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INTRODUCCIÓN
Las infecciones del tracto urinario (ITU) en niños pueden afectar tanto a las vías urinarias altas como a las vías urinarias bajas, lo que causa desde una cistitis hasta una pielonefritis. Durante la infancia, aproximadamente entre 6% y 8% de pacientes pediátricos con síntomas urinarios, tienen una ITU 1 , 2. La frecuencia varía por diversos factores, como la edad y el sexo, y es más común en niñas y en niños no circuncidados. Las ITU en niños con anomalías de vías urinarias, como vejiga neurógena o reflujo vesicoureteral, podrían ocasionar un daño renal irreversible 3 , 4.
La ITU es causada por un grupo de microorganismos conocidos como uropatógenos, que tienen la capacidad de minimizar la respuesta inmune del hospedero e invadir el aparato urinario, siendo la Escherichia coli uropatógena (UPEC, por sus siglas en inglés) la causa del 85% de los episodios de cistitis aguda en humanos. Este patotipo posee factores de virulencia que le permiten adherirse e invadir los tejidos, además de determinar la capacidad de infección, cronicidad, recurrencia y la posibilidad de diseminarse a otros tejidos 5 , 6.
Entre los factores de virulencia más frecuentes de la UPEC se encuentran las fimbrias (P y tipo 1); las adhesinas, como fimH, S, M FIC, Dr/afa, Sfa; y los sistemas de captación de hierro (aerobactinas), alfahemolisina y otras enzimas con actividad proteasa 5. La adhesina fimH está presente con una frecuencia superior al 80% en las cepas de Escherichia coli causantes de ITU. Esta adhesina es la encargada de generar la adherencia de la bacteria al tejido urinario, favoreciendo de esta manera la colonización y posterior invasión al urotelio 6. La adhesina afa tiene una frecuencia que no supera el 40% en las UPEC, pero es un elemento clave para el desarrollo de infecciones en niños y embarazadas por su capacidad de ocasionar complicaciones 7. Además, es necesario actualizar constantemente los perfiles de susceptibilidad a los antimicrobianos de las UPEC a fin de realizar un tratamiento empírico adecuado para las infecciones del tracto urinario, ya que estos podrían variar según la procedencia, región geográfica o institución 8.
El principal mecanismo de resistencia frente a betalactámicos en enterobacterias es la producción de una betalactamasa de espectro extendido (BLEE). Las BLEE, al tener la capacidad de hidrolizar a la mayoría de los betalactámicos (excepto carbapenémicos y cefamicinas), resultan ser un patrón de multirresistencia, lo que causa un grave problema terapéutico, que explica su asociación con mayor mortalidad, estancia hospitalaria y aumento de costo económico 9. Por ello, el objetivo de este estudio fue determinar la presencia de los genes fimH y afa en aislamientos urinarios de Escherichia coli productoras de BLEE.
MENSAJES CLAVE
Motivación para realizar el estudio: Las adhesinas (como fimH y afa) son responsables de la colonización, invasión y cronicidad de las infecciones por Escherichia coli uropatógena.
Principales hallazgos: En los aislamientos urinarios de Escherichia coli productoras de BLEE, el gen fimH estuvo presente en el 98,7% y el gen afa, en el 8,0% de las muestras.
Implicancias: La presencia de fimH y afa en los aislamientos de Escherichia coli productora de BLEE de pacientes pediátricos podría indicar una relación entre las adhesinas y el grupo etario. Se encontró una posible relación entre la no sensibilidad a la amikacina y el gen afa.
EL ESTUDIO
Se realizó un estudio descriptivo donde se evaluaron aislamientos urinarios de Escherichia coli productoras de BLEE (las bacterias fueron recolectadas entre agosto de 2012 y enero de 2013) del cepario obtenido del proyecto TO-06/09 del Instituto Nacional de Salud del Niño (Detección y caracterización molecular β-lactamasas de espectro extendido en E. coli y K. pneumoniae aisladas en el Instituto Nacional de Salud del Niño). Se recuperaron 75 aislamientos consecutivos no repetidos, obtenidos de muestras de orina provenientes de pacientes pediátricos de los servicios de hospitalización y consultorio externo.
La detección molecular se realizó en el laboratorio de Epidemiología Molecular y Genética del Instituto de Medicina Tropical Daniel A. Carrión, de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM). Se usó ADN total como molde. Por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) se amplificó el gen fimH según el protocolo de Tolentino 10. Para el gen afa se estandarizó un protocolo en este estudio tomando en cuenta la concentración de cebadores, ADN Taq polimerasa, la temperatura de hibridación y la concentración de ADN molde.
Se utilizó el programa estadístico IBM SPSS Statistics for Windows, versión 25 (IBM Corp., Armonk, N.Y., EUA) para reportar frecuencias absolutas y relativas de las variables de interés que fueron obtenidas de la base de datos del cepario.
El protocolo del estudio fue aprobado por la Escuela de Tecnología Médica de la UNMSM. El estudio sigue los lineamientos de las buenas prácticas y de ética en investigación biomédica.
HALLAZGOS
De los 75 aislamientos de Escherichia coli productoras de BLEE aisladas de urocultivos, 74 (98,7%) fueron positivos para el gen fimH, y 6 (8,0%) fueron positivos para el gen afa. En el análisis descriptivo de las variables (Tabla 1), la frecuencia de Escherichia coli productoras del gen fimH según procedencia fue 31,1% hospitalaria y 68,9% comunitaria. Mientras que para el gen afa la frecuencia fue 16,7% de procedencia hospitalaria y 83,3% comunitaria. Del total de aislamientos, 54 (72%) pertenecían al sexo femenino y la mediana de la edad fue tres años. No se encontró relación entre los genes de virulencia y las variables género, edad y localización. El perfil de susceptibilidad a los antibióticos en los aislamientos de Escherichia coli productoras de BLEE se muestra en la Figura 2. Asimismo, se evaluó la relación entre la presencia de los genes de virulencia y la no sensibilidad a los antibióticos, y se encontró una asociación entre la no sensibilidad a la amikacina y la presencia del gen afa (Tabla 2).
Tabla 1 Distribución general de los genes de virulencia de Escherichia coli
| Características | gen afa | gen fimH | ||
|---|---|---|---|---|
| Sí (%) | No (%) | Sí (%) | No (%) | |
| Sexo | ||||
| Masculino | 2 (9,5) | 90 (90,5) | 21 (100) | - |
| Femenino | 4 (7,4) | 50 (92,6) | 53 (98,2) | 1 (1,8) |
| Edad (años) | - | |||
| <1 | 1 (5,0) | 19 (95,0) | 20 (100) | - |
| 1 | 1 (7,7) | 12 (92,3) | 13 (100) | - |
| 2 | - | 3 (100) | 3 (100) | - |
| 3 | 1 (16,7) | 5 (83,3) | 5 (83,3) | 1 (16,7) |
| 4 | 1 (20,0) | 4 (80,0) | 5 (100) | - |
| 6 | - | 6 (100) | 6 (100) | - |
| 7 | - | 7 (100) | 7 (100) | - |
| 8 | 2 (40,0) | 3 (60,0) | 5 (100) | - |
| 9 | - | 1 (100) | 1 (100) | - |
| 11 | - | 1 (100) | 1 (100) | - |
| 12 | - | 2 (100) | 2 (100) | - |
| 13 | - | 5 (100) | 5 (100) | - |
| 14 | - | 1 (100) | 1 (100) | - |
| Localización | ||||
| Comunitaria | ||||
| Consulta externa | 4 (9,1) | 40 (90,9) | 44 (100) | - |
| Emergencia | 1 (12,5) | 7 (87,5) | 7 (87,5) | 1 (12,5) |
| Hospitalaria | ||||
| Medicina interna | - | 5 (100) | 5 (100) | - |
| UCI neonatología | - | 4 (100) | 4 (100) | - |
| Ortopedia | - | 2 (100) | 2 (100) | - |
| Neumología | - | 1 (100) | 1 (100) | - |
| UCI | - | 2 (100) | 2 (100) | - |
| Neurología | - | 2 (100) | 2 (100) | - |
| Nefrología | - | 2 (100) | 2 (100) | - |
| Cardiología | 1 (50,0) | 1 (50,0) | 2 (100) | - |
| Cirugía | - | 1 (100) | 1 (100) | - |
| Urología | - | 1 (100) | 1 (100) | - |
| Ginecología | - | 1 (100) | 1 (100) | - |
UCI: Unidad de Cuidados Intensivos
Tabla 2 Genes de virulencia según susceptibilidad antibiótica
| Antibióticos | gen afa | gen fimH | ||
|---|---|---|---|---|
| Sí (%) | No (%) | Sí (%) | No (%) | |
| Amikacina | ||||
| No sensible | 3 (33,3) | 6 (66,7)* | 9 (100) | - |
| Sensible | 3 (4,5) | 63 (95,5) | 65 (98,5) | 1 (1,5) |
| Gentamicina | ||||
| No sensible | 3 (6,7) | 42 (93,3) | 45 (100) | - |
| Sensible | 3 (10,0) | 27 (90,0) | 29 (96,7) | 1 (3,3) |
| Ciprofloxacino | ||||
| No sensible | 6 (8,8) | 62 (91,2) | 67 (98,5) | 1 (1,5) |
| Sensible | - | 7 (100) | 7 (100) | |
| Imipenem | ||||
| No sensible | - | - | - | - |
| Sensible | 6 (8,0) | 69 (92,0) | 74 (98,7) | 1 (1,3) |
| Meropenem | ||||
| No sensible | - | - | - | - |
| Sensible | 6 (8,0) | 69 (92,0) | 74 (98,7) | 1 (1,3) |
| Sulfametoxazol-trimetropima | ||||
| No sensible | 5 (9,3) | 49 (90,7) | 53 (98,5) | - |
| Sensible | 1 (4,8) | 20 (95,2) | 21 (100) | - |
| Nitrofurantoína | ||||
| No sensible | 1 (14,3) | 6 (85,7) | 7 (100) | - |
| Sensible | 5 (7,4) | 63 (92,6) | 67 (98,5) | 1 (1,5) |
*Valor de p < 0,05 con la prueba de Chi cuadrado.
Figura 2 Perfil de resistencia a los antimicrobianos de los aislamientos de Escherichia coli productoras de BLEE (n = 75). R: resistente; I: intermedio; S: susceptible; IMP: imipenem; MEM: meropenem; NITRO: nitrofurantoína; AK: amikacina; CN: gentamicina; SXT: sulfametoxazol-trimetoprima; CIP: ciprofloxacino.
En la estandarización de la PCR para el gen afa, se realizó una gradiente de temperaturas y se obtuvo que la mejor temperatura de hibridación fue 62 °C, con una concentración mínima de cebadores de 1 μM y de ADN Taq polimerasa de 0,5 U/rx. La concentración mínima de ADN detectable por el test fue 400 pg/dL (Figura 1).
Figura 1 Estandarización del ADN reacción en cadena de la polimerasa para el gen afa en gel agarosa 2% ladder de 100 pb. A. Gradiente de concentración para evaluar la sensibilidad de la PCR para el gen afa (peso molecular del gen afa 750 pb). La concentración mínima detectada fue 400 pg. B. Gradiente de temperatura para la estandarización de temperatura de hibridación. C. Estandarización simultánea de la concentración de cebadores y ADN Taq polimerasa. Se concluyó que la concentración óptima de cebadores es 0,1 μM con 0,5 UI de concentración de Taq.
DISCUSIÓN
Los resultados del presente estudio muestran que el 98,7% de los aislamientos de Escherichia coli productoras de BLEE recuperadas de urocultivo de una población pediátrica presentó el gen fimH. Este hallazgo es similar a lo reportado por Kim, et al. 11 al observar la presencia de la adhesina fimH en el total de aislamientos de Escherichia coli en urocultivos de niños, además encontró una relación entre esta adhesina y los filogrupos B2 y D. Asimismo, Tabasi, et al. 12 encontraron, luego de estudiar asilamientos de pacientes adultos con ITU, que 100% de aislamientos de Escherichia coli portaban del gen fimH a partir de aislamientos de pacientes con ITU en población adulta. De igual modo, Rahdar, et al. 13 detectaron el gen fimH en un 95% de los aislamientos de UPEC y no hallaron relación entre la presencia del gen fimH y los filogrupos de Escherichia coli. En 2009, Berry, et al. describieron el mecanismo de acción de la adhesina fimH, la cual actúa e interacciona con el urotelio, lo que permite el ingreso de la UPEC y la formación de colonias bacterianas intracelulares (CBI) después de las primeras de seis horas de infección 14. Las CBI son responsables de la recurrencia, la cronicidad y la formación de reservorios bacterianos en el urotelio 15.
En relación con el gen afa, reportamos una frecuencia de 8,0% en las UPEC estudiadas; esto concuerda con lo hallado por Ramírez 16, que reportó una frecuencia de 8,2% del gen afa en cepas UPEC multirresistentes. En contraste, Tabasi, et al. 12, reportan una frecuencia del 29,5% para el gen afa, y una relación entre cistitis y las infecciones recurrentes con la presencia del gen afa. Por su parte, Servin considera que la presencia del gen afa (subtipo afaE) se presenta en mayor frecuencia en la Escherichia coli que causa pielonefritis 7. Tajbakhsh, et al. reportan que el 32% de los aislamientos de UPEC tenían el gen afa, además encontró asociación significativa entre la presencia de afa y la producción de biofilms (p < 0,05), característica que además estaba asociada a la presencia de betalactamasas 17.
En 2017 Souza, et al. reportaron una frecuencia del gen afa en aislamientos UPEC de 9 % 18, pero no encontraron una asociación significativa entre el gen y el filogrupo, ni con el género del paciente de donde se aisló. Además, mostraron que la presencia del gen afa y la no sensibilidad a la amikacina estaban asociadas significativamente, lo que difiere con lo reportado por Malekzadegan, et al. 19, quienes no encontraron asociación entre el gen afa y la no sensibilidad a la amikacina, pero sí entre la presencia del gen afa y la producción de BLEE.
El estudio presenta algunas limitaciones que son relevantes mencionar. Los resultados obtenidos corresponden a un solo centro, que podrían diferir según cada población e institución; además, no se buscaron otros factores de virulencia de importancia en la población pediátrica, ni su posible relación con los marcadores de resistencia.
En conclusión, se evidenció la presencia de los factores de virulencia producidos por los genes fimH y afa en aislamientos urinarios de Escherichia coli productoras de BLEE. Además, la estandarización y optimización de la PCR para la detección del gen afa tuvo un buen desempeño.
