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INTRODUCCIÓN
El consumo de café parece, en general, seguro dentro de los niveles habituales de consumo. Preparado de diversas formas contiene compuestos bioactivos no enzimáticos con capacidad antioxidante, reconocido además por sus beneficios para la salud1. El contenido de los compuestos bioactivos no enzimáticos incluye el alcaloide cafeína, además de ácidos fenólicos, principalmente los ácidos clorogénico, elágico y cafeico; también están presentes flavonoides; variando el contenido de estos componentes entre especies y lugar de origen, proporcionándole al café la calidad de alimento funcional y nutracéutico. Debido a la variedad de compuestos bioactivos no enzimáticos, actualmente se conoce que este producto agroalimentario posee una serie de propiedades como actividad antioxidante, anticarcinogénico y antimutagénica2.
La composición, así como sus propiedades fisicoquímicas y organolépticas dependen de diversos factores, los edáficos, la altura, las condiciones climáticas, la radiación solar y otros.
El territorio nacional tiene tal diversidad de condiciones que favorecen la producción del café de modo tal que el 64 % de las regiones producen este recurso vegetal3. El café producido hasta su preparación, como bebida, sufre modificaciones en composición y propiedades con el tratamiento y procesamiento poscosecha, las propiedades antioxidantes, por lo tanto, pueden variar sin que ello signifique necesariamente pérdida, porque eventualmente puede aumentar por la formación de otros compuestos con actividad antioxidante, como los productos de Maillard4.
En el Perú, el café se cultiva a altitudes desde los 600 hasta los 1 800 metros, el 75 % de las zonas de cultivo se encuentran por encima de los 1 000 metros sobre el nivel del mar5. El Perú es reconocido como un país cafetalero en términos de calidad; sin embargo, los estudios sobre el café cultivado en el Perú están orientados principalmente a los aspectos de cultivo, de procesamiento y calidad organoléptica6; siendo escasos los estudios sobre las propiedades funcionales de sus compuestos bioactivos no enzimáticos. El estudio de las propiedades antioxidantes in vitro, de diversas variedades de café que se cultivan en el territorio nacional, es importante para su valoración, más allá de las propiedades fisicoquímicas y sensoriales.
La importancia de estas propiedades fueron la base de los objetivos del presente estudio, la evaluación de las propiedades antioxidantes y la comparación de estas propiedades de los granos de café tostados provenientes de cinco regiones del país, con el fin de hallar un denominador común en su comportamiento, que pueda contribuir a una mejor valoración en su biocomercio. Adicionalmente, la información generada permite una comparación con otros estudios en granos de café a nivel internacional.
PARTE EXPERIMENTAL
Obtención de las muestras
Se obtuvo un kilogramo de semilla con cáscara de café orgánico de la especie Coffea arabica provenientes de los valles Tutumbaro (Ayacucho, temperatura media anual 24,4°C, altitud 1760 m), Chanchamayo (Junín, temperatura media anual 24,6°C, altitud 700 m), Oventeni (Ucayali, temperatura media anual 26,1°C, altitud 1336 m), Jaén (Cajamarca, temperatura media anual 24,5°C, altitud 729 m) y Quillabamba (Cusco, temperatura media anual 23,6°C, altitud 1047 m) del Perú, en temporada de cosecha en el mes de marzo de 2018. En todos los casos se realizó un muestreo por conveniencia.
Diseño metodológico
El tipo de estudio fue cuantitativo mediante un diseño observacional analítico que incluye comparaciones de los granos de diversa procedencia y asociaciones de los parámetros evaluados. El análisis de los resultados se realizó aplicando ANOVA y como prueba de pares poshoc, Tukey, se consideró significativo para un valor p < 0,05. La asociación se analizó mediante la correlación de Pearson. Se empleó el programa EXCEL 2016.
Preparación de las muestras y los extractos acuosos
Las semillas fueron lavadas secuencialmente con agua destilada, luego con una solución de hipoclorito de sodio al 0,1 %, se dejó por 5 minutos y finalmente con agua bidestilada. Se dejó secar a temperatura ambiente por una hora; a continuación, se realizó la separación de la cáscara. Los granos pelados fueron sometidos a tostación en una máquina tostadora de café de acero inoxidable a una temperatura de 200 - 220°C durante 8 - 12 minutos, posteriormente se procedió a reducir su tamaño en un molino de café, igualmente de acero inoxidable. Los granos tostados y molidos fueron desecados en la estufa a 37°C durante 24 horas, se uniformizó la humedad en un rango de 11 - 12,5 %. El producto de este proceso se usó para la preparación de los extractos acuosos. Se prepararon extractos al 2,0 % con agua bidestilada a 80 °C y agitación por 30 minutos, se procedió a filtrar. El filtrado se usó para los análisis de antioxidantes y cuantificación de fenoles totales y flavonoides.
Determinación de propiedades físicas
Se evalúo densidad aparente, masa seca y sólidos solubles. La densidad aparente se determinó por gravimetría, se midió 1 mL del extracto y se determinó el peso en una balanza analítica de sensibilidad 0,0001 g. Se llevó a sequedad en una estufa hasta peso constante y la diferencia de pesos correspondió a la masa seca. Los sólidos solubles se midieron en un refractómetro digital, de sensibilidad 0,01 brix con termómetro incluido. Todos los análisis se realizaron por triplicado de muestras independientes a una temperatura de 25°C.
Determinación de compuestos bioactivos no enzimáticos: polifenoles y flavonoides
Contenido de polifenoles. Fueron cuantificados con el reactivo Folin Ciocalteu7. El tubo de reacción de un mililitro contenía 0,1 ml de muestra o estándar, se le añadió 0,5 mL del reactivo Folin Ciocalteu diluido 1:10 y una solución de Na2CO3 al 7,5 %. Después de 30 minutos se leyó a 765 nm. Se preparó tubo blanco de reactivos. El estándar fue ácido gálico de 20 μg/mL. Se realizaron tres repeticiones y los resultados se expresan en mmol EAG/g.
Contenido de flavonoides (CF). La cuantificación de los flavonoides se realizó con la técnica de Zhishen et al8. Basado en la propiedad complejante de los flavonoides frente el aluminio (2,5 %) en presencia de NaNO2 (5 %) en medio alcalino (NaOH 1 M). La absorbancia se leyó a 510 nm. La curva de catequina se preparó de 50-250 µΜ. El tubo de reacción contenía 0,5 mL de la muestra de extracto o el patrón de catequina, 150 μL de nitrito de sodio, después de 5 minutos, se agregó 250 μL de cloruro de aluminio, reposo por 6 minutos y finalmente 250 μL de NaOH, después de 10 minutos se leyeron. Se preparó un blanco de reactivo y un blanco de muestra. Se realizaron tres repeticiones y los resultados se expresan como equivalentes de catequina (µmol ECq/g).
Medición de la Capacidad Antioxidante Total (CAT)
La CAT se midió con el radical ABTS.+ con la técnica de Re et al9. El radical se preparó a partir del compuesto ABTS [ácido 7-azinobis- (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)] 7 mM en reacción con persulfato de potasio 2,45 mM, durante 16 h alejado de la luz. La presencia del antioxidante reduce la absorbancia inicial de 0,7 + 0,02 medido a 734 nm. Se preparó tubos de control, blanco y muestra; los tubos tenían un volumen final de 1,0mL y la muestra de extracto fue de 20 µL. Se realizaron tres repeticiones y las lecturas se realizaron después de 7 minutos de reacción en un ambiente alejado de la luz. Los resultados se expresan como capacidad antioxidante equivalente al Trolox (TEAC-ABTS) y capacidad antioxidante equivalente al ácido ascórbico (AAEAC-ABTS). La curva de calibración de Trolox fue de 0,5 a 2,5 µg/mL y la del ácido ascórbico de 1,0 a 4,0 µg/mL.
CAT con el radical libre DPPH. El radical libre difenil picril hidrazilo (DPPH) de color púrpura fue preparado en etanol grado analítico para una lectura inicial de 0,6 + 0,02 medido a 517 nm (Joyeux et al)10. Se prepararon tubos de control, blanco y muestra; los tubos tenían un volumen final de 1,2 mL y la muestra de extracto fue de 0,4 mL, se dejaron reaccionar alejados de la luz y después de 30 minutos se midió la absorbancia. Los resultados se expresan como capacidad antioxidante equivalente al Trolox (TEAC-DPPH) y capacidad antioxidante equivalente al ácido ascórbico (AAEAC-DPPH). La curva de calibración de Trolox fue de 0,5 a 2,5 µg/mL y la del ácido ascórbico de 1,0 a 4,0 µg/mL.
CAT medido como el potencial antioxidante de reducción de Fe +3 (FRAP). Se evaluó según la metodología de Benzie et al11. La molécula 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) actúa como un ligando altamente estabilizador de Fe+2 ante la presencia de un antioxidante que reduce el ion Fe+3, en tampón acetato 300 mM, pH 3,6. La reacción se midió por el aumento de la absorbancia a la longitud de onda de 593 nm. El tubo contenía 50 μL del extracto acuoso de la muestra y 950 μL de la mezcla buffer acetato: TPTZ: hierro férrico (10:1:1); se dejó reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se usó una solución de sulfato ferroso como referencia de 100 - 750 µM.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Características físicas
Las cinco muestras de Coffee arabica obtenidas de cinco regiones que geográficamente se ubican en la zona nororiente (Cajamarca), en la zona selva central (Ucayali y Junín), en la zona central sur (Ayacucho) y suroriente (Cusco), tienen en común la temperatura media anual que va desde 23,6 °C a 26,1 °C, con un promedio de 24,6°C, aunque la altitud es variada y va desde 700 m.s.n.m. hasta 1760 m.s.n.m.
Los resultados de los sólidos solubles y la densidad aparente son homogéneos y no presentan diferencias significativas (tabla 1). Los valores obtenidos expresan que las cinco muestras contienen sustancias cuantitativamente muy cercanas.
Tabla 1 Propiedades físicas de los extractos de Coffea arabica procedente de cinco regiones del Perú.
| Sólidos solubles grados Brix (% p/p) | Densidad aparente g/mL | |
| Ayacucho | 0,50 | 1,009 |
| Junín | 0,53 | 1,017 |
| Ucayali | 0,50 | 1,016 |
| Cajamarca | 0,53 | 1,017 |
| Cusco | 0,50 | 1,014 |
Con estos datos, y considerando que todas fueron sometidas al mismo procedimiento de secado, tostación y molienda, las propiedades físicas de densidad aparente y sólidos solubles no mostraron diferencias significativas (tabla 1). Los procesos seguidos hasta la obtención de la molienda pueden modificar algunas propiedades físicas, entonces las modificaciones que pudieron haber por efecto de tratamiento no afecto a estas propiedades físicas12. En este sentido, la temperatura sería uno de los factores ambientales determinantes para la producción homogénea de compuestos bioactivos como los fenoles, flavonoides y probablemente otros metabolitos.
Compuestos bioactivos no enzimáticos
El contenido de fenoles totales (CFT) y flavonoides (F) que se presentan en la figura 1 no muestra diferencias significativas, importante también es notar que este contenido similar se refleja en la relación F/CFT. Estos resultados son similares aun cuando proceden de regiones del norte, centro y sur del país, de altitudes que van desde los 700 m.s.n.m. hasta los 1760 m.s.n.m.
Figura 1 Contenido de fenoles totales (CFT) y flavonoides (F) de extractos de café tostado procedentes de cinco regiones. No hubo diferencias significativas.
La ausencia de diferencias significativas en el contenido de fenoles totales (figura 1), refleja que la producción de estos compuestos orgánicos podría ser también consecuencia importante de la temperatura, la que debe ser entre 17ºC y 26º C. Otro estudio en café verde y procesado de las especies Coffea arabica y Coffea canephora tampoco hallaron diferencias significativas en el contenido de fenoles totales13.
El estudio de 34 muestras de cafés comerciales de Panamá, sobre el CFT de las muestras de cafés puros y mezclados estuvo en el rango de 0,17 a 0,28 y 0,07 a 0,10 mmol EAG/g, respectivamente14. Es decir, que el contenido de polifenoles totales del Coffea arabica procedente de los cinco valles de Perú es superior a los comerciales de Panamá, los estudiados estuvieron entre 2,7 y 3,0 mmol EAG/g de café. El factor tiempo de almacenamiento de los cafés comerciales, pudo haber modificado el contenido de fenoles, así se demostró la reducción significativa (p<0,01) en el estudio de almacenamiento durante doce meses a 5°C 15. (Król, Gantner, Tatarak, & Hallmann, 2020). Otro resultado en Coffea arabica de Brasil, Colombia, Etiopía e India, mostraron un contenido de fenoles totales de 0,24, 0,22, 0,25 y 0,25 mmol/g de café, respectivamente16. También hay estudios del contenido de fenoles totales y flavonoides en bebidas de café preparadas de diversas formas. Se mostró que el preparado como “expreso” tuvo el mayor contenido de fenoles totales, 0,29 mmol EAG/g de café y de flavonoides 379 µmol ECq/g de café y se asoció a una mayor capacidad antioxidante17.
Los flavonoides mostraron el mismo comportamiento que los fenoles, no hubo diferencias significativas, pero se notó un contenido ligeramente mayor (15 %) en la muestra de Junín (155,0 µmol ECq/g) con respecto a Ucayali y Cusco (135 µmol ECq/g). El mismo estudio de 34 muestras de café comerciales de Panamá14, mostró que el contenido de flavonoides fue de 76,3 a 132,0 y 32,2 a 50,0 µmol ECq/g, para los puros y mezclados, respectivamente. El análisis de correlación de Pearson, entre estos metabolitos secundarios, demostró una fuerte asociación (r=0,953) con un valor significativo p<0,05. (tabla 2) lo que ratifica la homogeneidad de los contenidos.
Capacidad Antioxidante Total
La evaluación de la CAT frente a técnicas empleando radicales libres, ABTS + y DPPH no dio diferencia significativa entre Ayacucho, Junín, Ucayali y Cajamarca, solo en el caso de la CAT del Cusco tiene un menor valor con diferencia significativa (p<0,05) frente a la muestra de Junín. Esta diferencia se muestra frente a ambos radicales libres y expresados con dos estándares, Trolox y ácido ascórbico (figura 2). La muestra procedente de Junín corresponde a una altitud de 700 m.s.n.m y la de Cusco corresponde a una altitud de 1047 m.s.n.m.
Figura 2 Capacidad antioxidante total (CAT) frente a radicales libres de extractos de café procedentes de cinco regiones del Perú. TEAC: capacidad antioxidante total equivalente a Trolox. AAEAC: capacidad antioxidante total equivalente a ácido ascórbico. *significancia p<0,05.
Estos compuestos bioactivos no enzimáticos son directamente asociados al comportamiento antioxidante y por ende a los beneficios que de ellos derivan. Los extractos sometidos a las pruebas de CAT lo demostraron. En la figura 2 solo se observó diferencia significativa entre la muestra procedente de Junín (TEAC-ABTS: 62 mg/g; TEAC-DPPH: 52 mg/g) frente a la muestra de café procedente de Cusco (TEAC-ABTS: 55 mg/g; TEAC-DPPH: 44 mg/g). Estudios similares fueron hallados por Vega, De León y Reyes (2017), la TEAC-DPPH fue de 28 a 50 mg/g y de 6 a 15 mg/g, para los cafés puros y las mezclas, respectivamente. Ya que temperaturas menores a 17ºC o mayores a 26ºC afectan la calidad de los granos.
Otro estudio en granos de Coffee arabica, como café verde y tostado de diferentes estados de México, mostraron valores de TEAC-ABTS de 47 a 63 mg/g18, los que se muestran en el presente estudio exhibieron valores de TEAC-ABTS más homogéneos en el rango de 55 a 62 mg/g. Que pueden explicarse por las diferentes condiciones ambientales entre el Perú y México.
Figura 3 Potencial antioxidante reductor de ion férrico (FRAP) de extractos de café tostado procedente de cinco regiones del Perú. Sin diferencias significativas.
Sin embargo, cuando se ha evaluado el comportamiento por su capacidad antioxidante mediante la reducción del Fe+3 (FRAP) no se ha observado ninguna diferencia significativa (figura 3).
Tabla 2 Correlación de Pearson de los parámetros antioxidantes, fenoles y flavonoides de las muestras de café procedentes de las cinco regiones del Perú.
| AAEAC- TEAC- | AAEAC- | |||||
| ABTS | FRAP | DPPH | DPPH | CFT | F | |
| TEAC-ABTS | 0,951 | 0,766 | 0,955 | 0,955 | 0,951 | 0,959 |
| AAEAC-ABTS | 0,875 | 0,999 | 0,999 | 1,00 | 0,999 | |
| FRAP | 0,873 | 0,873 | 0,875 | 0,688 | ||
| TEAC-DPPH | 1,00 | 0,999 | 0,955 | |||
| AAEAC-DPPH | 0,999 | 0,955 | ||||
| CFT | 0,953 | |||||
CFT: contenido de fenoles totales; F: flavonoides; TEAC: capacidad antioxidante equivalente al Trolox, AAEAC: capacidad antioxidante equivalente al ácido ascórbico.
El análisis de correlación para la determinación de la asociación entre el contenido de compuestos bioactivos no enzimáticos y la capacidad antioxidante total mostraron una fuerte correlación (>0,7) en toda la evaluación (tabla 2).
El CFT y flavonoides guardan una fuerte correlación con la actividad antioxidante evaluada con las tres técnicas (tabla 2), analizados con la correlación de Pearson19, especialmente entre CFT frente a las técnicas con radicales libres. Esta fuerte correlación expresa que los fenoles participan por mecanismos de donación de electrones (SET: single electron transfer) y por donación de átomo de hidrógeno (HAT: hydrogen atom transfer), así como también como agentes reductores20.
La importancia de los resultados de estas muestras procedentes de las cinco regiones del país radica en saber que, a pesar de las distancias geográficas y la altitud, las muestras de café de las cinco regiones contienen fenoles totales y flavonoides sin diferencia significativa, este contenido está fuertemente asociado a su CAT a través de los mismos mecanismos. Será necesario ahondar los estudios sobre estos mismos parámetros en el grano verde, pues es sabido que el proceso de tostación influye, además de las características organolépticas, en la composición y CAT21. Este trabajo constituye un punto de partida para la evaluación del comportamiento antioxidante in vitro de las diversas variedades de café cultivados en el territorio nacional, proyectando además estudios sobre la composición y otros ensayos in vivo.
CONCLUSIONES
El café peruano exhibe propiedades antioxidantes como las reportadas para esta especie en otros países, y se correlaciona con el contenido de polifenoles y flavonoides. La procedencia de las muestras de Coffee arabica de las cinco regiones del Perú, diferentes en ubicación y altitud, no ha determinado una diferencia significativa en el contenido de fenoles totales y flavonoides, ni en la capacidad antioxidante total.
