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Anales de la Facultad de Medicina

versão impressa ISSN 1025-5583

An. Fac. med. v.68 n.4 Lima dez. 2007

 

TRABAJOS ORIGINALES

 

Efecto del glicerol sobre la catálisis por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (Lama pacos)

Effect of glycerol on catalysis by low molecular weight acid phosphatase from alpaca liver (Lama pacos)

 

Emilio Guija 1, Fernando Arauco 2, Hielke Haak-Mares †, Mercedes Soberón 1

1 Profesor Emérito del Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición. Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
2 Unidad de Post Grado. Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
† El presente artículo se publica como un homenaje póstumo al Dr. Hielke Haak Mares, Profesor Principal de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.

 


 

Resumen

Objetivo: Determinar el efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato a pH 5,0 por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca. Diseño: Estudio analítico experimental. Lugar: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Materiales: Se utilizó los reactivos químicos p-nitrofenil fosfato sal disódica, ácido acético glacial, glicerol, ácido tricloroacético, ácido sulfúrico, molibdato de amonio, ácido ascórbico, sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-120), sulfoetil sephadex C-50 y etilendiaminotetraacético (EDTA). Métodos: Se determinó los parámetros cinéticos Km y Vmax utilizando como sustrato el p-nitrofenil fosfato, en presencia de concentraciones variables de glicerol. Así mismo, se determinó la velocidad de liberación de los productos de la reacción en función de la concentración de dicho nucleófilo. Principales medidas de resultados: Efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato. Resultados: El glicerol en concentraciones comprendidas entre 1,16 y 3,49 M incrementó linealmente la liberación del p-nitrofenol; en cambio, la formación del fosfato inorgánico -el segundo producto liberado- no se modificó. Así mismo, los valores de Km y Vmax se incrementaron linealmente dependientes de las concentraciones de glicerol, en un rango comprendido entre 0,58 y 2,32 M. Conclusiones: Un análisis de las modificaciones que ejerce el glicerol sobre los valores de Km y Vmax y la velocidad de liberación de los productos de la reacción permite sugerir un modelo en el que la fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca cataliza la hidrólisis de fosfomonoésteres a través de un mecanismo uni biordenado, con la formación de un complejo enzima-fosfato, que sería escindido por agua o un nucleófilo, como el glicerol; en este modelo a k2 le corresponde un valor mucho mayor que k3 y k4 N.

Palabras clave: Fosfatasa ácida; catálisis; glicerol; cinética.

 


 

Abstract

Objective: To determine the effect of glycerol on hydrolisis of p-nitrophenyl phosphate at pH 5,0 by low molecular weight acid phosphatase from alpaca liver. Design: Experimental analytical study. Setting: Biochemistry and Nutrition Research Center, Faculty of Medicine, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru. Materials: Disodic p-nitrophenyl phosphate salt, glacial acetic acid, glycerol, tricloroacetic acid, sulfuric acid, ammonium molibdate, ascorbic acid, ammonium sulphate, sephadex G-75 (45-120), sulpho ethyl sephadex C-50 and ethylene diaminotetraacetic (EDTA) chemical reactives. Methods: Both Km and Vmax kinetic parameters were determined with p-nitrophenyl phosphate as substrate in presence of different concentrations of glycerol. The rate of formation of products was determined as a function of the concentration of such nucleophile. Main outcome measures: Glycerol effect on p-nitrophenyl phosphate hydrolysis. Results: Glycerol linearly increased p-nitrophenol release at concentrations between 1,16 and 3,49M. Instead, inorganic phosphate formation, the second product, was not modified. Also, Km and Vmax values increased linearly between 0,58 and 2,32 M depending on glycerol concentrations. Conclusions: Analysis of modifications induced by glycerol on Km and Vmax values as well as on liberation velocity of the reaction products suggests a model in which low molecular weight acid phosphatase isolated from alpaca liver catalyses phosphomonoesters hydrolysis through an uni biordered mechanism, with formation of an enzyme-phosphate complex that will be splitted by water or a nucleophile such a glycerol; in this model, k2 corresponds to a much higher value than k3 or k4 N.

Key words: Acid phosphatase; catalysis; glycerol; kinetics.

 


 

INTRODUCCIÓN

La fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2) es una enzima de amplia distribución en la naturaleza. Se ha descrito su purificación a partir de diversas fuentes: hígado ( 1 ), próstata ( 2 ), cerebro ( 3 ), germen de trigo ( 4 ), papa ( 5 ), cerdo ( 6 ), etc. Existen fosfatasas ácidas de diverso peso molecular, caracterizándose las de bajo peso molecular por no requerir de cofactor para ejercer su acción catalítica, hecho que permite simplificar considerablemente la interpretación de los resultados experimentales ( 7 ).

Un aumento en los niveles de fosfatasa ácida sérica está relacionado con carcinoma de próstata, infarto prostático, traumatismo prostático, hipertrofia benigna de próstata, prostatitis, destrucción excesiva de plaquetas (púrpura trombocitopénica idiopática, con megacariocitos en médula ósea), crisis hemolíticas, tromboembolismo, carcinoma metastático del hueso, enfermedad de Paget ósea avanzada, hepatitis, ictericia obstructiva, cirrosis hepática, hiperparatiroidismo, alteración renal aguda, entre otros. La fosfatasa ácida prostática (PAP) es un subtipo de la fosfatasa ácida sérica o total. Existen cuatro formas de isoenzimas de fosfatasa ácida a nivel estructural de genes ( 8,9 ). Las formas eritrocíticas y lisosomales están expresadas en la mayoría de las células, mientras que, la prostática y la forma macrofágica tienen una expresión limitada. La forma prostática (PAP) es específica para neoplasias de la glándula prostática, siendo el principal marcador bioquímico del cáncer de próstata hasta la aparición del antígeno prostático específico (PSA) ( 10,11 ).

Esta enzima cataliza la hidrólisis de los fosfomonoésteres, como el p-nitrofenilfosfato, a través de un proceso cinético uni-biordenado, caracterizado por liberarse en primer lugar el p-nitrofenol y ulteriormente lo haría el fosfato inorgánico ( 12 ). En esta secuencia de reacción se formaría un complejo intermedio covalente enzima-fosfato, el que probablemente sería tasa limitante de la reacción total del proceso catalítico ( 12 ). Se ha observado en fosfatasas ácidas de otras fuentes que el fosfato se ligaría a un residuo de histidina ( 4 ), aunque no se descarta la posibilidad que dicha interacción podría realizarse con la participación de otros residuos de aminoácidos ( 13 ).

La utilización de otros nucleófilos más eficientes que el agua ha sido usada con la finalidad de describir de una manera más precisa el mecanismo de acción de diversas hidrolasas. El presente trabajo muestra el efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato a pH 5,0 por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca.

MÉTODOS

Se realizó un estudio de tipo analítico experimental, utilizándose los siguientes reactivos químicos: p-nitrofenil fosfato sal disódica, ácido acético glacial, glicerol, ácido tricloroacético, ácido sulfúrico, molibdato de amonio, ácido ascórbico, sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-120), sulfoetil sephadex C-50 y etilendiaminotetraacético (EDTA).

La purificación de la enzima se realizó conforme se ha descrito previamente, con algunas modificaciones realizadas por el Dr. Hielke Haak ( 14 ). La actividad de la fosfatasa ácida se determinó en un medio de ensayo que estuvo constituido en un volumen final de 2,0 mL por tampón acetato 0,05 M pH 5,0, EDTA 1 x 10-4 M, 2 µmoles de p-nitrofenil fosfato y enzima. Después de una incubación de 2 minutos a 37° C, la reacción se detuvo mediante la adición de 1 mL de NaOH 1 N. El p-nitrofenolato liberado se midió a 400 nm en un espectrofotómetro Gilford modelo 240, habiéndose utilizado el blanco respectivo que no contenía enzima. Para realizar los cálculos se utilizó un coeficiente de extinción molar de 1,8 x 104 M-1cm-1. La liberación del p-nitrofenol bajo estas condiciones no excedió el 3% del sustrato utilizado ( 15 ).

Para la determinación del fosfato inorgánico liberado durante la catálisis por fosfatasa ácida, se utilizó el medio anteriormente descrito, pero la reacción se detuvo a los 2 minutos por adición de 1 mL de ácido tricloroacético al 10%. Luego, se tomó una alícuota de 1 mL, se le añadió 3 mL de agua destilada y 4 mL del reactivo de color; se incubó a 37° C durante 90 minutos, a cuyo término se leyó la absorbancia a 820 nm. Para cada determinación se preparó el blanco respectivo que no contenía enzima. Con el propósito de realizar los cálculos, se preparó una curva patrón, utilizando fosfato inorgánico en un rango comprendido entre 0,5 y 8,0 µg ( 16 ).

Para las determinaciones de los valores de Km y Vmax se utilizó como sustrato el p-nitrofenilfosfato, en concentraciones comprendidas entre 5,0 x 10-5 M y 1,0 x 10-3 M. Se realizó los cálculos de los parámetros antes mencionados usando el método de Lineweaver y Burk ( 17 ), para cuya finalidad se graficó en doble recíproca las inversas de las velocidades de reacción en función de las inversas de las concentraciones de sustrato.

RESULTADOS

La fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca hidrolizó el p-nitrofenil fosfato a pH 5,0 y 37° C, liberando en el curso de la reacción los productos p-nitrofenol y fosfato inorgánico, en una relación molar de 1:1, durante un periodo de seis minutos, conforme se muestra en el Figura 1. La adición de glicerol a una concentración 1,16 M incrementó considerablemente la velocidad de reacción, en aproximadamente el doble de aquella observada en ausencia del nucleófilo, lo que al mismo tiempo modificó la relación estequiométrica del p-nitrofenol con respecto al fosfato inorgánico liberado, cuyo valor en el curso de la reacción fue de 1,67, resultado que se observa en la Figura 2.

En la Figura 3 se aprecia las modificaciones de la velocidad de formación del p-nitrofenol y del fosfato inorgánico en función de las concentraciones de glicerol; en dicho gráfico se observa que la velocidad de liberación del p-nitrofenol varía linealmente a medida que se incrementa la concentración de glicerol. En cambio, la liberación del fosfato inorgánico no se modifica. Estos resultados sugieren que la formación del glicerol-fosfato durante el proceso de catálisis se liberaría linealmente dependiente de la concentración del glicerol adicionado al medio de ensayo.

 

 

 

 

 

 

El efecto del glicerol sobre los parámetros cinéticos de Km y Vmax se realizó utilizando tres concentraciones diferentes de glicerol, en un rango comprendido entre 0,58 M y 2,32 M. En la Figura 4 puede observarse que el valor Km varía linealmente en función de las concentraciones de glicerol utilizadas. Un efecto similar se observa con el incremento de la velocidad máxima, conforme se muestra en la Figura 5.

 

 

 

 


DISCUSIÓN

Se ha mostrado que la fosfatasa ácida prostática (PAP) puede ser un marcador muy útil en el tamizaje y evaluación de la enfermedad activa y respuesta al tratamiento del linfoma intravascular de las células B, que muchas veces es tratado como fiebre de origen desconocido ( 11,18 ).

Las fosfatasas ácidas son enzimas que tienen la propiedad de hidrolizar ésteres monofosfóricos, a un pH de 5,0, liberando como productos de la reacción un alcohol, cuya naturaleza depende del sustrato utilizado, y fosfato inorgánico ( 7,19,20 ). Se ha sugerido que la enzima hidrolizaría los sustratos a través de un proceso de catálisis covalente, con la probable formación de un complejo intermedio enzima-fosfato, el que posteriormente se hidrolizaría liberando el fosfato inorgánico ( 12 ). Este proceso mecanístico podría comprender la formación de otros complejos que se formarían en una etapa previa a la liberación del fosfato inorgánico, por cuyo motivo, el uso de reactivos nucleófilos más eficaces que el agua brindaría nuevas posibilidades mecanísticas a considerar, para explicar de una manera más apropiada el proceso de catálisis. Diversos autores han sugerido el modelo uni biordenado, utilizando la nomenclatura propuesta por Cleland ( 21 ), para explicar la catálisis por fosfatasa ácida de hígado de bovino ( 12 ), hígado de cerdo ( 22 ) y cerebro de bovino ( 23 ).

La utilización de nucleófilos en reacciones de esta naturaleza permite desarrollar ecuaciones de velocidad para una gran diversidad de modelos mecanísticos. Nuestros resultados podrían explicarse de una manera más apropiada si asumimos que el complejo enzima-fosfato reacciona con el glicerol, previa suposición de que k2 es apreciablemente mayor que k3 y k4 [N], lo que podría ajustarse al siguiente modelo de la Figura 6.

 

 

En este modelo se considera que el complejo EQ reaccionaría con el agua o con el glicerol y que el valor de k2 sería mayor que k3 [H2O] º k4 [glicerol], de tal manera que la liberación de p-nitrofenol estaría definido por: kG = k3 [H2O] + k4 [licerol].

Conforme se aprecia en la Figura 3, de manera análoga, la liberación de fosfato inorgánico no se modificaría al variar la concentración de glicerol, comportamiento que se ajustaría a la ecuación: kpi = k3 [H2O] , es decir: kpi = k′3. Asimismo, la velocidad de liberación del glicerol-fosfato obedece a la ecuación kG-P = k4 [N], tal como se observa en la Figura 3. Para el modelo propuesto, la constante de Michaelis-Menten correspondería a:

            k-1 + k2         k3 + k4 [N]
Km =   ----------- x --------------
                k1                k2

La liberación lineal del p-nitrofenol en función de la concentración de glicerol sugiere un modelo en el que k2 tendría un valor mayor que k3 y k4 [N] o que los productos fosfato inorgánico, p-nitrofenol y el nucleófilo fosforilado se liberarían a una velocidad mayor o similar a k-1. Pero, este mecanismo podría descartarse si se tiene en consideración que las fosfatasas ácidas catalizan las reacciones a través de un proceso uni-biordenado ( 12,22,23 ). Así mismo, un mecanismo en el que k2 < k3 o k2 < k4 [N] tendría que descartarse, ya que en este tipo de mecanismo la liberación del p-nitrofenol sería independiente de la concentración de glicerol.

El comportamiento de tipo hiperbólico mostrado por la fosfatasa ácida de hígado de bovino para liberar el p-nitrofenol en presencia de diferentes concentraciones de glicerol se explicaría admitiendo que los valores de k2, k3 y k4 [N] fuesen similares ( 24 ), por cuyo motivo, dicho modelo no podría explicar los resultados que hemos obtenido en el presente trabajo, los que se ciñen más apropiadamente a un modelo, donde el valor de k2 es mayor que k3 y k4 [N].

Se ha sugerido para la hidrólisis de p-nitrofenil ésteres lipídicos por la lipasa lipoproteica, un mecanismo similar al que proponemos en el presente trabajo; en el mencionado proceso se utiliza como nucleófilo a la hidroxilamina, compuesto que incrementa los valores de Km y Vmax, sugiriéndose que el nucleófilo proporcionaría una ruta alterna para la descomposición del intermediario acil-lipasa lipoproteica, el cual constituye la etapa limitante en dicha secuencia catalítica ( 25 ). El incremento lineal de Km y Vmax en función de la concentración de glicerol, que hemos observado con la fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca, se explica mejor con el modelo cinético que se propone en el presente trabajo.

Asimismo, el incremento de la concentración de glicerol en el medio de reacción no produjo aumento alguno de la liberación de fosfato inorgánico, resultado que se explica de acuerdo al modelo que hemos propuesto, el que predice que la liberación de fosfato inorgánico es independiente de la concentración de glicerol. Este resultado difiere de aquellos obtenidos con la fosfatasa ácida de hígado de bovino ( 24 ), en el que la liberación de fosfato inorgánico disminuye a medida que se incrementa la concentración de glicerol, resultado que se corrobora mediante la regraficación en recíproca simple de la liberación de fosfato inorgánico en función de la concentración de glicerol. Análogamente, la liberación del nucleófilo fosforilado en la reacción catalizada por fosfatasa ácida de hígado de bovino es compatible con un mecanismo en el que k2 tiene valores similares a k3 y k4 [N]. En cambio, los resultados del presente trabajo se ajustan más adecuadamente a la liberación de glicerol-fosfato, directamente dependiente de la concentración de glicerol. Es necesaria la utilización de otros sustratos en experimentos de transfosforilación para explicar de una manera más precisa la naturaleza de los complejos intermedios que se formarían en la secuencia de reacciones catalizadas por fosfatasa ácida.

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Manuscrito recibido el 17 de octubre de 2007 y aceptado para publicación el 13 de diciembre de 2007.

Correspondencia:
Dr. Emilio Guija Poma
Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición
Facultad de Medicina, UNMSM
Av. Grau 755. Lima 1, Perú
Correo-e: eguijap@hotmail.com

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