TRABAJOS ORIGINALES

Estudio de la actividad antimicrobiana de la cuprita sintetizada por ruta química

Study of the antimicrobial activity of the cuprita synthetized by chemical route

 

Orfelinda Ávalo Cortez^*a, David Pedro Martínez Aguilar^a

a Facultad de Ingeniería Geológica, Minera y Metalúrgica, Universidad Nacional de Ingeniería, Av. Túpac Amaru 210, Lima 25, Perú, oavalo@uni.edu.pe

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RESUMEN

Con el auge de la nanotecnología se han desarrollado nanomateriales inorgánicos, que presentan un marcado efecto microbicida sobre una amplia variedad de microorganismos, tales como virus, bacterias y hongos. En el presente trabajo se realizó la síntesis, caracterización y estudio de la actividad antimicrobiana del óxido de cobre (I), cuprita, Cu O, obtenida por ruta química. Para la obtención de la cuprita se utilizó como precursor el sulfato de cobre pentahidratado y como reductores orgánicos el ácido ascórbico y la glucosa. La caracterización se realizó por Difracción de Rayos-X (DRX) y Microscopía Electrónica de Barrido (MEB). También se determinó la actividad antimicrobiana in vitro de las partículas de cuprita sobre la bacteria Staphylococcus aureus, determinándose la Concentración Mínima Inhibitoria(CIM). Los resultados del análisis por Difracción de Rayos X, confirmaron que a partir de la síntesis empleando ácido ascórbico como reductor y a pH=1,66 se obtuvo 100 % Cu puro con tamaños de partícula en el rango micrométrico y de forma poliédrica. La síntesis, empleando glucosa como reductor, dio como resultado la obtención de 100 % Cuprita (Cu O) con morfología variable, se observaron esferas, cubos y tetraedros muy dependientes de la concentración de NaOH empleada en cada síntesis, con tamaños de partícula en los rangos nanométrico y micrométrico, es decir se obtuvo nanopartículas y nanoestructuras de Cu O. De acuerdo a los resultados de la actividad antimicrobiana se puede concluir que el óxido de cobre Cu O tiene efecto antimicrobiano sobre la bacteria Staphylococcus aureus, siendo la Concentración Mínima Inhibitoria, CIM, 16 mg/mL.

Palabras clave: cuprita, antimicrobiana, Staphylococcus aureus.

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ABSTRACT

With the rise of nanotechnology, inorganic nanomaterials have been developed, which have a marked microbicide effect on a wide variety of microorganisms, such as viruses, bacteria and fungi. In the present work, the synthesis, characterization and study of the antimicrobial activity of copper oxide (I), cuprite, Cu O, obtained by chemical route was carried out. Copper sulfate pentahydrate was used as the precursor ascorbic acid and glucose, were used as organic reducers. The characterization was carried out by X-ray diffraction (XRD) and scanning electron microscopy (SEM). The in vitro antimicrobial activity of the cuprite particles on the Staphylococcus aureus bacterium was also determined, determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). The results of the analysis by X-ray diffraction, confirmed that from the synthesis using ascorbic acid as a reducer and at pH = 1.66, 100% pure Cu was obtained with particle sizes in the micrometric range and polyhedral shape. The synthesis using glucose as a reducer resulted in the obtaining of 100% Cuprite (Cu O) with variable morphology, spheres, cubes and tetrahedra were observed, very dependent on the concentration of NaOH used in each synthesis, with particle sizes in the nanoscale and micrometer, that is, nanoparticles and Cu O nanostructures were obtained. According to the results of the antimicrobial activity, it can be concluded that Cu O copper oxide has an antimicrobial effect on Staphylococcus aureus bacteria, with the MIC of 16 mg/Ml.

Key words: cuprite, antimicrobial, Staphylococcus aureus.

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INTRODUCCIÓN

El Staphylococcus aureus es una bacteria gram positiva que se encuentra ampliamente diseminada en el ambiente ya que posee características particulares de virulencia y resistencia contra antibióticos, lo cual representa un grave problema de salud, además esta bacteria tiene características genéticas que le han permitido convertirse en una de las bacterias más importantes en los hospitales y en las enfermedades transmitidas por alimentos1. De acuerdo a la literatura se sabe que el cobre y los óxidos de cobre son utilizados en diversos equipos sanitarios y médicos por sus propiedades bactericidas y antimicrobianas2. El mecanismo que explica la actividad antibacteriana es la capacidad del cobre para ceder y aceptar electrones en forma continua. Los iones de cobre se desprenden de superficies de cobre penetrando en la célula bacteriana produciendo la ruptura de la membrana citoplasmática que favorece la entrada de iones cobre, lo que conduce a una disfunción de la membrana y a un aumento del estrés oxidativo. A nivel citoplasmático hay una alteración de la síntesis proteica y daño funcional de enzimas esenciales produciéndose la muerte celular y degradación del ADN bacteriano3. Si bien el cobre ocasiona que la bacteria pierda su capacidad de replicarse al alterar su estructura molecular, se sabe que no genera mutaciones en el ADN. Cualquiera de estos mecanismos afecta la supervivencia de las bacterias, pero dependerá de la concentración del metal para ver el efecto bacteriostático o bactericida. La Concentración Mínima Inhibitoria (CIM), en microbiología, es la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo después de su incubación. La concentración inhibitoria mínima es importante en diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un agente antimicrobiano y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes antimicrobianos4.

En la literatura existen diversos trabajos sobre síntesis de cobre, CuO y Cu O, empleando reductores orgánicos y surfactantes cuyos resultados muestran que la síntesis por esta ruta química es sencilla y, lo más importante, permite el control del tamaño y forma de las partículas sintetizadas5-10. Existen también publicaciones respecto a la actividad antimicrobiana del cobre y de los óxidos de cobre sobre diversas bacterias tanto gram positivas como gram negativas, que en general sugieren que las nanopartículas de Cu, CuO y Cu O pueden ser consideradas como nuevos agentes efectivos de bacterias resistentes a múltiples fármacos4,11-17. El presente trabajo de investigación tiene como objetivo sintetizar la cuprita, Cu O, a partir de la sal precursora CuSO .5H O y empleando como reductores orgánicos el ácido ascórbico, la glucosa y la hidracina, aprovechando la ventaja de que el empleo de reductores orgánicos requiere bajas temperaturas durante el procesos de síntesis. Realizar la caracterización microestructural de las partículas sintetizadas a través de Análisis por Difracción de Rayos-X (DRX) y Microscopia Electrónica de Barrido (MEB) y finalmente estudiar la actividad microbicida de la cuprita sobre la bacteria Staphylococcus aureus a fin de determinar la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM).

PARTE EXPERIMENTAL

Para la síntesis del óxido cobre se partió del precursor en forma de sulfato de cobre pentahidratado, (CuSO .5H O), el cual fue reducido con ácido ascórbico (C H O ) en medio ácido y con glucosa (C H O) en medio básico.

Síntesis empleando ácido ascórbico como reductor

Se procedió a pesar 5,03g de sulfato de cobre pentahidratado y 12,01g de ácido ascórbico. Luego se llevaron a disolución la sal precursora y el reductor orgánico a temperatura ambiente, empleando agua destilada. Se agregó 18mL de agua destilada a los 5,3g de CuSO *5H O y 30mL de agua destilada a los 12,01g de ácido ascórbico. Luego de la disolución de las sales por separado, se procedió a adicionar de a poco la solución que contenía el sulfato de cobre pentahidratado sobre el recipiente que contenía la solución de ácido ascórbico, agitando vigorosamente. Se observó la formación de una solución final de color verde oscuro con un pH de aproximadamente 1,66. Luego de finalizar la adición de toda la solución de sulfato de cobre pentahidratado a la solución de ácido ascórbico, la solución final fue calentada a una temperatura de 70°C y por un tiempo de 20 min, empleando una plancha de calentamiento con agitación magnética. Se observó la formación de un precipitado de color naranja en la base del vaso, que nos daba indicios que se trataba de cobre puro. Se procedió a decantar la solución sobrenadante y a lavar el precipitado varias veces con agua destilada. El lavado final se realizó con alcohol, se procedió al secado de la muestra, el envasado y etiquetado

Síntesis empleando glucosa como reductor

Se pesó 5,71g de sulfato de cobre pentahidratado y se enrasó a 50ml en un vaso de precipitado con agua destilada. Se pesaron 2,13g de glucosa y 3,78g de hidróxido de sodio, enrasándose cada uno a 25ml en sus respectivos vasos de precipitado.

Inicialmente, se agregó el hidróxido de sodio al vaso que contenía la glucosa. Se observó la formación de una solución de un tono ligeramente amarillento. A esta solución amarillenta le agregamos poco a poco el sulfato de cobre pentahidratado que estaba colocado en una bureta. A medida que se adicionaba el CuSO .5H O este cambiaba de una tonalidad azul a verde oscuro. Se fue agitando constantemente la solución durante todo el proceso y se anotaba el cambio de pH en cada adición de sulfato de cobre de la bureta. Conforme aumentaba el pH, se observaba que la solución se volvía más oscura, hasta que al llegar a un pH de 12,3 se observó un precipitado rojizo. Finalizada la titulación, se procedió a calentar el vaso que contenía al precipitado en una plancha de calentamiento a 60°C durante 30 minutos. Luego se procedió a decantar para desechar la solución sobrenadante y luego se procede a lavar el precipitado cinco veces con agua destilada y una última lavada con alcohol. Finalmente, se procedió a secar el precipitado a menos de 50°C. Una vez seca la muestra se procedió a determinar el peso final que fue de 1,47g.

Las muestras finales fueron enviadas a los laboratorios externos para su análisis por Difracción de Rayos-X (DRX) y Microscopia Electrónica de Barrido (MEB).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis de los difractogramas DRX de la muestra sintetizada empleando ácido ascórbico como reductor en medio ácido.

Realizando el análisis cualitativo se puede observar que los picos del difractograma de esta muestra coinciden con los picos correspondientes al cobre puro, tal como se puede observar en la figura 1. Por lo tanto se puede concluir que de la reducción del sulfato de cobre con ácido ascórbico a pH= 1,66 se obtiene 100 % cobre puro, tal como fue establecido en el trabajo de Liu King Ming et al (2012), donde concluyen que a pH bien bajos se obtiene cobre puro de mayor tamaño (micrométricos) y a pH altos se obtiene cuprita de tamaños más pequeños (nanométricos), además establecen que el posible mecanismo de formación del cobre puro a pH mayores a 2,5 es a través de las siguientes etapas: Cu2+→Cu(OH) →Cu O→Cu, es decir los iones Cu2+ son transformados inicialmente a Cu(OH) y luego el Cu(OH) se reduce a Cu2O por el ácido ascórbico. El Cu O finalmente se reduce a partículas de Cu, por lo tanto establecen al Cu O como producto intermedio y representan el proceso de reducción a través de las siguientes reacciones18:

Para poder observar las posibles rutas del proceso de reducción del sulfato de cobre en medio acuoso, podemos emplear el Software HSC 6, para construir el Diagrama de Pourbaix del Sistema Cu-O-H a 60°C y para la concentración de Cu en la solución, que es de 1.14 molal, tal como se muestra en la figura 2. Claramente, se puede observar que para el pH igual a 1,66, que fue el empleado en la síntesis con el ácido ascórbico como reductor, se puede sintetizar cobre puro en un solo paso.

Análisis de los difractogramas DRX de la muestra sintetizada empleando glucosa como reductor en medio básico.

En trabajos anteriores, empleando glucosa e hidracina como reductores, se encontró que, dependiendo del rango de pH empleado en la síntesis, es posible obtener una mezcla de metal/óxido, es decir Cu/Cu O, tanto en el caso del uso de glucosa como reductor y también de la hidracina19. Al comparar los difractogramas de la muestra experimental con los patrones de difracción del cobre y de la cuprita, se puede observar que la muestra obtenida empleando glucosa como reductor a pH=12,3 presenta picos de cobre y cuprita, tal como se observa en la figura 3. Haciendo el análisis cuantitativo se determinó que la muestra final contenía 93,5 % de cuprita y 6,5 % de cobre, con un tamaño de cristalito de 83,23 nm. Algunos investigadores establecieron que los iones Cu2+ se reducen primero a Cu+ por la glucosa y luego el Cu+ reacciona con el OH- para formar Cu O, de acuerdo a las siguientes ecuaciones7:

De acuerdo a los resultados anteriores, se pudo deducir que la síntesis empleando a la glucosa como reductor, podría conducirnos a obtener 100 % cuprita y por eso se llevó a cabo pruebas experimentales modificando el pH, es decir variando la cantidad de NaOH empleada durante el proceso de síntesis de la muestra. Al hacer el análisis comparativo de los difractogramas experimental y el de la cuprita se observa que en este caso solo aparecen los picos de la cuprita, por tanto se obtuvo 100 % cuprita, figura 4.

Otra modificación que se realizó durante el proceso de síntesis empleando la glucosa como reductor fue la de realizar la síntesis de la cuprita en frío, es decir sin calentamiento. Al realizar el análisis comparativo del difractograma experimental con el difractograma patrón de la cuprita, se puede observar que se obtuvo 100 % cuprita, tal como se puede observar en la figura 5.

Análisis de las micrografías MEB de la muestra de cobre obtenida empleando como reductor el ácido ascórbico en medio ácido.

La muestra de cobre fue enviada al Laboratorio de Microscopia Electrónica de Barrido, de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Ingeniería. Se puede observar en la figura 6 que las partículas están aglomeradas y que presentan una distribución de tamaños casi homogénea, mostrando cristales facetados.

En la figura 7, con una magnificación mayor, se puede observar claramente que los cristales de cobre puro son partículas poliédricas micrométricas de entre 3 - 6µm de tamaño promedio. Esto concuerda con lo encontrado en la literatura, donde establece que a medida que se aumenta el pH el tamaño de la partícula tiende a disminuir, en nuestro caso el pH experimental fue de 1,66, que es un valor muy bajo y por tanto se obtiene partículas de mayor tamaño.

Es decir, a partir de la reducción del sulfato de cobre empleando ácido ascórbico y a un pH de 1,66 se consiguen obtener partículas en forma de poliedros de tamaños micrométricos.

Análisis de las micrografías MEB de la cuprita sintetizada con glucosa a pH=12 y con calentamiento

En la figura 8 se presenta la micrografía MEB de la muestra de cuprita sintetizada con glucosa a pH igual a 12 y con calentamiento. Se puede observar que la morfología de las partículas es esférica y con una distribución de tamaños heterogéneos. Estas micrografías MEB fueron obtenidas en el Microscopio Electrónico de Barrido tipo Tapletop de la PUC-Rio.

Esta misma muestra fue analizada en el Microscopio Electrónico de Barrido de la Facultad de Ciencias de la UNI con la finalidad de tener micrografías con mayor magnificación. En la figura 9 se puede observar que a una magnificación de 112.20 KX se logra observar que se logran sintetizar partículas de cuprita de tamaño nanométrico, es decir nanopartículas. Lamentablemente, no se tuvo acceso a un Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) para lograr mayor magnificación y tener más detalle de las muestras.

Análisis de las micrografías MEB de la cuprita sintetizada con glucosa a pH=12,3 y con calentamiento

En la figura 10 se presenta las micrografías MEB a 5KX, 10KX, 20KX y 30KX de la muestra de cuprita sintetizada con glucosa a pH igual a 12,3 y con calentamiento. Se puede observar que la morfología de las partículas es una mistura de cuasi-esféricas, cúbicas y tetraédricas con una distribución de tamaños heterogéneos. Las partículas con morfología tetraédrica son las más pequeñas con tamaño menor a 1um, las partículas cuasi-esféricas, cúbicas y algunas tetraédricas tiene un tamaño promedio de 3um. Se puede observar en las partículas cúbicas de la micrografía a 30KX que la partícula está constituida de pequeños cristalitos. Además se puede observar que las partículas cúbicas migran a cuasi-esferas y luego estas a tetraedros.

Análisis de las micrografías MEB de la cuprita sintetizada con glucosa a pH=12,3 y sin calentamiento

En la figura 11 se presenta la micrografía MEB a 14.50KX de la muestra de cuprita sintetizada con glucosa a pH igual a 12,3 y sin calentamiento, es decir sintetizada en frío. Se puede observar que la morfología de las partículas es tetraédrica con una distribución de tamaño bastante homogéneo.

De acuerdo a los resultados obtenidos podemos concluir que se pueden sintetizar cuprita de diferentes morfologías reduciendo Cu(II) con glucosa a 60°C o en frío y en medio alcalino. Se encontró que la forma de las partículas de Cu O cambia con el cambio de concentración de NaOH, es decir con la variación del pH. Las diferentes formas de las partículas de Cu O se deben a la absorción de iones OH- en las partículas de Cu2O, que surgen en la variedad del modo de crecimiento de Cu O, y que luego influyen en la morfología final de las partículas de Cu O.

Análisis de los resultados del ensayo realizado para la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria, CIM

En los ensayos de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) se usó una cepa ATCC 43300 Staphylococcus aureus resistente a metilicina. El medio de cultivo utilizado para el crecimiento de la cepa como para la realización de la CIM fue Muller Hinton, Las partículas de cuprita fueron disueltas en este medio y la lectura del CIM se realizó por medio de espectofotometría a una longitud de onda de 600nm. La concentración inicial de la cepa siguió la equivalencia de 0,5 de Mac Farland.

Ensayo con la muestra de cuprita (glucosa como reductor)

En este ensayo se tomaron las concentraciones de 144, 48, 16, 5,3, 1,7 y 0,56 mg/mL de la muestra de cuprita. La tabla 1 muestra el volumen en µL usado en la preparación de las concentraciones de cuprita. El control negativo corresponde a la concentración de 16 mg/mL.

Los resultados de la absorbancia luego de medir el OD se muestran en la tabla 2.

En las figura 12 y 13 se muestran la coloración luego de preparar los viales con la cepa y las concentraciones de las partículas que se mantienen hasta terminar la MIC. En la figura 12 se observa la coloración luego de vortexear el medio y en la figura 13 se observa que las nanopartículas han sedimentado luego de 20 minutos. Como se observa en el control negativo, la coloración afecta el OD. La diferencia entre el control negativo con su contraparte (vial 3 = 16mg/mL) da un OD de 0,304, por lo cual la CIM de la muestra podría ser 16mg/mL.

Análisis de los resultados de las pruebas de crecimiento bacteriano.

En la figura 14 se observa en la placa Petri de la parte superior, crecimiento de la cepa control (Staphylococcus aureus) en medio Manitol salado. En la placa Petri de la parte inferior izquierda se observa el crecimiento de la cepa donde la concentración del vial 4 corresponde a 5,3 mg/mL, mientras que en la placa Petri de la parte inferior derecha no se observa crecimiento de la cepa a una concentración de 144mg/mL. Por tanto, la Concentración Inhibitoria Mínima, CIM corresponde a la concentración en la cual la placa que no muestra crecimiento seguida de la placa que sí mostró crecimiento y esto sería a una concentración de 16mg/mL.

Por tanto, este valor de 16 mg/mL sería la Concentración Inhibitoria Mínima, CIM, de la cuprita, necesaria para evitar el crecimiento de la bacteria Staphylococcus aureus, lográndose, finalmente, alcanzar el objetivo final del presente trabajo de investigación.

CONCLUSIONES

Lo que se obtiene a partir de la síntesis de sulfato de cobre pentahidratado empleando ácido ascórbico como reductor a un pH igual a 1,66 es 100 % Cu puro, con una morfología poliédrica y de tamaño micrométrico, mientras que de la síntesis de sulfato de cobre pentahidratado empleando glucosa como reductor y a un pH de 12,3 se obtiene 93,5 % de Cu2O y 6,5 % de Cu. Las partículas obtenidas en estas condiciones tienen formas de esferas, cubos y tetraedros, de tamaño heterogéneo.

Se puede obtener 100 % cuprita modificando la concentración del NaOH durante la síntesis que afecta tanto al pH, a la morfología y al tamaño de las partículas. A pH=12 se consiguen partículas de morfología esférica. Además es posible obtener 100 % cuprita haciendo la síntesis sin calentamiento obteniéndose partículas con morfología tetraédrica.

En relación a la actividad antimicrobiana de las partículas de cuprita sintetizadas por ruta química empleando la glucosa como reductor en medio básico, se puede concluir que el óxido de cobre, cuprita, Cu O, tiene efecto antimicrobiano sobre la bacteria Staphylococcus aureus resistente a metilicina y que la Concentración Inhibitoria Mínima, CIM, corresponde a una concentración de 16 mg/mL.

AGRADECIMIENTO

Ala Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Ingeniería, a la Pontificia Universidade Católica do Rio de Janeiro, PUC-Rio, Brasil, al laboratorio BISALAB y al Laboratorio de Microbiología de la Universidad Cayetano Heredia por el apoyo en los análisis realizados y al Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional de Ingeniería por el apoyo económico para la realización del presente Proyecto de Investigación.

 

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Recibido el 04-06-18

Aprobado el 06-12-18