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Anales de la Facultad de Medicina

Print version ISSN 1025-5583

An. Fac. med. vol.68 no.3 Lima Sept. 2007

 

Trabajos Originales

 

Angiogénesis pulmonar mediada por adenosina vía CXCL1/CXCR2

Via CXCL1/CXCR2 adenosine-mediated pulmonary angiogenesis

 

Julio E. Valdivia-Silva 1,2, Geraldine K. López-Molina 1, Juan C. González-Altamirano 3

1 Grupo de Investigación en Inmunología, Departamento de Inmunología y Microbiología - Universidad Nacional de San Agustín. Arequipa, Perú.
2 Laboratorio de Quimiocinas, Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México. Distrito Federal, México.
3 Departamento de Cardiología, División de Cirugía Vascular y Toráxico, Hospital Nacional del Sur CASE - EsSalud. Arequipa, Perú.

 


 

Resumen

Introducción: La enfermedad pulmonar inflamatoria crónica tiene como característica común el proceso de angiogénesis patológica. Recientes trabajos han relacionado a la adenosina, una molécula de señalización, y quimioquinas como reguladores de este proceso, aunque la relación y asociación entre estos factores no ha sido muy investigada. Objetivo: Determinar el papel de la adenosina en la angiogénesis sostenida en procesos pulmonares inflamatorios crónicos. Diseño: Experimental. Lugar: Bioterio del Grupo de Investigación en Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de San Agustín, Arequipa, Perú e Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional Autónoma de México. Material biológico: Ratones deficientes en adenosina deaminasa (ADA) de la cepa C57BL/6J. Métodos y procedimientos: Se evaluó la relación entre los niveles de adenosina en pulmón y la angiogénesis traqueal utilizando patrones morfométricos, además de la expresión de la quimioquina CXCL1 y su receptor mediante ensayos de PCR y Elisa. Principales medidas de resultados: Niveles de adenosina en pulmón, angiogénesis traqueal y expresión a CXCL1 y su receptor. Resultados: Se demostró un significativo incremento de angiogénesis relacionado a dosis elevadas de adenosina y una regresión importante del proceso al administrar ADA de reemplazo. Se encontró también niveles de CXCL1 elevados de manera dependiente a la adenosina, en los ratones deficientes. La neutralización in vivo del receptor de CXCL1 (mCXCR2) mostró una marcada inhibición de la acción angiogénica. Conclusión: Nuestros hallazgos sugieren que la adenosina juega un rol importante en la inducción de angiogénesis pulmonar vía CXCL1/CXCR2, en la enfermedad pulmonar crónica.

Palabras clave: Enfermedad pulmonar; inflamación; adenosina; neovascularización patológica.

 



 
Abstract

Introduction: Chronic lung disease's feature is pathological angiogenesis, a still little understood process in this and other diseases. Recently adenosine, a signaling molecule, and chemokines have been considered regulators of this process. Though, relationship between these factors has not been investigated. Objective: To determine the role of adenosine in the induction of angiogenesis during pulmonary chronic inflammation. Design: Experimental. Setting: Bioterio, Immunology Research Group, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de San Agustin, Arequipa, Peru, and Biomedical Research Institute, Universidad Nacional Autonoma de Mexico. Biologic material: C57BL/6J adenosine deaminase (ADA)-deficient mice. Methods and interventions: By morphometric analysis we determined relationship between adenosine levels in lung and tracheal angiogenesis, and expression to CXCL1 and its receptor by PCR and Elisa assays. Main outcome measures: Lung adenosine levels, tracheal angiogenesis, and expression to CXCL1 and its receptor. Results: We demonstrated a significant increase of angiogenesis related to high doses of adenosine and an important inhibition of the process when we administered replacement ADA. In the ADA-deficient mice CXCL1 levels rose depending on adenosine levels. CXCL1 receptor (CXCR2) in vivo neutralization showed dramatic inhibition of angiogenic activity. Conclusions: Adenosine may play an important role, via CXCL1/CXCR2, in the induction of pulmonary angiogenesis in pulmonary chronic disease.

Key words: Pulmonary disease; inflammation; adenosine; neovascularization, pathologic.

 




INTRODUCCIÓN

La enfermedad pulmonar crónica agrupa diversas patologías en las cuales la respuesta inmune lleva a una inflamación crónica, con pérdida progresiva de la función pulmonar, además de remodelación tisular con angiogénesis ( 1 ). Este proceso es ampliamente observado en el asma ( 2,3 ), con un grado de relación directa para la obstrucción, hiperreactividad y persistencia de inflamación. De manera similar, en la fibrosis pulmonar idiopática (IPF) y en el síndrome de bronquiolitis obliterante (BOS) se ha observado un incremento significativo del potencial angiogénico, con alto grado de remodelación vascular ( 4-6 ). Las células endoteliales de lavados bronquioalveolares de pacientes con sarcoidosis pulmonar también mostraron incrementada la capacidad para inducir angiogénesis comparada con la de individuos no afectados ( 7 ). Pero, pese a la constante evidencia, las vías reguladoras de angiogénesis en la enfermedad pulmonar no son bien comprendidas.

Las quimioquinas CXC son una familia de proteínas con actividad quimioatrayente, que contienen en su estructura cuatro cisteínas conservadas en su secuencia de aminoácidos ( 8 ). La presencia de los aminoácidos ELR (Glu, Leu, Arg) en el lado amino-terminal les adiciona capacidad proangiogénica a la molécula ( 8 ). Esta familia de quimioquinas es importante en procesos fisiológicos y patológicos, como hemostasia, isquemia y cáncer ( 9 ); pero, de igual forma, es poco conocida la regulación de su expresión durante estos procesos. Por otro lado, la adenosina es una molécula con funciones proangiogénicas bien conocidas, tanto in vitro como in vivo ( 10 ), y que durante procesos de estrés celular y daño puede acumularse y regular procesos inflamatorios vía receptores constitutivos de adenosina. Es conocido que en el asma, por ejemplo, los niveles de adenosina en lavados bronquiales se relacionan con severidad de la enfermedad ( 2,3 ). Estos resultados sugieren que la adenosina puede estar involucrada en la patogenia de enfermedades pulmonares crónicas, involucrando a la angiogénesis.

Para evaluar los efectos de niveles de adenosina in vivo, en este trabajo usamos ratones deficientes de la enzima adenosina deaminasa (ADA) ( 11 ), la cual normalmente cataliza a este nucleósido, para poder determinar el efecto que existe entre la acumulación de la adenosina y el proceso angiogénico. Ya es conocido que niveles altos de ADA en estos ratones se asocia a inflamación pulmonar crónica y remodelación de la vía aérea ( 12 ), pero poco se sabe acerca de la angiogénesis y los factores que median el proceso. Adicionalmente, buscamos determinar si la quimioquina CXCL1 y su receptor constitutivo CXCR2 mediaban o no el efecto de la adenosina sobre la neoformación vascular traqueal. Esta relación fue pensada debido a que la quimioquina análoga a CXCL1 en humanos (CXCL8) se encuentra elevada en procesos inflamatorios crónicos, como el asma ( 13 ), y es un importante mediador de angiogénesis.

MÉTODOS

El genotipo de los ratones deficientes para ADA se encuentra descrito anteriormente por Blackburn y col. ( 11 ). Cuarenta ratones deficientes de adenosina (ADA-/-) y 40 controles (ADA+) pertenecieron a la cepa C57BL/6J, producida en el Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional Autónoma de México y fue mantenida en el Bioterio del Grupo de Investigación en Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de San Agustín, Arequipa, Perú, durante todo el proceso de experimentación. El cuidado de los animales fue de acuerdo a los protocolos internacionales, con estricto control de contaminación.

A los ratones deficientes ADA-/- y controles ADA+ (n=5 para cada grupo), previamente anestesiados se les realizó 5 lavados pulmonares, con 250 microlitros de buffer salino fosfato (PBS), pH 7,2, para recuperar cerca de 1 mL de lavado. Para el conteo diferencial de las células, se tomó alícuotas equivalentes de lavado bronquial y se las concentró mediante citospín en láminas portaobjetos (1000 rpm por 5 min), marcadas con Diff-Quick (Baxter Dade Diagnostics AG) y observadas al microscopio. La técnica original para el lavado bronquioalveolar fue descrita por Kayes y colaboradores ( 14 ).

Para la inmunohistoquímica de los vasos sanguíneos, los ratones fueron sacrificados en cámaras de CO2 cerradas. Se extrajo cuidadosamente la tráquea del animal junto con sus pulmones, removiendo el tejido adyacente. Las tráqueas fueron fijadas con solución de zinc (BD Pharmingen) por 24 horas y lavadas 3 veces en PBS 1X pH 7,2 (3 minutos por lavado). Se permeabilizó los tejidos con PBS 1X más Tritón X-100 al 0,1%, durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Se procedió a incubar los tejidos en peróxido de hidrógeno al 1%, durante 20 minutos, a temperatura ambiente, para bloquear peroxidasas endógenas. Posteriormente, se marcó los vasos utilizando la técnica descrita por Thurston y col., mediante la cual se perfunde lentamente la vasculatura con lectina de L. esculentum biotinilada (Vector Laboratories, CTR Scientific) y se logra la reacción con la peroxidasa del complejo avidina-biotina /diaminobenzidina (ABC/DAB) ( 15 ). Las tráqueas para evaluación morfométrica fueron deshidratadas y montadas con Permount (Fisher Chemical) ( 16 ).

La medición morfométrica de los vasos fue hecha en todas las tráqueas montadas y marcadas. Las imágenes fueron tomadas usando el objetivo 40x de un microscopio Olympus equipado con una cámara digital Roper Scientific. La cuenta de vasos fue determinada por uso de software Image-Pro imaging (MediaCybernetics). El número de vasos transversales a un anillo de cartílago fue tomado como índice representativo del número total de vasos en esa tráquea ( 16 ). El índice fue determinado colocando una línea de tamaño conocido paralela al eje longitudinal del anillo cartilaginoso y se contó el número de vasos que intersecaban la línea. Al menos 15 anillos de múltiples ratones por grupo fueron examinados. Los datos fueron expresados como el número de vasos por unidad de longitud dada por la línea dibujada.

Con relación al PCR en tiempo real, el ARN total fue aislado del tejido pulmonar de los ratones deficientes de adenosina y los controles sometidos o no a las terapias enzimática de reemplazo y con el anticuerpo anti-mCXCR2 descritas más adelante (n=5 ratones para cada grupo, N=40 ratones). Se utilizó un kit comercial de Trizol (Invitrogen Corp.). El ARN fue tratado con ADNasa libre de ARNasa y convertido a cADN, según instrucciones del fabricante (Invitrogen Corp.). El cADN pulmonar purificado fue llevado a reacción de PCR en tiempo real. Los trancriptos fueron cuantificados usando sondas Taqman en un ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) y analizados por su propio software. Los primers y sondas fueron diseñados utilizando el software Primer Express v2,0, de Applied Biosystems, y fueron las siguientes: para CXCL1 (5’-CTGCACCCAAACCGAAGTC-3’, antisentido 5’- AGCTTCAGGGTCAAGGCAAG-3’, sonda 5’- CACTCAAGAATGGTCGCGAGGC -3’). Para ß-actina (5’-GCTCTGGC TCCTAGCACCAT -3’, antisentido 5’- CCACCGATCCACACAGAGTAC -3’, sonda ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-3’). CXCR2 (5’-GACTGTTCACCTA AACGGTG -3’, antisentido 5’- CATACCAAGATGGAAGGGAGC -3’).

Para el dosaje de proteínas, se obtuvo un lisado de todas las proteínas del tejido pulmonar de 40 ratones, divididos en los grupos descritos en el párrafo anterior, y se determinó su concentración utilizando el kit Bio-Rad Protein Assay y bajo instrucciones de la hoja técnica (Bio-Rad Laboratories).

Con relación a la prueba de Elisa para CXCL1, iguales cantidades de proteína fueron colocadas en un ensayo de Elisa tipo sándwich, específico para CXCL1 (R&D Systems). Los datos fueron expresados como cantidad de proteína CXCL1 sobre proteína total en miligramos. El contenido de CXCL1 en los lavados bronquioalveolares fue determinado por placas de Elisa. Se expresó los datos como total de la proteína CXCL1 recuperada en el lavado. Los pasos del procedimiento se encuentran en la hoja técnica del kit comercial para pruebas de Elisa.

Cinco ratones deficientes de adenosina (ADA-/-) y cinco controles (ADA+) recibieron 5 U de la enzima ADA modificada con polietilen glicol (PEG-ADA), descrita previamente ( 17 ), por vía intraperitoneal, en el día 18 de vida posnatal y dos veces más a los 4 y 8 días de la primera inyección. Tres días después (al décimo del inicio de la terapia), los ratones fueron sacrificados, para evaluar los efectos en la angiogénesis traqueal.

El anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón anti-CXCR2 (mCXCR2) fue producido por nuestro laboratorio mediante la inmunización de una cabra con un péptido que contenía la secuencia Met-Gly-Glu-Phe-Lys-Val-Asp-Lys-Phe-Asn-Ile-Glu-Asp-Phe-Phe-Ser-Gly de CXCR2 sintetizada por el Laboratorio de Secuenciación y Síntesis del Instituto de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México. Para evaluar títulos séricos del anticuerpo, se usó Elisa directo contra el anti-CXCR2 murino y se probó la presencia de la proteína en el suero con Western blot y ensayos de neutralización frente al receptor blanco (datos no mostrados). Esta forma de obtención del anti-CXCR2 ya ha sido usada anteriormente para bloquear in vivo el mCXCR2, y para aislamiento de neutrófilos mediante sorting ( 18-20 ). La administración intraperitoneal de este anticuerpo no alteró la cuenta total de neutrófilos en sangre periférica ( 21 ). Para el experimento, se administró 1 mL de antisuero anti-mCXCR2 o 1 mL de PBS con 10 mg de IgG, para control.

Para la cuantificación de adenosina, los pulmones rápidamente removidos fueron congelados en nitrógeno líquido. Los nucleósidos de adenina fueron extraídos del pulmón usando ácido perclórico al 0,4 N (PCA) y la adenosina fue cuantificada utilizando cromatografía de líquidos en fase reversa (HP Agilent HPLC-1050) ( 22 ). Los niveles de adenosina fueron normalizados a contenido de proteínas y expresados en nmol/mg de proteína.

RESULTADOS

El incremento de la vascularidad es una característica de la enfermedad pulmonar crónica (1,4-6). Para determinar si el fenotipo pulmonar inducido por adenosina observado en ratones ADA–/– resulta también en angiogénesis, se realizó inmunohistoquímica de los vasos sanguíneos traqueales (Figura 1). La vasculatura de la tráquea de los ratones a los 18 días posnatales fueron extraídas, fijadas y marcadas, para evaluar el proceso angiogénico. La vasculatura fue cuantificada de acuerdo a lo explicado en la metodología. Los ratones deficientes de ADA (ADA–/–) mostraron un número aumentado de vasos, además de un mayor infiltrado celular y engrosamiento de vasos, comparados a los ratones controles (ADA+) (Figura 1 A, B). Para determinar si el incremento en la vasculatura dependía de la adenosina, los ratones fueron tratados con la enzima PEG-ADA, en el periodo en que la angiogénesis se encontraba establecida. Se inició las inyecciones de la enzima en el día 18 posnatal y posteriormente fueron dadas cada 4 días en dos oportunidades. El análisis de la vasculatura traqueal postratamiento (evaluadas 72 horas después de la última inyección) reveló que el tratamiento con la enzima fue capaz de revertir la angiogénesis previamente establecida (Figura 1 A, B). Específicamente, los ratones ADA–/– que recibieron PEG-ADA mostraron un número de vasos similares a los ratones ADA+, indicando que los niveles de adenosina directamente correlacionan con el grado de vascularidad (Figura 1 B). Para verificar que la vascularidad había decrecido con los niveles de adenosina, los niveles de nucleósidos de adenina fueron extraídos y cuantificados de los pulmones de los ratones tratados, como se describió en la metodología. Los resultados demostraron que el tratamiento con PEG-ADA se asoció con una reducción significativa de adenosina en los pulmones (Figura 1 C).

 

 

Para evaluar los probables factores asociados a la angiogénesis en los ratones deficientes de ADA, se examinó la expresión de la quimioquina proangiogénica CXCL1. Se realizó PCR en tiempo real para el ARN total de los pulmones de los ratones ADA+ y ADA–/–, en el día 18 posnatal (Figura 2). Los extractos de ARN de los pulmones mostraron incremento del mensajero en ratones ADA–/–, con respecto a los controles ADA+. La terapia de reemplazo con PEG-ADA dio como resultado reversibilidad en los niveles del ARN de CXCL1 de los ratones tratados (Figura 2 A). El nivel total de la proteína para CXCL1 fue obtenido mediante un Elisa específico para CXCL1, que reveló un incremento de la proteína en ratones ADA–/–, el que fue reversible con el tratamiento enzimático de reemplazo (Figura 2 B). Adicionalmente, la proteína CXCL1 en los lavados bronquioalveolares de ratones ADA–/– mostró el mismo comportamiento (no mostrado).

 

 

Con relación al CXCL1 en macrófagos alveolares de ratones ADA–/–, los lavados alveolares de ratones ADA+ y ADA–/– del día 18 posnatal fueron utilizados para hacer cuenta diferencial de células. El análisis reveló un número incrementado de macrófagos alveolares en la vía aérea de los ratones ADA–/– frente a los controles (Figura 3 A). Para determinar si estas células eran la fuente de CXCL1, se realizó PCR en tiempo real para los pellet de los lavados bronquioalveolares. Los resultados mostraron que CXCL1 solo estaba presente en los pellet de los lavados de ratones ADA–/–. También se observó disminución de los niveles del transcripto, al utilizar la enzima de reemplazo (Figura 3 B).

 

 

Para determinar el estatus de CXCR2 en los pulmones de ratones ADA–/–, el ARN pulmonar fue analizado para CXCR2, utilizando PCR tiempo real. Se demuestra que el receptor CXCR2 está incrementado en los pulmones de los ratones deficientes, al día 18 posnatal. (Figura 4 A). De manera similar a lo encontrado anteriormente, los niveles del receptor también disminuyeron con el tratamiento de PEG-ADA, indicando un rol de la adenosina en la transcripción del receptor.

Para determinar la contribución de la señalización de CXCL1 vía CXCR2 en la angiogénesis pulmonar en ratones ADA–/–, se les administró por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-CXCR2 murino el día 18 posnatal (Figura 4 B). La inhibición del receptor CXCR2 resultó en la regresión de la actividad angiogénica a valores similares que la encontrada con el tratamiento de reemplazo enzimático. Estos resultados indican que la señalización a través del receptor CXCR2 es responsable de la actividad angiogénica incrementada en ratones ADA–/–.

 

 

DISCUSIÓN

La adenosina es una molécula de señalización que se acumula durante los procesos de inflamación y daño celular. Se ha encontrado niveles incrementados de esta molécula en los pacientes asmáticos ( 12 ), indicando un posible rol en la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, la consecuencia funcional y su impacto en la inflamación pulmonar no es comprendida completamente. Los niveles elevados de adenosina en lavados bronquioalveolares, sangre y muestras de moco han sido encontrados en varias patologías pulmonares crónicas, como asma ( 4,5,23 ), fibrosis pulmonar ( 24 ), enfermedad obstructiva pulmonar crónica ( 6,12 ), y en suero de pacientes con enfermedades inflamatorias, como artritis reumatoide, sepsis y daño por isquemia-reperfusión ( 25-27 ). El proceso inflamatorio causa un incremento en la demanda energética con catabolismo de ATP y subsecuente elevación de adenosina, la cual se une a receptores de superficie celular acoplados a proteínas G (A1R, A2AR, A2BR, y A3R) para regular el proceso inflamatorio y restaurar el balance de oxígeno. Es clave para este balance la formación de nuevos vasos a partir de una red preexistente (angiogénesis). Este proceso, si bien es fisiológico, en procesos inflamatorios crónicos ha demostrado ser perjudicial en el progreso patológico, incluyendo la enfermedad pulmonar crónica. Aunque la evidencia de angiogénesis en la enfermedad pulmonar crónica está demostrada, los mecanismos moleculares por los cuales se inicia y progresa el proceso no están muy bien comprendidos. Un candidato capaz de inducir angiogénesis es la adenosina. Numerosos estudios ya han demostrado que la elevación crónica in vivo de adenosina lleva a procesos angiogénicos ( 10,28,29 ) y son coherentes en su rol para restaurar la homeóstasis de oxígeno durante el daño. Las consecuencias de elevadas concentraciones de adenosina en la vasculatura pulmonar no han sido evaluadas anteriormente, de manera que nosotros, usando ratones deficientes en adenosina deaminasa (ADA), hemos pretendido evaluar dicha relación. El ratón ADA–/–, en asociación con niveles elevados de adenosina, desarrolla enfermedad pulmonar con características similares al asma, como inflamación crónica, hiperreactividad de la vía aérea, hipersecreción de moco y fibrosis subepitelial ( 12,24 ). Thurston y col. utilizaron la cuantificación del número de vasos transversales a un anillo cartilaginoso como un índice representativo del número total de vasos traqueales ( 16 ). Nosotros utilizamos este índice para demostrar el incremento del número de vasos dependiente de adenosina. Aunque nuestros resultados no miden directamente la angiogénesis pulmonar, ésta se correlaciona a la traqueal ( 30 ). Estudios previos con adenosina buscaron relacionar su efecto angiogénico con la inducción del factor de crecimiento de endotelio- vascular (VEGF) ( 31 ). Pero, es también conocido que el desarrollo de nuevos vasos es un proceso multifactorial y que ha involucrado a muchas otras moléculas, como las quimioquinas ( 8 ). Las quimioquinas CXC son citoquinas quimioatrayentes involucradas en diversos procesos fisiológicos de tráfico celular, además de otros muchos patológicos. La presencia o ausencia en la secuencia del dominio (Glu-Leu-Arg) ELR confiere a estas moléculas la capacidad proangiogénica o antiangiogénica, respectivamente ( 8 ). Un claro ejemplo de su importancia es la inducción de angiogénesis en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, donde el VEGF no cumple un rol, a diferencia de la señalización por quimioquinas CXC ( 8 ). CXCL8/IL-8 es un miembro de las quimioquinas ELR, que ha sido implicada en el asma ( 32 ). Feoktistov y col. demostraron que el estímulo sobre el receptor de adenosina llevaba a liberación de CXCL8 en mastocitos humanos ( 13 ). CXCL1 es la quimioquina funcional homóloga a IL-8, la cual es perdida en el ratón por una deleción ancestral ( 33 ). Nuestros resultados muestran niveles elevados de ARN - proteína de CXCL1 en los pulmones y lavados broncoalveolares de ratones ADA–/–; lo que significa que no solo es producida sino secretada a la vía aérea. La fuente de esta quimioquina parece ser el macrófago alveolar, que curiosamente se encuentra en mayor número en los ratones deficientes de ADA y se relaciona a los valores de CXCL1. La función del macrófago es muy importante en la historia natural de muchas enfermedades inflamatorias ( 34 ), de manera que nuestros resultados indican que en presencia de adenosina el macrófago alveolar es activado y representa, por tanto, un potencial blanco terapéutico en estas enfermedades. Sin embargo, no se conoce los mecanismos de regulación de la adenosina en la expresión de CXCL1 por los macrófagos. Se ha visto que el receptor de baja afinidad A2BR -activado solo en altas concentraciones de adenosina- se encuentra elevado en macrófagos activados ( 35 ), es responsable para la expresión de CXCL8 en mastocitos humanos ( 13 ) y estimula la expresión de factores angiogénicos en células endoteliales. Además, los niveles del receptor A2BR se encontraron elevados en pulmones de ratones ADA–/– ( 36 ) con marcada disminución de la expresión de CXCL1, posterior a la neutralización del receptor ( 37 ). Estos encuentros implican que el receptor A2BR es regulador de la expresión de CXCL1 en pulmones de ratones ADA–/–.

En este trabajo, nosotros mostramos que, en asociación a niveles elevados de adenosina y CXCL1, los ratones ADA–/– desarrollan angiogénesis pulmonar. De manera interesante, los niveles del receptor CXCR2, el receptor constitutivo de CXCL1 ( 38 ), también se encuentran elevados en estos ratones. El incremento del receptor CXCR2 puede ser debido a un incremento en la cantidad de células inflamatorias o a mayor receptor en las células residentes pulmonares, lo cual es aceptado debido a la hipoxia que ocurre durante los procesos de inflamación crónica ( 39 ). Nuestros datos demuestran que la terapia de reemplazo con PEG-ADA puede reducir la expresión de CXCR2, sugiriendo que la hipoxia media este efecto, puesto que el número de células inflamatorias pulmonares no está alterado después del tratamiento ( 12 ).

Para demostrar que la disminución de los niveles de adenosina in vivo cambiaría el estatus de CXCL1 y la angiogénesis, se inició terapia enzimática de reemplazo con PEG-ADA, iniciando el día en que ya se observaba un proceso bien establecido (18 días posnatales). Luego de 10 días de tratamiento (2 inyecciones dadas cada 4 días y analizadas 72 horas después de la última inyección), las medidas de los valores de CXCL1 demostraron una disminución significativa de ARN y proteína. De la misma manera, se observó completa regresión de la angiogénesis evidenciada por el número de vasos en tráquea. Por otro lado, la inhibición del receptor CXCR2 in vivo demostró de manera similar una regresión en la vasculatura traqueal, de manera muy similar al tratamiento de reemplazo con PEG-ADA, lo que indica que la actividad angiogénica de adenosina en pulmones de ratones ADA–/– es mediada por CXCL1, vía su receptor CXCR2. Aunque existe la posibilidad de la existencia de otros ligandos para este receptor, la asociación directa con adenosina sugiere fuertemente que es CXCL1 la molécula de interés. Experimentos in vivo que bloqueen CXCL1 podrán confirmar nuestros resultados en el futuro. Es importante indicar que durante la elaboración de este trabajo Mohsenin y col., comunicaron hallazgos similares a los encontrados por nosotros con respecto a la adenosina como inductor de angiogénesis en la enfermedad pulmonar crónica. Pero, a diferencia del modelo utilizado por ellos -que demuestran inhibición de angiogénesis en microensayos sobre córneas-, nosotros demostramos cambios en el modelo animal in vivo y no requerimos en momento alguno ensayos alternos para evaluar el proceso angiogénico ( 40 ).

En resumen, nosotros demostramos que los ratones deficientes en ADA presentan angiogénesis pulmonar patológica asociada a los niveles altos de adenosina. Nuestros resultados muestran que los ratones ADA–/– tienen valores elevados de ARN y proteína de la quimioquina proangiogénica CXCL1 y de su receptor CXCR2. De manera que, la alta actividad angiogénica en pulmones de estos ratones es directamente atribuible a la señalización de CXCL1 a través de CXCR2. De acuerdo a los hallazgos en este modelo in vivo, podríamos atrevernos a plantear la hipótesis que los niveles elevados de adenosina y quimioquinas CXC ELR+ encontradas en pacientes con enfermedad pulmonar inflamatoria crónica podrían ser las moléculas responsables para la angiogénesis sostenida en estas patologías, además de constituir un potencial blanco terapéutico en el futuro.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue subvencionado económicamente por el Grupo de Investigación en Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de San Agustín, Arequipa, Perú, partida IRG2006-BV001B, y por el Laboratorio de Quimiocinas del Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, apoyo JVS0BV12006. Agradecemos al Dr. Eduardo García Zepeda por su apoyo incondicional en la revisión de este manuscrito.

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Manuscrito recibido el 11 de setiembre de 2007 y aceptado para publicación el 26 de setiembre de 2007.

Correspondencia:
Dr. Julio Ernesto Valdivia-Silva
Laboratorio de Quimiocinas, Departamento de Inmunología,
Instituto de Investigaciones Biomédicas sede Circuito Escolar,
Ciudad Universitaria s/n, Universidad Nacional Autónoma
de México, CP 04510, México D. F.
Correo-e: jvsilva@nucleares.unam.mx

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