INTRODUCCIÓN

La fasciolosis es una enfermedad zoonótica importante causada por los parásitos Fasciola hepatica y F. gigantica. Siendo F. hepatica la causante de las altas prevalencias en América Latina, África, Oceanía, Europa y Asia, tanto en humanos como en animales ¹.

La fasciolosis constituye en la actualidad un problema importante de salud pública, considerada una enfermedad tropical desatendida a nivel mundial por la OMS, por su distribución y su potencial patogenicidad extrema con estimaciones de infección que llega a afectar entre 2,4 y 17 millones de personas en el mundo y más de 180 millones pueden estar en riesgo ². Los informes de prevalencia indican que esta enfermedad está latente y en proceso de expansión debido al cambio climático, el calentamiento global, las modificaciones antropogénicas del medio ambiente, el aumento de los viajes de corta y larga distancia y las instalaciones de importación/exportación, llegando hasta un 71,4% en zonas endémicas ³. Sin embargo, la verdadera prevalencia puede ser mayor porque la mayoría de los casos en las zonas endémicas permanecen sin diagnosticar.

En Latinoamérica, la distribución de casos se ubica en zonas de la región andina de Perú, Bolivia, Ecuador, Colombia, Venezuela y Argentina ². En el Perú es un gran problema de salud con reportes de prevalencia entre 6,3 y 62% ⁴, se estima que puede haber hasta 742 000 personas afectadas con reportes de casos en 18 de las 24 regiones del país, siendo las de mayor prevalencia Junín, Puno, Cajamarca, Cusco y Arequipa ⁵.

La magnitud del impacto de la fasciolosis en las comunidades de áreas endémicas está dirigida principalmente a niños y mujeres, con una patogenicidad considerada hasta hace poco solo a la fase aguda, pero recientemente se ha demostrado ser un problema de salud durante una fase crónica muy larga ³. En la actualidad, la prevalencia no ha disminuido y está en peligro de expansión, no obstante, la carga de la enfermedad es subestimada debido a la escasa sensibilidad de las pruebas de diagnóstico, limitados datos epidemiológicos disponibles y una mala comprensión del impacto de la enfermedad subclínica. Todos pueden ser infectados por F. hepatica produciendo anemia, afecciones neurológicas y oftalmológicas, pérdida de peso y daño hepático; además, del riesgo de reinfección en zonas hiperendémicas y la cronicidad está presente en los infectados debido a la enorme longevidad de la fasciola en humanos (hasta 13,5 años) ^6,7. Por ello, El Gobierno Peruano está realizando iniciativas para abordar el problema de la fasciolosis, a través de la Resolución 266-2019/Minsa, ha aprobado la Norma NTS 148-MINSA/2019/DG/ESP.

El diagnóstico de la fasciolosis por métodos sensibles y específicos es una etapa clave para el tratamiento de pacientes sospechosos. Clínicamente, el diagnóstico es difícil porque los síntomas son diversos y se asemejan a los de una variedad de otras enfermedades. El método de diagnóstico coprológico convencional se utiliza como estándar de oro para la Fasciolosis humana. Sin embargo, este método no suele ser confiable y carece de sensibilidad y reproducibilidad porque los huevos no se pueden detectar durante el período inicial de la infección solo cuando ya se ha producido daño hepático por trematodos inmaduros. Mientras que los anticuerpos pueden detectarse después de 2 a 7 semanas después de la infección, es por ello, que las pruebas serológicas pueden desempeñar un papel clave en el diagnóstico de fascioliasis humana aguda cuando los huevos aún no son obvios en las heces ².

Las pruebas serológicas más utilizadas en el diagnóstico de la fascioliasis humana son la de Elisa y Western blot; sin embargo, estas técnicas usualmente requieren de equipamiento, procesos complicados y personal capacitado, por lo que es difícil su aplicación en zonas endémicas alejadas del país, donde se requiere una rápida detección de anticuerpos in situ. Esta es una fortaleza de las pruebas rápidas por la técnica de inmunocromatografía o flujo lateral (LFIA), considerados los biosensores más simples y más utilizados para la detección analítica ⁸ y ya se vienen usando en el diagnóstico de algunas parasitosis como Chagas ⁹, hidatidosis ¹⁰, esquistosomiasis ¹¹, malaria y dengue ¹².

Siendo la fasciolosis una de las enfermedades tropicales desatendidas incluidas en el Plan de Control 2021-2030 ¹³, es necesario mejorar su diagnóstico. Por ello, se busca desarrollar una prueba basada en flujo lateral que por su simplicidad beneficie la gestión de control de enfermedad en diferentes áreas endémicas, para el manejo adecuado de casos y un tratamiento oportuno en zonas de alta endemicidad.

El objetivo del presente estudio fue estimar el rendimiento diagnóstico de la prueba de inmunocromatografía o flujo lateral (Fasciorap) para la detección de anticuerpos en pacientes con Fasciolosis humana.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio observacional, prospectivo y de corte transversal. Un total de 254 muestras de sueros humanos fueron seleccionadas para la elegibilidad del estudio, cuyas edades están entre 4 y 50 años, ambos sexos y sin tratamiento previo, del total de muestras, se excluyeron 14, ocho por contener muy poco volumen y luego en la evaluación se excluyó a seis por presentar multiparasitismo (Figura 1, diagrama de flujo de muestras participantes en el estudio por STARD).

Figura 1 Diagrama de flujo de muestras positivas y negativas incorporadas en el estudio. 

Se evaluaron 240 muestras, siendo 120 sueros positivos y 120 negativos a fasciolosis obtenidos entre los años 2019 y 2020, las cuales fueron seleccionadas por conveniencia y proporcionadas por la seroteca de la Universidad Nacional de Trujillo, Universidad Nacional de Cajamarca, Laboratorio Escalabs y por participantes del estudio de las ciudades de Combayo en Cajamarca y Pachacayo en Jauja, tomadas con el apoyo de Centro de salud a aquellos que accedieron al examen, llegando al centro voluntariamente y firmando un consentimiento informado.

Las muestras obtenidas se confirmaron por la técnica de sedimentación rápida descrita por Maco ¹⁴, y la prueba serológica Western blot descrita por Escalante ¹⁵.

Se desarrolló una prueba rápida que permite el diagnóstico serológico cualitativo de la Fasciolosis humana (Fasciorap) mediante la técnica de flujo lateral cuyo diseño incluye una membrana de nitrocelulosa con una línea de prueba que contiene proteína A y una línea control con anticuerpos anti F. hepatica, flanqueada en un extremo por una almohadilla de muestra y una almohadilla de conjugado formado por antígenos de excreción-secreción de formas adulta del parásito con oro coloidal de 40 nm y por el otro extremo una almohadilla absorbente, todos sobre un respaldo de plástico ensambladas en un cassette de polipropileno (Figura 2).

Figura 2 Esquema de la prueba rápida Fasciorap. 

La prueba se realizó agregando 10 uL de suero sobre la almohadilla de la muestra con 70 uL de buffer de muestra; la interpretación de los resultados se realizó por inspección visual a los 15 min de aplicada la muestra. La aparición de dos líneas rojas en las zonas de prueba y control indican una reacción positiva y una sola en la línea control indica reacción negativa (Figura 3).

Figura 3 Resultados del análisis con la prueba rápida Fasciorap: Positivo (+) y Negativo (-). 

El rendimiento diagnóstico de la prueba fue evaluado con los siguientes parámetros: sensibilidad, especificidad, valores predictivos, razones de verosimilitud (LR), índice de validez, prevalencia, índice de Youden y Kappa considerando un nivel de confianza de 95%. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa Epidat v3.1 y Excell. Para determinar la repetibilidad se evaluaron seis sueros por un mismo analista, repitiendo tres veces en tres días diferentes y la reproducibilidad fue evaluada por tres analistas en tres repeticiones, pertenecientes a diferentes laboratorios de la empresa bajo sus condiciones.

Este estudio fue aprobado por Comité Institucional de Ética en Investigación (acta de reunión N° 004 reúne las consideraciones éticas establecidas en el Reglamento del Comité de Ética en Investigación de la Universidad Nacional de Trujillo por RCU N° 268- 2012/UNT). Realizado de acuerdo con los estándares para la presentación de informes de estudios de precisión diagnostica (STARD) ¹⁶ y las muestras fueron obtenidos bajo procedimientos de consentimiento informado y procesados en condiciones de completa anonimización.

RESULTADOS

De los 120 sueros positivos a fasciolosis por la prueba rápida, 111 dieron reacción positiva y nueve salieron negativos (Figura 4). De los 120 sueros negativos, 113 dieron reacción negativa y siete reacción positiva (Figura 5).

Figura 4 Patrón de reactividad de la prueba Fasciorap con sueros positivos a Fasciolosis humana. 

Figura 5 Patrón de reactividad de la prueba Fasciorap con sueros positivos a otras parasitosis a otras parasitosis, enfermedades infecciosas y sin presencia de huevos y anticuerpos a F. hepatica. 

La sensibilidad de la prueba Fasciorap para detectar anticuerpos anti F. hepatica fue de 92,50% (IC95%: 87,37-97,63%), una especificidad del 94,17% (IC95%: 89,56-98,78%). El valor predictivo positivo fue de 94,07% (IC95%: 89,38-98,75%), valor predictivo negativo 92,62% (IC95%: 87,57-97,67%), razón de verosimilitud positiva 15,86 (IC95%: 7,71-32,60) y razón de verosimilitud negativa (LR-) de 0,08 (IC95%: 0,04-0,15), índice de validez 93,33%, prevalencia 50% e índice de Youden 0,87 (Tabla 1).

Tabla 1 Sensibilidad, especificidad, valores predictivos, razón de verosimilitud, índice de validez, prevalencia e índice de Youden de la prueba de rápida por flujo lateral para la detección de anticuerpos en pacientes con Fasciolosis humana. 

La repetibilidad y reproducibilidad fue del 100%, encontrando los mismos resultados en las diferentes evaluaciones.

Los resultados demostraron que Fasciorap presenta una concordancia sustancial (k = 0,867) con los resultados obtenidos con la técnica de Western blot.

DISCUSIÓN

Este estudio observacional, prospectivo y de corte transversal tuvo como objetivo evaluar el rendimiento diagnóstico de la prueba rápida Fasciorap diseñada para detectar anticuerpo IgG contra F. hepatica, a partir de muestras de suero humano.

Los resultados mostraron una sensibilidad de la prueba rápida igual al Western blot, pudo deberse a que se usó el mismo antígeno de E/S de F. hepatica, o al uso de la Proteína A en la línea de prueba que tiene la capacidad de unirse en forma específica al fragmento Fc de las IgG y ninguna o muy baja por las IgM, similar acción realizada por el conjugado enzimático en el Western blot. Aunque se conoce que las pruebas rápidas a menudo son menos sensibles que las pruebas de Elisa o Western blot, el uso de estos antígenos proporciona esa sensibilidad ya que son una mezcla de moléculas proteicas como catepsina L cisteína proteasas en > 80% o del glutatión S-transferasa secretadas tanto por los parásitos inmaduros y maduros responsables de evocar una respuesta de anticuerpos potente y duradera ¹⁷. Los falsos negativos encontrados podrían deberse a una baja intensidad de infección, ya que los sujetos humanos que viven en áreas endémicas a menudo podrían ingerir dosis bajas de metacercarias, y una dosis de infección tan baja podría afectar el desarrollo de niveles detectables de anticuerpos contra un antígeno en particular ¹⁸.

Mientras que la especificidad encontrada nos indica que hay reacciones cruzadas con sueros positivos a cisticercosis, hidatidosis e himenolepiosis, no podemos afirmar que sean verdaderos seropositivos porque desconocemos si las muestras proporcionadas no contengan anticuerpos a F. hepatica debido a la existencia de multiparasitismo en el Perú; sin embargo, también es muy posible que estos sueros sean verdaderas reacciones cruzadas debido a la existencia de epítopos comunes entre F. hepatica y proteínas de otros parásitos. La reactividad cruzada entre antígenos de helmintos es común debido a que existe una gran cantidad de proteínas que se conservan durante la evolución y comparten epítopos comunes y también porque usamos el antígeno total a pesar de ser purificado por diversas técnicas aún pudiese conservar proteínas homologas; mientras que en el Western blot solo se diagnosticó en base a las dos bandas específicas de 23 y 17 KDa; similares resultados se reportaron en otras investigaciones ^2,18,19.

La mayoría de los kits serológicos comerciales disponibles, se basan en productos excretores/secretores (E/S) como antígeno. Este antígeno complejo ha demostrado una alta sensibilidad para el diagnóstico de infección, sin embargo, a menudo presenta una menor especificidad debido a los diversos niveles de reactividad cruzada entre los antígenos comunes de F. hepatica en otros helmintos. Además, la falta de un método estándar eficiente para la preparación del antígeno E/S con una calidad constante conduce a la variabilidad inter ensayo de las pruebas serológicas. Un paso adelante para mejorar las pruebas de detección es sustituir los antígenos nativos por proteínas recombinantes, proceso limitado actualmente por su alto costo ²⁰.

Los altos valores predictivos encontrados proporcionan la seguridad de que un resultado de la prueba tiene una alta probabilidad de que un individuo con un resultado positivo, sea efectivamente un enfermo; como también la probabilidad de que un individuo con un resultado negativo esté efectivamente libre de la enfermedad. Así como, con el índice de validez que le otorga una alta proporción de individuos clasificados correctamente, la razón de verosimilitud refleja que la RV+ es sustancialmente mayor que la RV-, lo que le confiere probabilidad elevada de que el individuo tenga la enfermedad, con una razón de verosimilitud negativa menor de 1 disminuirá la probabilidad de que el individuo tenga la enfermedad en estudio; por lo que según el estudio de Donis H ²¹ la prueba tiene un valor que determina su eficiencia como suficiente basado en que un buen test debe tener una RV- cercana a 0 y una RV+ alta; y el índice de Youden cercano a 1 que hay pocos falsos negativos y positivos.

Los resultados indican que la prueba es repetible y reproducible en un 100% al obtener el mismo resultado en las diferentes pruebas esto se debe a una buena estandarización en las diferentes etapas del desarrollo de la prueba y su optimización.

Los resultados encontrados son similares a los reportados por Marcos et al. ²² quienes encontraron que ELISA Fas2 (catepsina L1) tiene una sensibilidad del 92,4% y especificidad del 83,6%; mientras que Muñoz et al. ²³ analizar las pruebas serológicas para el diagnóstico de la fasciolosis encontró sensibilidades de 91,90%, 94,30%, 96,5%, 99,9%, 96,5% (Ferritina), 91,4%, (TP) 87%, Fas2 ELISA: 96,77%, Arco 2: 47,61% y Western blot: 74,19% y sus especificidades de 97,30%, 80,20%, 97,6%, 99,9%, 95,7%, (Ferritina) 92,4%, (TP) 99%, Fas2 ELISA: 91,22%, Arco 2: 98,24%, Western blot: 88,59%. Solo encontramos un reporte de Martínez et al. ²⁴ que elaboró una prueba rápida por flujo lateral de migración vertical para el diagnóstico de la fasciolosis que realizó una evaluación de 39 sueros positivos y 164 negativos, de los cuales solo un suero positivo no reaccionó y ninguno de los negativos.

Recalcando la importancia de las pruebas LFIA para los programas de control de las enfermedades porque pueden contribuir a tratar a los pacientes con precisión y asegurar que se prevenga la transmisión de esta enfermedad crónica lenta. Fasciorap cumple con las características de la prueba Assured para que pueda utilizarse en todos los niveles del sistema de salud (asequible, sensible, especifico, fácil de usar, robusto, rápido, equipo mínimo o sin equipo y entregable a quien lo necesita) ²⁵. Su aceptación como prueba que otorga resultados confiables se logrará mediante una validación profunda del dispositivo LFIA y un control de calidad meticuloso ^18,26.

Este proyecto tuvo algunas limitaciones, solo se contó con datos demográficos y epidemiológicos de algunas muestras y para evaluar la especificidad solo conto con sueros de pacientes con Hidatidosis para el grupo de sueros positivos a otros trematodos que infectan el hígado. Además, no encontramos en el Perú kits comerciales para hacer las comparaciones y confirmaciones de la enfermedad, es así que tomamos la estandarizadas en el laboratorio.

Se concluye que la prueba rápida Fasciorap puede ser de utilidad para el diagnóstico serológico de la Fasciolosis humana.