). Se obtuvo un producto de amplificación de 900 pb usando ADN purificado de cepas referenciales de B. melitensis y B. abortus, conforme a lo reportado previamente y de acuerdo con el tamaño de la secuencia reportada del 16S rRNA de Brucella. 

Las condiciones de la prueba de PCR fueron optimizadas con los equipos y reactivos disponibles; la concentración óptima de oligonucleótidos fue 1 µM, de ADN polimerasa fue 0,08 U/µL y de MgCl 2 fue 2 mM. Además la temperatura óptima de hibridación de los oligonucleótidos fue 54°C. 

Esta prueba de PCR presenta gran sensibilidad, llegando a detectar hasta 80 fg de ADN purificado de Brucella, el cual corresponde a 20 genomas de esta bacteria. La totalidad de la prueba puede ser realizada en 6 horas y permite obtener un resultado rápido en comparación con el cultivo. 

La prueba fue positiva para 8 aislamientos peruanos de B. melitensis y no se obtuvo producto de amplificación cuando se evaluó en aislamientos peruanos de otras bacterias como E. coli, Shigella, Proteus mirabilis, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Citrobacter freundii y Vibrio cholerae.

DISCUSIÓN 

El desarrollo de pruebas de reacción en cadena de polimerasa constituye una importante alternativa para el diagnóstico de muchas enfermedades provocadas por bacterias de crecimiento lento. Diversas pruebas de PCR han sido diseñadas para la detección de Brucella sp en muestras clínicas ^11-16. Sin embargo, la estandarización de estas metodologías constituye una etapa importante para su aplicación en el diagnóstico de la brucelosis. 

Se recomienda el uso del kit comercial de extracción de ADN debido a su simplicidad, no utiliza reactivos corrosivos (como el fenol y cloroformo) y por la reproducibilidad de producción de ADN purificado. Las condiciones óptimas de la prueba determinadas en este trabajo difieren de las condiciones reportadas previamente para estos oligonucleótidos ¹¹ , esto podría explicarse debido al uso de diferentes reactivos y equipos para la estandarización de esta prueba. 

Nuestros resultados demuestran que estos oligonucleótidos reconocen cepas de B. Melitensis peruanas, lo cual indica que esta prueba podría ser útil para el diagnóstico de la brucelosis en el Perú. 

Este sistema de PCR detecta específicamente el género Brucella, no diferencia especies dentro del género, sin embargo, la identificación del género Brucella es adecuada para el diagnóstico de brucelosis humana ¹³. 

Una comparación realizada para los sistemas de PCR basados en el gen de la proteína de membrana externa omp-2 ¹⁴ , el antígeno de 31 KDa de Brucella abortus ¹⁵ y el gene de 16S rRNA ^11,16 , ha determinado que la prueba de PCR que hemos evaluado en este estudio es la más sensible para detectar Brucella sp. en sangre total ¹⁷ , sin embargo esta prueba puede ser inhibida por cantidades excesivas de ADN humano. 

La aplicación de esta prueba de PCR, previa validación, acortaría el tiempo del diagnóstico para brucelosis. Esta prueba podría ser aplicada directamente a muestras sanguíneas, aspirados de médula, biopsias de hígado, líquido cefalorraquídeo, cultivos primarios de pocos días y alimentos. 

AGRADECIMIENTOS 

Agradecemos a la Blga. Miluska Figueroa por su apoyo para la obtención de cepas bacterianas controles negativos y a la Técnica de Laboratorio Alida Navarro por su aporte técnico para la realización de este trabajo.

REFERENCIAS 

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Correspondencia: Carlos Padilla Rojas. División de Biología Molecular.Centro Nacional de Salud Pública. Instituto Nacional de Salud. Dirección: Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Teléfono: (511) 4719920 Anexo 129 Fax: (511) 4710179
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