INTRODUCCIÓN

La tuberculosis (TB) es una de las enfermedades de amplia transmisión debido a la facilidad de contagio del Mycobacterium tuberculosis a través de la vía aérea mediante aerosoles, teniendo altas tasas de morbimortalidad en los países de alta endemia, siendo considerada esta enfermedad como una pandemia de importancia mundial ¹.

Es importante destacar que la identificación del tipo de micobacteria ya que el tratamiento antituberculoso puede ser especifico dependiendo del agente causal ². Algunas de las técnicas de identificación no son prácticas debido a que son demasiada complejas o de alto costo como los desarrollos de técnicas moleculares e inmunológicas para ser desarrollados en muchos centros hospitalarios donde no se destinan suficientes recursos económicos ^(3,4. El método “microscopic-observation drug-susceptibility” (MODS) que se creó en el Perú y se fundamenta en un cultivo liquido en placas y en la que se puede observar microcolonias mediante un microscopio de fase invertida en la que se destaca la formación típica de cordones de M. tuberculosis y en la que este método ha demostrado mayor sensibilidad y especificad que los métodos automatizados BACTEC y Löwenstein-Jensen⁵ .

Existen diversos componentes bacterianos que nos indicarían diferencias en las colonias de los grupos de micobacterias como los ácidos grasos ⁶ que están vinculados a la forma de la colonia y la función de Mycobacterium kansasii ⁷. Cambios en Mycobacterium abscessus a nivel genético relacionado a la síntesis de la trehalosa 6,6- dimicolato se vincula a la formación de cordones, siendo reconocido como un factor de virulencia, resulta en el cambio morfológico de la colonia y al factor de poder colonizar y causar infección en modelos animales, donde se observó que las colonias crecieron en medio 7H11 en 7 días con una clara diferencia en la forma ⁸.

El objetivo de nuestro estudio fue determinar si la formación de cordones ocurre en la microcolonias de M. kansasii.

MATERIAL Y MÉTODOS

Investigación microbiológica, prospectiva de corte transversal que se fundamenta en la identificación a nivel de colonia y celular a nivel microscópico de las especies de micobacterias que causan tuberculosis. Se utilizó la especie M. kansasii (CAP- College of American Pathologists) del cepario referencial del Instituto de Medicina Tropical de la Universidad Peruana Cayetano Heredia: También se trabajó con M. abscessus y M. tuberculosis (Cepa H37Rv ATCC) como cepas de crecimiento lento y controles de formación de cordones y M. neoaurum como una cepa control de crecimiento rápido. Las especies que se utilizaron estuvieron preservadas en medio indicador de crecimiento de micobacteria en tubo “MIGT”. Se tomó una alícuota del medio MIGT para cada especie ajustándolo a escala 5 de McFarland. Posteriormente se realizó una dilución 1/10 y se sembró en placas en medio solido 7 H11.

Preparación de medio sólido 7H11 y siembra

El medio 7H11 fue preparado según método previamente descrito ^9). Posteriormente se tomó 200 ul de la dilución 1/10 con una pipeta de 1 ml y se colocó en cinco puntos equidistantes en la placa de 7H11 y se homogenizó manualmente moviendo la placa en círculos concéntricos para que la siembra se extienda. Cada especie de micobacteria fue sembrada en tres placas para disponer de dos repeticiones por especie.

Lectura e interpretación

Las placas que se sembraron en el medio 7 H11 se colocaron a 37 C^o, en una incubadora sin CO₂ en el laboratorio de nivel III de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. Se realizo lectura con microscopio de fase invertida a un aumento de 100X diaria excepto sábados y domingos hasta por 21 días. Se empezó a fotografiar diariamente cada muestra de las especies estudiadas determinando sus características incluido la formación de cordones.

Tinción Ziehl Neelsen

Del tubo 5 de McFarland se colocó una alícuota de 50 ul aproximadamente y se extendió en una lámina portaobjeto limpia. Posteriormente se colocó fucsina fenicada sobre la muestra se calentó la muestra durante 5 minutos evitando que hierva y posteriormente se decoloró con alcohol acido, se lavó y se adicionó el colorante de contraste azul de metileno por un minuto y se lavó para que finalmente la lámina seca pueda ser leída con un aumento total de 1000X. Se realizó el procedimiento por triplicado para cada especie de micobacteria. Se identificó la formación de cordones (agregación multicelular con disposición de cordones) o la formación de cadenas (agregación unicelular en continuidad) en bacterias alcohol acido resistente tomadas del medio líquido debido a que los estudios primarios de la formación de cordones se han realizado en los medios líquidos por las propiedades físicas del medio para observar las tendencias de agregación.

El estudio es de nivel básico sin involucrar animales y no fue derivado al comité de ética.

RESULTADOS

La identificación microscópica de la primera colonia de las micobacterias en estudio fue entre el primero y catorceavo día (Tabla 1). Todas las micobacterias estudiadas presentaron la presencia de cordones claramente marcado (Figura 1).

Tabla 1 Características microbiológicas de las micobacterias a 37 °C. 

*Formación de cordones vistas en la lectura Ziehl-Neelsen

Figura 1 De izquierda a derecha hacia arriba (M. tuberculosis y M. kansasii) 1000X. De izquierda a derecha hacia abajo (M. absessus) 1000X y microfotografía a los 14 días de crecimiento de M. tuberculosis, 100X. Todas las micobacterias tuvieron el mismo patrón en el medio solido 7H11. 

Mediante coloración de Ziehl Neelsen, se observó la formación de cordones en M. kansasii, M. abscessus, y M. tuberculosis (figura 1), a comparación de la cepa control de crecimiento rápido M. neoaurum que no formó cordones y en contraste se observó bacilos unicelulares.

DISCUSIÓN

El estudio realizado se basó en la investigación bacteriológica del tiempo de crecimiento y la forma de las microcolonias de diferentes especies de micobacterias patógenas (Mycobacterium kansasii, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium neonarum) que pueden ser aisladas de muestras clínicas y en las cuales se pudo observar la formación de cordones ¹⁰. En el estudio de las especies de micobacterias se encontró diferencias en cuanto al tiempo mínimo para la detección microscópica que varió entre uno y catorce días, lo que nos indica una detección temprana. Los resultados son relevantes porque identificó la formación cordones a nivel microscópico en las especies evaluadas como en M. abscessus y M kansasii aunque esto es particular de M. tuberculosis y se relaciona a los mecanismos de virulencia de la bacteria ⁸.

Las características de agrupación celular en muestras teñidas con el método de Ziehl-Neelsen para cada colonia de M. kansasii y M. tuberculosis mostraron un patrón de bacilos agrupados formando una forma bien marcada de cordones, en los casos de M. abcsessus formaban un agregado formando cordones finos y en el caso de M. neoaurum no se observó la formación de cordones.

Las micobacterias estudiadas formaron cordones en etapas tempranas en el medio 7H11. Esta particularidad de la formación de cordones fue reportada por primera vez por Robert Koch y se atribuye a una relación entre la virulencia y el fenotipo de M. tuberculosis ⁸, posteriormente se descubrió la formación de cordones por Mycobacterium abscessus ¹¹.

La relevancia clínica de estos hallazgos es que varias técnicas de diagnóstico para la tuberculosis como el MODS se basan en la identificación microscópica de los cordones relacionada con M. tuberculosis ⁹, sin embargo, podría ser mal identificado cuando otra especie de micobacteria de crecimiento lento como M. kansasii también forma cordones en medio sólido como líquido como se corroboró en el medio 7H11 y por la técnica microscópica Ziehl-Neelsen (MIGT), pudiendo conducir a un mal diagnóstico, confundiendo a M. kansasii con M. tuberculosis suponiendo una identificación de M. tuberculosis multidrogo-resistente cuando se trataría de M kansasii con resistencia natural a ciertas drogas antituberculosas, por lo que se haría necesario otro esquema terapéutico ¹². Se recomienda adicionalmente el uso del medio solido 7H11 para el aislamiento e identificación de resistencia a las drogas debido a que es de mejor bioseguridad que los medios líquidos y de corto tiempo de crecimiento de las micobacterias cuando se compara al MODS y al medio de Löwenstein-Jensen, respectivamente. Aunque estudios previos mostraron en M. kansasii la disposición bacilar para formar agregaciones como escaleras, nuestro estudio muestra claramente formación de cordones ^13,14.

El cuadro clínico de la enfermedad pulmonar causada por M. kansasii en su mayoría es la presentación de la forma nodular bronquioectático, siendo además importante la identificación del agente etiológico que causa una enfermedad que requiere un tratamiento largo con un promedio de 15 meses ¹⁵.

En este estudio se utilizó una metodología descrita previamente para determinar la formación de cordones tanto a nivel de microcolonias por microscopia de fase invertida como por microscopia óptica simple utilizando la tinción Ziehl-Neelsen¹⁶ .

Una limitación del presente trabajo se basa en no haber realizado microscopia electrónica y observar la ultraestructura de agregación a nivel celular de las micobacterias. Aunque los hallazgos presentes son aportes para la salud pública.

Se concluye que M. kansasii fue capaz de formar cordones en una fase temprana.