INTRODUCCIÓN
Las enfermedades del hígado representan una alta carga de morbimortalidad en el mundo. Según la OMS, para el año 2019 estas enfermedades se encontraban entre las diez primeras causas de decesos en países de bajos ingresos 1. Dentro de las etiologías más frecuentes están aquellas relacionadas a la alteración del metabolismo, tales como la esteatosis hepática no alcohólica (EHNA), virales crónicas como la hepatitis B, y el consumo crónico de alcohol 2.
Se ha observado que radicales libres (RL) participan en el desarrollo de la inflamación, cirrosis y diversas lesiones del hígado, produciendo lipoperoxidación a nivel celular o disminución de la actividad de las enzimas con capacidad antioxidante 3. Para contrarrestar los efectos de estos RL, se requiere de sustancias denominadas antioxidantes, las cuales se encuentran en ciertos alimentos. Estas sustancias atenúan los efectos dañinos de los RL, actuando como agentes reductores o induciendo la expresión de sistemas antioxidantes celulares. En el grupo de los antioxidantes exógenos, se encuentran los carotenoides, flavonoides, vitamina E, vitamina C, entre otros 4,5.
Se ha evaluado la capacidad protectora del camu camu en diversos estudios, tal es el caso de una investigación realizada en Japón, en donde se les proporcionó a varones fumadores con cuadro de estrés progresivo, jugo de camu camu (1050 mg de vitamina C) de forma diaria, por un período de siete días, reduciendo los marcadores oxidativos, como la proteína C reactiva e interleucinas 6 y 8 6.
Un estudio realizado en animales de experimentación, evidenció el posible efecto nefroprotector de la Myrciaria dubia frente al daño nefrotóxico inducido por gentamicina. Los resultados indicaron protección a distintas dosis del extracto alcohólico del fruto, tanto en el estudio histopatológico mediante una menor pérdida epitelial, inflamación y congestión vascular, como a nivel sérico con una disminución de la concentración de creatinina sérica frente al grupo inducido sólo al daño 7.
De igual manera, se ha demostrado su capacidad antioxidante observándose que la Myrciaria dubia inhibe el daño en el ADN frente a un modelo oxidativo ocasionado por KBrO3 en un estudio in vitro. Estos efectos fueron atribuidos al ácido ascórbico y los flavonoides, compuestos funcionales del fruto 8.
La Myrciaria dubia es oriunda de la amazonia peruana, su fruto presenta un alto contenido de vitamina C y otros compuestos bioactivos (antocianinas, catequinas, flavonoides), relacionados con un efecto protector y antioxidante en anteriores estudios. Estos componentes le han atribuido una variedad de efectos protectores a la salud, relacionándolo con un efecto antimutagénico, antioxidante e hipolipemiante 9.
El presente estudio tuvo por objetivo evaluar el efecto de la harina de Myrciaria dubia (camu camu) sobre el tejido hepático inducido a toxicidad por acetaminofén en ratones.
MÉTODOS
Suspensión de harina de camu camu
La harina de camu camu (HCC) se adquirió de la empresa Agroindustrial del Perú S.A. Para darle estabilidad, la HCC fue suspendida en un medio coloidal (MC) de almidón al 1,6 %.
Ensayo del efecto hepatoprotector
Se utilizaron 40 ratones albinos machos (BALB/c), de 2 meses de edad, con peso promedio de 30,8 g ± 5,1 g adquiridos del Instituto Nacional de Salud, mantenidos por un periodo de aclimatación de siete días, con dieta balanceada, agua ad libitum, y con fotoperiodo (12 horas de luz y 12 horas de oscuridad) en el bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM).
Para inducir al daño hepático se utilizó la propuesta modificada de Gibson y col. 10, que consiste en la administración, vía orogástrica, de acetaminofén (300 mg/kg).
Tras el periodo de aclimatación, fueron distribuidos en cinco grupos (n=8), recibiendo por 10 días los siguientes tratamientos, vía orogástrica:
Grupo I: MC 10 mL/kg
Grupo II: MC 10 mL/kg
Grupo III: HCC 200 mg/kg
Grupo IV: HCC 500 mg/kg
Grupo V: HCC 800 mg/kg
Al sexto día de iniciado el tratamiento, a los grupos II-V se les administró 300 mg/kg de acetaminofén, vía orogástrica, hasta el día diez. Terminado el período de tratamiento, los ratones fueron sometidos a 12 horas de ayuno, posteriormente fueron anestesiados con pentobarbital, vía intraperitoneal, y se realizó laparotomía para extraer el hígado el cual fue lavado con solución salina isotónica y pesado (Radwag WTB 200). Del lóbulo mayor se seccionaron dos porciones, para los indicadores bioquímicos y para el estudio histológico.
Determinación de los indicadores morfológicos
Homogenizado de tejido hepático (Hmg): se homogenizó aproximadamente 0,2 g de tejido hepático con buffer fosfato (0,01 mol/L a pH 7,4), a volumen final de 2 mL.
Determinación de la lipoperoxidación: (método de Buege y Aust) 11. Se utilizó 0,5 mL de Hmg y se agregó 1 mL de ácido tricloroacético 20% (TCA) (JT BAKER), luego se colocó por 10 minutos en baño María hirviente (100°C). Posteriormente, fue retirado y enfriado, y se adicionó 1,5 mL de ácido 2-tiobarbitúrico (SIGMA) a 0,67% en HCl 0,25 N, volviéndose a colocar por 20 minutos en baño María hirviente. Concluida la incubación, fue centrifugado por 15 minutos a 3500 rpm y leído en espectrofotómetro a 535 nm.
Determinación del GSH: (método de Seldak y Lindsay, con adaptación) 12. Del Hmg se tomó 1 mL y se agregaron 0,4 mL de TCA al 50% con 0,8 mL de agua bidestilada, y se agitó por dos minutos. Luego fue centrifugado por 15 minutos a 4000 rpm, obteniéndose el sobrenadante del desproteinizado (SNDP). Se tomó 0,5 mL del SNDP y se agregó 2 mL de TRISMA buffer (SIGMA) pH 8,9 a 0,4 mol/L, inmediatamente se incubó a 60°C por 5 minutos. Concluida la incubación fue retirado y se dejó enfriar para luego agregar 25 µL de ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) (SIGMA) 0,01 mol/L. Posteriormente se leyó a 412 nm.
Determinación de glutatión total: se siguió el mismo protocolo para la determinación del GSH, empleando un buffer TRISMA (15 mL de buffer + 7,5 mg de ácido glioxílico + 15 mg de ácido ascórbico) 0,4 mol/L, pH 8,9.
Evaluación morfológica e histológica, y determinación del índice hepático
El tejido extraído se conservó en formol al 10% tamponado (buffer fosfato pH 7,4 a 0,075 mol/L), los cuales fueron fijados en parafina y teñido con hematoxilinaeosina, en el Instituto de Patología de la UNMSM, y leído por un patólogo. Para el análisis de las muestras se consideró los siguientes aspectos: espacio portal, estructura del lobulillo hepático, conductos biliares, células de Kupffer y aspecto de los hepatocitos. Para determinar el índice hepático se empleó el peso del hígado y del animal, expresado en porcentaje.
Análisis estadístico y aspectos éticos
Para evaluar la normalidad de los datos se aplicó Shapiro-Wilk. Para aquellos indicadores que presentaron distribución normal se aplicó ANOVA, luego el estadístico de Levene para evaluar la homogeneidad de varianzas y por último el estadístico de Tukey.
El presente estudio consideró las normas éticas de experimentación animal según Pardo 13 y lo dispuesto por la Ley de Protección y Bienestar Animal N° 30407 14.
RESULTADOS
Respecto a lo observado en el grupo II, sobre los indicadores de estrés oxidativo, tras la administración del acetaminofén, el nivel de lipoperoxidación fue mayor (tabla 1); sin embargo, también presentó mayor nivel de GSH (Figura 1) y glutatión oxidado (GSSG) (Figura 2) sin mostrar diferencia significativa, respecto al grupo I. Los grupos que recibieron HCC, a diferentes dosis, mostraron niveles más altos de la relación GSH/GSSG (Figura 2), respecto al grupo II, siendo significativos en los grupos IV y V (p<0,05).
*Shapiro-Wilk (p>0,05)- ANOVA- Levene- Tukey MC: medio coloidal de almidón
HCC: harina de camu camu
a p<0,05 respecto al grupo II
b p<0,01 respecto al grupo II
Shapiro-Wilk (p>0,05)- ANOVA- Levene-Tukey
(a) p<0,01 respecto al grupo II
(b) p<0,05 respecto al grupo II
Shapiro-Wilk (p>0,05)- ANOVA- Levene- Tukey
(a) p<0,01 respecto al grupo II
(b) p< 0,05 respecto al grupo II
En relación a los índices morfológicos, en los ratones que solo recibieron acetaminofén (grupo II), se observó una mayor masa hepática, respecto al grupo I (p<0,05) (Tabla 1), y a nivel de la histoarquitectura se evidenció retención hemática y congestión sinusoidal de forma muy marcada; además, se apreció lisis de hepatocitos y cromatina fragmentada en la mayoría de los cortes. También se visualizó una pérdida de la distribución polar de los hepatocitos, infiltración linfomonocitaria perivascular y hepatocitos anucleados, presentando heterogeneidad y disparidad en todas las muestras evaluadas, en comparación al grupo I, el cual presentó una estructura conservada (Figura 3).
Los grupos que recibieron las diferentes dosis de HCC más acetaminofén, mostraron una disminución de su masa hepática dosis dependiente, siendo significativos en los grupos IV y V, comparado con el grupo II. Respecto al aspecto histológico, el grupo III (HCC 200 mg/kg) solo una muestra presentó canales biliares pignóticos, dos muestras presentaron localización de edema lobulillar y citoplasma vacuolado. También se observó leve congestión vascular (Figura 3, grupo III). El grupo IV (HCC 500 mg/kg) presentó una leve fragmentación de cromatina y mantenimiento polar de los hepatocitos, sin mayor daño (Figura 3, grupo IV); el grupo V (HCC 800 mg/ kg) mostró un mantenimiento ligero de la polaridad hepática, con espacio de Disse dilatado, también se observó en algunas muestras microvacuolas (Figura 3, grupo V). Todos los grupos que recibieron HCC presentaron binucleación de hepatocitos esparcidos en el tejido.
DISCUSIÓN
Los alimentos contienen compuestos que reducen los efectos nocivos de sustancias como los RL sobre las estructuras y funciones fisiológicas 15. Hoy en día se conoce el papel de los antioxidantes como protector en múltiples enfermedades, entre ellas el cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades hepáticas, diabetes mellitus, enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson), entre otros 16,17.
Según nuestros hallazgos, lo observado en el grupo II se encuentra relacionado a la sobredosis de acetaminofén, que en su metabolismo ocasiona la activación de factores proinflamatorios como el factor de transcripción nuclear KB (NF-KB) y el factor de necrosis tumoral (TNF-α), este último induce una cascada de citoquinas (IL-6, IL-8, IL-1β), desencadenando una respuesta inflamatoria, que va acompañada con necrosis tisular 18,19. Las lesiones hepatocelulares inducen a la inflamación con grados variables (hepatomegalia) y con predominio de necrosis centrolobulillar; también se presenta vacuolización de los hepatocitos centrilobulillares, traduciéndose en una delimitación de esta zona e infiltración de leucocitos 20,21, tal como se observó en el grupo II.
La biotransformación del acetaminofén por el citocromo P450, produce N-acetil p-benzoquinonaimina (NAPQI), que se une a las proteínas mitocondriales induciendo a estrés oxidativo, el cual genera radicales libres de oxígeno (ROS); esto podría estar relacionado con un mayor nivel de lipoperoxidación en el grupo II. El NAPQI también disminuye los niveles de GSH; sin embargo, pasadas las 48 horas, los niveles de GSH se pueden recuperar en un 70%, surgiendo una respuesta frente al continuo estrés oxidante 22,23,24.
Diversos autores han descrito la toxicidad del acetaminofén; así, Troncoso, empleando acetaminofén (200 mg/kg) en ratas, reportó a nivel histológico, hipertrofia de células de Kupffer, necrosis severa y retención biliar 25. En otro estudio, empleando 300 mg/kg de acetaminofén en ratones, se encontró alteración de la estructura hepática, congestión parenquimal, incremento de las células de Kupffer y apoptosis 26.
Los efectos benéficos encontrados en los grupos con ingesta de HCC, frente a la toxicidad del acetaminofén, pueden estar relacionados a las propiedades del ácido ascórbico (AA) en el control de los procesos de autofagia inducidos por los ROS y un sistema cisteína/cistina disminuida por el proceso metabólico tóxico del acetaminofén. El sistema cisteína/cistina es importante en la síntesis de GSH 27. El AA se encuentra en alta concentración en el camu camu, y su efecto podría estar relacionado con los niveles de GSH/GSSG en los grupos III-V (Figura 2).
Dentro de los compuestos fenólicos en el camu camu se encuentran los flavonoides, los cuales interactúan con los radicales libres evitando el daño oxidativo de los ácidos grasos poliinsaturados, limitando de esta manera el proceso de peroxidación lipídica, que es una característica del daño hepatocelular. Los efectos antioxidantes de estas sustancias ya han sido reportados por Nasser, quien tras administrar Egyptian Vicia calcarata y CCl4, redujo los niveles de malondialdehido, el cual es un indicador de la lipoperoxidación, e indujo las actividades de GSH peroxidasa, glucosa 6-P deshidrogenasa, superóxido dismutasa y catalasa, y de los niveles de GSH; dicho autor atribuyó estos efectos a los flavonoides, entre ellos el kaempferol y la quercetina 28. Esto podría estar relacionado a un probable efecto protector del camu camu, que dentro de su composición de flavonoides se encuentran la quercetina, miricetina, y otros polifenoles como el ácido siríngico y el ácido elágico 29.
El efecto que ejerce la quercetina sobre la lesión hepática se relaciona con una disminución de las actividades de las transaminasas (ALT y AST), TNF-α y múltiples citoquinas que están asociadas a la inflamación, fibrosis y necrosis hepática. También se le relaciona con un aumento de GSH y de IL-10, este último actúa como un potente antiinflamatorio 30.
Las catequinas, presente en la HCC, han sido evaluadas frente a la hepatotoxicidad por fármacos, observándose un menor daño a nivel histológico y una menor actividad de las transaminasas en sangre. También se observó una menor actividad de CYP3A y CYP2E1, enzimas que metabolizan al acetaminofén 31. Esto podría estar relacionado a lo observado en nuestro estudio, en los grupos que recibieron HCC en las diferentes dosis a nivel histológico y del perfil de GSH.
La presencia de binucleación de hepatocitos en los grupos que recibieron la HCC, podría estar relacionado al GSH, a nivel nuclear, ya que este antioxidante promueve la replicación, reparación y expresión del ADN, como también participa en el control de la mitosis 32. Otro aspecto importante es la relación GSH/ GSSG, ya que es un indicador del estado redox del tejido hepático, por tanto, un incremento de GSH, ligado a compuestos bioactivos, podrían jugar un papel en la regeneración del tejido 33.
El presente estudio no evaluó transaminasas a nivel sérico, debido a la dificultad de la obtención de muestra de sangre. Otra limitación fue la no determinación de grupos sulfhidrilos proteicos, por carencia de reactivo.
Concluimos, según nuestros hallazgos, que la administración de harina de Myrciaria dubia (camu camu) presenta efecto hepatoprotector frente al acetaminofén, evidenciado en el tamaño de la masa hepática, en la histoarquitectura e indicadores bioquímicos, en ratones.