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Revista de Gastroenterología del Perú

versión impresa ISSN 1022-5129

Rev. gastroenterol. Perú vol.36 no.4 Lima oct./dic. 2016

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Lactoferrina bovina disminuye la invasión de Salmonella enterica en células HEp-2

Bovine lactoferrin decreases the invasion of Salmonella enterica to HEp-2 cells

 

Liz J. Barreto Arce1, Carmen A. Contreras García2, David Durand Vara2, Theresa Ochoa Woodell2

1 Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.

2 Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú.


RESUMEN

Objetivo: Evaluar el efecto de la lactoferrina bovina (Lfb) en el proceso de invasión de Salmonella enterica ser. Typhimurium en células HEp-2. Materiales y métodos: Se infectaron células HEp-2 con 106 unidades formadoras de colonia (UFC) de la bacteria en ausencia y presencia de 1 y 10 mg/mL de Lfb (saturada con hierro) durante 1,5 horas a 37°C. En este estudio evaluamos 2 tratamientos: pre-infección (las células HEp-2 se incubaron con Lf 1 hora, previo a la infección con Salmonella) y post-infección (la Lfb se adicionó 15 minutos después de la infección). La capacidad de invasión de Salmonella se determinó mediante la cuantificación de las UFC recuperadas desde el interior de las células HEp-2 (después del tratamiento con 100 μg/mL y 10 μg/mL de gentamicina y Triton X-100). Resultados: En el tratamiento pre-infección se observó una disminución de 23% en la invasión de Salmonella cuando las células HEp-2 fueron pre-incubadas con 1 mg/mL de Lfb (2,8x105 vs 2,1x105, p=0,04) y una disminución de 50% cuando fueron pre-incubadas con 10 mg/mL de Lfb (2,8x105 vs 1,4x105, p=0,04). Con el tratamiento post-infección no se observaron cambios en la capacidad de invasión de Salmonella. Conclusiones: Los resultados indican que Lfb reduce la capacidad de invadir de Salmonella enterica ser. Typhimurium a células HEp-2 en el tratamiento pre-infección.

Palabras clave: Salmonella; Lactoferrina; Infecciones por Salmonella; Diarrea (fuente: DeCS BIREME).


ABSTRACT

Objective: To assess the effect of bovine lactoferrin (bLf) on the invasion of Salmonella enterica ser. Typhimurium to HEp-2 cells. Materials and methods: HEp-2 monolayers were infected with 106 colony forming unit (CFU) of bacteria in the absence and presence of 1 and 10 mg/mL of bLf (iron-saturated) and incubated 1.5 hours at 37°C. Two treatments were evaluated: preinfection (HEp-2 cells were incubated with bLf one hour prior to infection with Salmonella) and post-infection (bLf was added 15 minutes after the infection). Invasiveness of Salmonella was determined throgh quantification of CFU recovered from inside the HEp-2 cells (after treatment with 100 μg/mL and 10 μg/mL of gentamicin and Triton X -100). Results: In the pre-infection treatment, we observed a decrease of 23% of Salmonella invasion when HEp-2 cells were pre incubated with 1 mg/mL of bLf (2.8x105 vs 2.1x105, p=0.04) and 50% when them were pre-incubated with 10 mg/mL of bLf (2.8x105 vs 1.4x105, p=0.04). In post-infection treatment, no changes were observed in the invasiveness of Salmonella. Conclusion: The results indicated that bLf reduces the invasiveness of Salmonella enterica ser. Typhimurium to HEp-2 cells in the pre-infection treatment.

Keywords: Salmonella; Lactoferrin; Salmonella infections; Diarrhea (source: MeSH NLM).


INTRODUCCIÓN

Las salmonellas son bacterias gram-negativas que comprenden alrededor de 2500 serotipos, muchos de los cuales son patógenos importantes de humanos y animales. Dos de las principales manifestaciones clínicas causadas por Salmonella son: gastroenteritis (salmonelosis) y fiebre entérica (tifoidea). La gastroenteritis es la más común de las infecciones intestinales causada por muchos serotipos. Este tipo de infección no está acompañado de una infección sistémica como en el caso de la fiebre entérica. Los serotipos más comunes asociados a la gastroenteritis son Salmonella enterica serotipo Typhimurium (S. typhimurium) y S. enteritidis (1,2).

Salmonella es adquirida por ingestión de agua y/o alimentos contaminados, sobrevive a los ácidos gástricos del estómago hasta llegar a colonizar el epitelio del intestino. Después del contacto de la bacteria con las células hospederas, ésta transloca proteínas efectoras a través de un sistema de secreción tipo III (SST3), lo que permite la invasión a través de la membrana plasmática, lo que resulta finalmente en la inducción de la respuesta inflamatoria intestinal (2).

Las infecciones gastrointestinales son una de las principales causas de enfermedad y muerte en niños; estas infecciones pueden causar más de 3,3 (15%) millones de muertes por año en niños menores de 5 años de edad en países en vías de desarrollo (3). Por otro lado, la lactancia materna se ha identificado como la intervención más efectiva para proteger a los niños menores de 5 años de edad contra las diarreas (4). El efecto protector de la leche materna parece ser un evento complejo y es atribuido al contenido de inmunoglobulinas A (IgA) y compuestos no inmunológicos como la lisosima y lactoferrina (5). La lactoferrina (Lf), una glicoproteína de 80 kDa, es la segunda proteína más abundante de la leche materna. Se encuentra en una concentración de 10 mg/mL y 1 mg/mL en el calostro humano y en la leche madura, respectivamente (4). Esta proteína es multifuncional y es considerada un componente esencial de la respuesta inmune innata. Entre sus funciones destacan sus actividades como microbioestático, microbicida de amplio espectro, antitumoral y antioxidante. Además, por el hecho de contener hierro se ha postulado como una proteína con valor nutricional (6).

Se han propuesto múltiples mecanismos para explicar el efecto de la lactoferrina y su interacción con enteropatógenos. Se conoce que la lactoferrina no sólo secuestra hierro, el cual es esencial para el crecimiento bacteriano (capacidad bacteriostática), sino que también puede adherirse a porinas y al lípido A del lipopolisacárido bacteriano (LPS) presente en la membrana externa de las bacterias Gram negativas, cambiando su rigidez y consecuentemente desestabilizándolas (7). Estudios in vivo e in vitro han demostrado el efecto protector de la lactoferrina humana (Lfh) así como la lactoferrina bovina (Lfb) contra diferentes infecciones por enteropatógenos, las cuales incluyen: Shigella flexneri, Salmonella ser. Typhimurium, E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli productor de toxina Shiga (STEC) y E. coli enterotoxigénica (ETEC) (8).

En este estudio se evaluó el efecto de la lactoferrina bovina (Lfb) en la invasión de Salmonella typhimurium cepa SL 1344 a células HEp-2.

MATERIAL Y MÉTODOS

Bacteria y condiciones de cultivo

En este estudio fueron usadas Salmonella enterica ser. Typhimurium SL1344 silvestre (NCTC 13347) y Salmonella enterica ser. Typhimurium SL1344 ΔhilA::Kanr. Esta última cepa fue usada como control negativo de los ensayos de invasión ya que está afectada en su capacidad de translocar proteínas efectoras a través del SST3 y por consiguiente en su capacidad de invasión.

Las bacterias fueron cultivadas en caldo Luria Bertani (LB) a 37°C.

Cultivo de células y ensayo de invasión

En los ensayos se usó la línea celular HEp-2 (human larynx carcinoma). Las células HEp-2 fueron cultivadas en placas de 24 pozos en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bobino fetal (SBF) durante 24 h a 37°C en un atmósfera de 5% de CO2 (hasta obtener una confluencia de 70%).

El ensayo de invasión se desarrolló siguiendo la metodología descrita por Lee et al. (9). Las células previamente cultivadas en las placas de 24 pozos fueron infectadas con 106 UFC de Salmonella durante un periodo de 1,5 h a 37°C y bajo una atmósfera de 5% de CO2.

Para determinar el papel protector de la Lfb frente a la invasión de Salmonella se probaron diferentes condiciones de tratamiento:

Se usaron dos concentraciones diferentes de Lfb (Tatua Nutritionals, Nueva Zelanda): 1mg/mL (0,0125 mmol/L) Lfb y 10 mg/mL (0,125 mmol/L) Lfb, las cuales corresponden a la concentración de Lf presente en el calostro y leche madura humana, respectivamente.

La Lfb tiene un efecto bacteriostático por su afinidad a ligarse con los iones de hierro; por este motivo se suplementó el medio de resuspensión bacteriana con hierro (en una relación 2:1 molar respecto a la concentración de Lfb) para demostrar que la disminución de la invasión no se debe al efecto bacteriostático de la Lfb (disminución en el crecimiento bacteriano) sino por otro mecanismo no-dependiente del hierro.

Así mismo se analizaron dos tratamientos diferentes: i) Pre infección: las células HEp-2 fueron incubadas con Lfb (0, 1 y 10 mg/mL en DMEM) 1h previa a la infección bacteriana, y ii) Post infección: las células HEp-2 fueron infectadas con Salmonella durante 15 minutos, luego las células fueron tratadas con Lfb (0, 2 y 20 mg/mL en DMEM).

Luego de la infección, la monocapa de células infectadas fue lavada 5 veces con PBS 1X para remover las bacterias no adheridas. Adicionalmente, se realizaron 2 tratamientos con gentamicina (1 ml de DMEM - HEPES + 100 μg/mL de gentamicina) 1 hora/37°C, seguido de 1 ml de DMEM - HEPES + 10 μg/mL de gentamicina 2 horas/37°C), con la finalidad de matar la totalidad de las bacterias extracelulares.

Cuantificación de la invasión

Luego del periodo de infección se adicionó 100 μl de Triton X-100 1% (v/v) y se dejó incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Posteriormente, se removió el contenido de cada pozo (despegando y lisando las células para liberar las bacterias). Luego, se realizaron diluciones seriadas (1:10, 1:100 y 1:1000) de cada pocillo y se sembró 50 μl de cada dilución en placas de agar Mc Conckey.

Todos los ensayos se realizarán por duplicado, los mismos que se repitieron 3 veces.

Análisis Estadístico

La comparación entre los tratamientos fueron analizados por la prueba de Mann-Whitney, el nivel de significancia fue definido como p <0,05. El programa SPSS versión 19.0 fue usado para los análisis.

RESULTADOS

Tratamiento pre-infección

Las células HEp-2 pretratadas con Lfb mostraron una disminución significativa en la invasión en comparación con el control (Figura 1). La capacidad invasiva de Salmonella disminuyó 50% con Lfb a 10 mg/mL (2,8x105 UFC/mL vs. 1,4x105 UFC/ml, U de Mann-Whitney, p=0,04) y 23% con Lfb a 1 mg/mL, en comparación con el control (2,8x105 UFC/mL vs. 2,1x105 UFC/mL, U de Mann-Whitney, p=0,04).

Tratamiento post-infección

En el tratamiento de post-infección, no hubo diferencia significativa, lo cual indica que Lfb no pudo proteger a las células HEp-2 de la infección. La invasión de Salmonella en la cepa silvestre sin tratamiento fue 2,8 x 105 UFC/mL, mientras que en el tratamiento con Lfb a 1 mg/mL fue 4,0x105 UFC/mL (rango promedio = 7; U de Mann-Whitney, p=0,117) y 2,3x105 UFC/mL (rango promedio = 5; U de Mann-Whitney, p=0,602) con Lfb a 10 mg/mL.

La cepa de control negativo (SL1344 ΔhilA::Kanr) no mostró invasión de células HEp-2 en los dos tratamientos evaluados.

DISCUSIÓN

La capacidad de la leche humana, así como sus fracciones de proteínas, para inhibir la adhesión y/o invasión de patógenos entéricos ha sido evaluado en diversos estudios desarrollados in vivo e in vitro (10-12). Se ha evidenciado que Lf puede contribuir a la defensa contra la invasión de bacterias intracelulares facultativas mediante la unión de glicoaminoglicanos de la membrana celular e invasinas bacterianas, previniendo de esta manera la adhesión a las células (13).

Se ha observado que Lf disminuye la virulencia de algunos de los principales patógenos al disminuir su habilidad de adherirse o invadir células mamíferas, y al unirse o degradar proteínas de virulencia específicas (8). En cultivos celulares, se ha mostrado que Lfb interactúa con las proteínas de superficie de Salmonella typhimurium y reduce su habilidad de adhesión a las células huésped (10). Mosquito et al. (14), demostraron el efecto protector in vivo de la Lfb en la infección de Salmonella typhimurium en ratones. Los ratones que fueron infectados con Salmonella y recibieron tratamiento con Lfb tuvieron menos mortalidad y signos clínicos típicos de la infección (piloerección, encorvamiento y reducción en el movimiento) así como también disminución del daño en la integridad del epitelio intestinal.

Se ha demostrado que Lfb puede proteger contra la infección de bacterias gram-negativas debido a su actividad bacteriostática y bactericida. La acción bacteriostática de Lfb se debe a su capacidad de captar el hierro, lo cual limita la disponibilidad de este nutriente esencial para la bacteria y por lo tanto la inhibición del crecimiento, así como la expresión de algunos factores de virulencia (15). En el presente trabajo, empleamos el medio saturado con hierro y así confirmamos que el efecto inhibidor de Lfb no se debió a un efecto bacteriostático (datos no mostrados).

Los resultados obtenidos en el tratamiento preinfección sugieren que la inhibición de la invasión observada se debe a la protección celular, posiblemente por la unión de Lfb a la superficie bacteriana; y de esta manera se bloquearía la adherencia y la invasión de las células. Por esta razón, postulamos la hipótesis que Lfb podría ser su usada como un tratamiento profiláctico para la infección por Salmonella. Este hallazgo podría estar relacionado con el estudio de la infección de S. typhimurium reportado por Naidu et al. (16), donde demostraron la interacción de Lf y LPS. Lf bloquea proteínas de sistema de secreción tipo 3 (SST3) que son las responsables de la polimerización de la actina de las células epiteliales como resultado de la infección de EPEC y S. flexneri (11,12,17). En este contexto, el efecto de Lfb en la invasión de Salmonella a células HEp-2 podría ser debido a un mecanismo similar como en Shigella.

Por otro lado, los resultados obtenidos en el tratamiento post-infección muestran que la Lfb no pudo revertir el proceso de invasión de Salmonella a las células HEp-2. Nosotros suponemos, que los resultados conseguidos en el tratamiento post-infección con Lfb a 1 mg/mL se deba a que la concentración de Lfb fue insuficiente para disminuir la invasión, lo cual se evidenció en el incremento de bacterias intracelulares obtenidas en el estudio. Presumimos que el periodo de incubación fue suficiente para que la bacteria pueda invadir la monocapa de células HEp-2; por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la administración de Lfb después de ocurrida la infección con Salmonella, no ayudaría a controlar y/o disminuir la invasión en ensayos in vitro.

En base a los resultados observados podemos concluir que Lfb reduce la invasión de Salmonella enterica ser. Typhimurium en células HEp-2. La disminución de la invasión fue mayor en el tratamiento pre-infección con Lfb en la concentración de 10 mg/mL. Estos datos sugieren que Lfb podría actuar como un compuesto protector contra infecciones causadas por Salmonella.

Agradecimientos

Las cepas de Salmonella usadas en este estudio fueron gentilmente donadas por el Dr. José Luis Puente (Instituto de Biotecnología de la Universidad Autónoma de México).

Fuente de financiamiento: este estudio fue parcialmente financiado por el Fondo de apoyo a la investigación de la Universidad Peruana Cayetano Heredia otorgado a la Dra. Theresa Ochoa.

Conflictos de intereses: los autores no declaran conflicto de intereses.

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Correspondencia:

Liz Barreto Arce

E-mail: liz.barreto.arce@gmail.com

 

Recibido: 04-02-2016

Aprobado: 22-07-2016