Identificación de Bartonella bacilliformis por métodos moleculares

 

Henríquez, César; Infante, Berónica; Merello, Jenny; Gal´Lino, María; Santivañez, Livia; Maguiña Vargas, Ciro; Guerra Allison, Humberto; Birtles, Richard y Ventosilla, Palmira.

 

* Instituto de Medicina Tropical "Alexander von Humboldt". Universidad Peruana Cayetano Heredia. Laboratorio B: Bacteriología Experimental. Laboratorio C: Biología Molecular.

 

RESUMEN

Introducción: La técnica de PCR amplifica una secuencia de ADN con la enzima polimerasa; es muy sensible y específica. Objetivo: Estandarizar una técnica de PCR para identificar Bartonella bacilliformis en sangre total de pacientes con bartonelosis aguda. Material y métodos: Se usó muestras de sangre total de seis pacientes con diagnóstico clínico y microbiológico de bartonelosis aguda. Se extrajo el ADN de sangre total usando el detergente guanidina DNAzol^® BD. Se amplificó el ADN usando los cebadores de extensión "primers" 16S y 23S del espaciador de trascripción interna (ITS). Se hizo electroforesis de los productos de amplificación en gel de agarosa. Se compararon los pesos moleculares de las bandas observadas en la electroforesis con un marcador de 100 pares de bases. Resultados:Se determinó que la concentración de ADN extraído por DNAzol^® BD corresponde alrededor de 6 ng de ADN. El producto amplificado de muestras de sangre total fue alrededor de 1000 pares de bases, idéntico al extraído de los hemocultivos de B. bacilliformis y claramente diferente del de otras especies. Las diluciones de las extracciones mejor detectadas por PCR fueron 1/5 y 1/10. Conclusiones: El ADN de B. bacilliformis extraído con DNAzol^® BD de sangre total de pacientes con bartonelosis aguda es amplificado por PCR utilizando los primers 16S y 23S; es posible usar esta técnica para el diagnóstico etiológico rápido.

PALABRAS CLAVE: PCR, Bartonella bacilliformis, DNAzol^® BD, 16S 23S.

 

SUMMARY

Background: The PCR methodology amplifies a sequence of DNA with the Polimerase enzyme; the sensibility and specificity is very high. Objective: To develop a PCR methodology designed to work on extracts from whole blood samples rather than from isolated, cultured organisms. Methods: The whole blood of six patients with clinical and microbiologic diagnosis of acute bartonelosis by B. bacilliformis was used. The DNA was extracted with DNAzol^® BD (lysis solution with guanidine detergent), and the extract subjected to PCR using primers 16S and 23S for the Intergenic Transcribed Spacer (ITS). The amplified products were subjected to electrophoresis on 1% agarose gels. Results: The concentration of the extracted product with DNAzol^® BD was around 6 ng. The amplified single sized product of 1000 base pairs was identical to that from authentic cultures of B. bacilliformis and clearly different from that of other species. The dilutions detected by PCR were 1/5 and 1/10. Conclusion: The amplification of the DNA of B. bacilliformis extracted with DNAzol^® BD from whole blood of patients with acute bartonelosis using the primers 16S and 23S is possible using this method for a fast etiologic diagnosis.

KEY WORDS: PCR, Bartonella bacilliformis, DNAzol^® BD, 16S 23S.

 

INTRODUCCION

Bartonella bacilliformis es una bacteria aeróbica Gram negativa, pleomórfica, móvil, que mide 2-3 µm de largo y 0.2 - 0.5 µm de ancho (1,2,3). Penetra y parasita glóbulos rojos, teniendo forma bacilar, cocoide o cocobacilar. Dichas formas se colorean con tinción Wright, Giemsa y Leishman (4,5,6).

B. bacilliformis es el agente etiológico de la Bartonelosis humana, enfermedad de Carrión o Verruga Peruana (7,8,9). Esta es una enfermedad infecciosa, oriunda del Perú, Colombia y Ecuador, que se presenta en los valles interandinos que se ubican entre los 500 a 3200 m.s.n.m., valles occidentales entre los 800 a 3200 m.s.n.m. y valles orientales del norte, donde existen condiciones ecológicas favorables que permiten que vectores del género Lutzomyia transmita la enfermedad (10,11,12). Existen zonas endémicas en los Departamentos de Piura, La Libertad, Ancash, Lima, Cajamarca, Amazonas, Junín, Huancavelica y se han reportado casos en Ayacucho y el valle del Mantaro (13,14). El departamento de Ancash es la zona endémica de mayor incidencia, reportándose casos en el Callejón de Huaylas y en el Callejón de Conchucos (15-18). Zonas "nuevas" donde se han reportado brotes se encuentran en San Ignacio (Cajamarca), Churuja (Amazonas) y en el valle de Urubamba, Calca y Quillabamba en Cuzco (19-22), considerándose en la actualidad como una enfermedad reemergente.

En cuanto al diagnóstico de la enfermedad, se tiene un diagnóstico presuntivo por epidemiología, clínica y examen del frotis de sangre. Sin embargo el diagnóstico definitivo depende del crecimiento de colonias en cultivo, cuya duración es de 2 a 4 semanas, todo lo cual resulta laborioso y prolongado.

En cuanto a otros métodos diagnósticos, la búsqueda de anticuerpos contra la Bartonella usando técnicas de ELISA e IFI encuentra positividad en más del 60% en pobladores nativos asintomáticos (23-29). Otra ayuda diagnóstica parte de la biología molecular, cuyos avances han permitido la detección más rápida y más eficiente de muchos agentes infecciosos a través de técnicas moleculares como la Reacción en Cadena de la polimerasa o PCR (30-33). La técnica de PCR consiste en la amplificación de una secuencia específica de un segmento de ADN en una simple reacción enzimática a través de la enzima ADN polimerasa y dos cebadores de extensión (primers), los cuales sintetizan el fragmento de ADN específico de una secuencia de ADN molde. Así, mínimas cantidades de ADN pueden ser amplificadas e identificadas, constituyéndose en una prueba diagnóstica sensible y rápida.

Previo al uso del PCR se extrae el ADN utilizando medios físicos como la lisis térmica, que lisa bacterias por elevadas temperaturas, o por el método de fenolcloroformo- alcohol isoamyl que purifica el ADN y remueve los productos de degradación, lo que conserva el ADN por mayores períodos. Para la extracción de ADN de sangre total se emplean detergentes que destruyen membranas celulares tales como guanidina (DNAzol^® BD). Finalmente, el objetivo de este trabajo fue estandarizar la prueba de PCR para la detección de Bartonella bacilliformis en muestras de sangre total de pacientes en fase aguda de bartonelosis.

El ADN extraído por los métodos de lisis térmica, fenol-cloroformo-alcohol isoamyl y DNAzol^® BD dieron un producto de amplificación por PCR de aproximadamente 1000 pares de bases, así como el producto amplificado de muestras de sangre total de pacientes con bartonelosis. Las diluciones mejores detectadas por PCR fueron 1/5 y 1/10 de la extracción de sangre total por DNAzol^® BD. Dicha concentración corresponde aproximadamente a 6 ηg de ADN.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

Tipo de estudio Experimental de laboratorio.

Muestras y cepas

Las muestras fueron obtenidas de pacientes de las áreas epidémicas de Huaral y Yauyos (Lima) y de Ollantaytambo (Cusco) y el área endémica de Caraz (Ancash). Fueron utilizadas muestras de sangre total (colectadas en tubos conteniendo solución

anticoagulante EDTA) de seis pacientes con diagnóstico clínico de Bartonelosis aguda (fiebre, anemia severa e ictericia) y diagnóstico microbiológico. Bartonella bacilliformis fue identificada en frotis teñido con colorante Giemsa y en hemocultivo en agar sangre (medio base agar Columbia).

Extracción del ácido nucleico de colonias a partir de hemocultivos

El ADN total de colonias de Bartonella bacilliformis a partir de hemocultivos fue obtenido según los métodos de extracción de ADN por lisis térmica, fenolcloroformo- alcohol isoamyl y DNAzol^® BD (34-36).

Extracción del ácido nucleico de sangre total

El ADN de la sangre total fue purificado según los métodos de extracción utilizando DNAzol^® BD (Helena BioSciences). Esta es una solución de lisis compuesta por el detergente guanidina, el cual lisa rápidamente a las células y denatura proteínas, permitiendo la precipitación de ADN.

 

Procedimiento de amplificación

Para la reacción de amplificación fueron requeridos los siguientes componentes a un volumen de reacción de 20uL: Buffer de reacción, 0,2mM de nucleótidos (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), 1 pmol/µl de cebadores de extensión (primers) los cuales anclan en la subunidad 16 S (3´) y subunidad 23 S (5´) del ADN ribosomal, amplificando la región altamente conservada del Espaciador de Trascripción Interna(ITS), 0.15 mM de MgCl2 y 1.5 U de la enzima Taq Polimerasa. Se incorporaron al tubo de reacción 6 ng de ADN. Terminada la mezcla de reacción los tubos fueron sometidos a una secuencia de ciclos programados en un Termociclador (P.E.) 480.

 

Análisis del patrón de bandas electroforéticas

Una cantidad de 8 µl del producto amplificado fue visualizado por medio de una electroforesis a través de un gel de agarosa al 1% (corrido a 80V y 110 mA por 45 minutos en Buffer TAE 1X). Transcurrido el tiempo de corrida fue coloreado el gel con bromuro de Etidio y fue expuesto a luz UV para observar las bandas de ADN obtenidas. Finalmente el gel fue fotografiado con una cámara Kodak Digital Science 1D ver 2.03, 1994-1997. Los tamaños (en pares de bases) correspondientes a las bandas fueron determinados por comparación directa con marcadores como λ/Hind III, 100 pb y 1 Kb.

 

Cuantificación de ADN

A partir de las extracciones obtenidas fueron realizadas las diluciones de 1/5, 1/10, 1/100 y 1/1000. De cada dilución fueron tomadas cantidades de 4, 6, 8 y 10 uL y fue realizada una corrida electroforética en gel de azarosa al 1%, coloreado con Bromuro de Etidio. La cantidad de ADN en ng correspondiente a cada banda fue determinada por comparación directa con los porcentajes de ADN correspondiente a cada banda del marcador λ/Hind III, a través de una fotografía con cámara Kodak Digital Science 1D.

 

Especificidad de los primers

Para determinar la especificidad de los primers fue obtenido el ADN total de colonias de Brucella mellitensis, especie relacionada filogenéticamente a Bartonellas (38,39), a partir de cultivo por el método de lisis térmica y fue amplificado según el método anteriormente mencionado. Así mismo el ADN de la sangre total de personas sin enfermedad fue purificado según el método de extracción utilizando DNAzol^® BD y también fue amplificado.

 

RESULTADOS

El ADN extraído de colonias a partir de hemocultivos por los métodos de lisis térmica, fenol-cloroformo-alcohol isoamyl y DNAzol^® BD dieron un producto de amplificación por PCR de aproximadamente 1000 pares de bases (Figura Nº1).

Asimismo, el producto amplificado de muestras de sangre total de pacientes con bartonelosis aguda utilizando DNAzol^® BD fue idéntico a aquellos de los hemocultivos de B. bacilliformis (Figura Nº2).

La concentración de ADN a ser usada fue calculada a partir de diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/100 y 1/ 1000) y las mejores detectadas por PCR fueron 1/5 y 1/10 de la extracción de sangre total obtenido por DNAzol^® BD. Dicha concentración corresponde aproximadamente a 6 ng de ADN (Figura Nº3).

A través de un método analítico de cuantificación se determinó que la cantidad de ADN total extraído con DNAzol^® BD de las muestras de sangre es alrededor de 2.98 ng/µl (6 ng de ADN crudo).El ADN extraído de sangre total de personas sin enfermedad utilizando DNAzol^® BD no fue amplificado por los primers anteriormente mencionados. El ADN de Brucilla mellitensis extraído de cultivo mediante el método de lisis térmica dieron un producto de amplificación por PCR de menos de 1000 pares de bases (Figura Nº4).

 

DISCUSIÓN

Se obtuvo el ADN de B. bacilliformis a partir de colonias a través del método de lisis térmica, el cual se caracteriza por ser un método sencillo y de bajo costo. Sin embargo la cantidad de otros productos presentes, algunos degradados, como ADNasas, ARNasas, lisozimas entre otros, no permite su conservación por períodos prolongados; por ello se requiere un procedimiento de purificación del producto de extracción.

Para una extracción purificada se aplicó el método de fenol-cloroformo-alcohol isoamyl que permite la remoción de los productos de degradación, lo que conserva el ADN por mayores períodos. Sin embargo requiere un tiempo prolongado de incubación y una serie de pasos que podrían contribuir a la contaminación por manipulación o degradación del ADN.

Por ello se utilizó un método alternativo y simple con DNAzol^® BD que no requiere muchos pasos, siendo rápido y de resultados comparables a los anteriores y posibilitando obtener resultados con mayor eficiencia tanto en tiempo como en calidad. Esto demostró la capacidad del DNAzol^® BD para extraer el ADN de Bartonella de los cultivos y su posterior aplicación en la extracción de ADN a partir de sangre total.

Para la extracción de ADN de sangre total se desarrolló un protocolo de extracción en el cual se realizó un primer paso de lisis a través del detergente guanidina del DNAzol^® BD y posteriormente la purificación del ADN total (ADN humano y de Bartonella bacilliformis) a través de la remoción de productos de degradación. Los resultados fueron satisfactorios.

Con respecto a los primers, para probar su especificidad se realizó una extracción de ADN de sangre total de una persona asintomática y foránea a dichas áreas endémicas, no amplificándose el ADN humano. Además se realizó lisis térmica de la bacteria Brucella

mellitensis, especie relacionada filogenéticamente a Bartonella (37,38), amplificándose un producto de menor tamaño al de Bartonella bacilliformis, comprobándose de esta manera que podemos discriminar entre otras bacterias e incluso entre otras especies de Bartonella (29). La diferencia en tamaño de las bandas se debe al tamaño del ITS.

Asimismo se realizó extracción de ADN de sangre total de 10 pacientes con diagnóstico de bartonelosis en fase crónica (formas verrucosas), no obteniéndose amplificaciones por PCR. Esto podría explicarse por la mínima carga bacteriana en sangre de estos pacientes, siendo el cultivo o el frotis de la sangre de las verrugas o la biopsia de las verrugas el método diagnóstico de elección en estos casos.

Finalmente pensamos que se deben seguir haciendo estudios que permitan obtener técnicas más apropiadas que aporten información importante para el diagnóstico, epidemiología y el futuro control de la enfermedad.

 

Agradecimientos:

Agradecemos a la DIRES y Salud de las Personas de las jurisdicciones de Yauyos (Dr. Luis Sialer, Blg. Andrés Vicente), Caraz (Blg. Nelson Solorzano, Marlon Flores), Huaraz (Blg. Karina Jaramillo, Dr. Paul Pachas), Cusco (Dr. Manuel Montoya, Blg. Victor Sucnier, Blga. Martha López, Blg. Edison Casapino) y Acos (Dr. Arturo Reyes, Dr. Martín Alvaro).

 

 

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Correspondencia:

Dr. Cesar Henríquez

Tupac Amaru Nº 1590

La Perla - Callao - Perú