Español (pdf)
Articulo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar articulo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
INTRODUCCIÓN
Desde hace ya algunos años, la masticación ha dejado de ser entendida solamente como una actividad eminentemente digestiva; muchos estudios la relacionan como un modulador de diversos procesos en el sistema nervioso central (SNC) 1,2. La masticación es una fuente de estimulación sensorial que llega principalmente a la formación hipocampal, y contribuye a preservar y promover los procesos cognitivos; sugiriéndose que la deficiencia masticatoria puede promover alteraciones en funciones superiores 3. Diversos diseños en animales de experimentación han mostrado que la masticación deficiente causa anormalidades hipocampales a nivel anatómico, funcional y en última instancia molecular; resaltándose la disminución en: la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro, las neuronas piramidales en CA1 y CA3, la neurogénesis del giro dentado, el aumento e hipertrofia de células gliales y el deterioro de la memoria y aprendizaje espacial (3,4.
El estrés agudo es una respuesta psicológica, fisiológica e inmediata ante estímulos nocivos y ante cambios ambientales que activan al sistema autónomo y neuroendocrino, donde a través del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal (HPA) provoca cambios en el nivel de diversas citoquinas circulantes 5. Apretar los dientes y roer o morderse las uñas son comportamientos masticatorios ante el estrés 3. La función masticatoria altera la actividad del eje HPA y del sistema nervioso autónomo, disminuyendo los niveles plasmáticos de catecolaminas y de corticosterona, pudiendo considerar-se a la masticación como un factor que contribuiría a reducir las alteraciones inducidas por el estrés sobre las funciones cognitivas 1,2,3.
Las estudios acerca de la biología del estrés involucran, principalmente, a las citoquinas inflamatorias como la interleuquina-6 (IL-6) y la interleuquina-1 beta (IL-1β), así como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la proteína C reactiva (PCR) 6, los cuales se han estudiado con mayor frecuencia como marcadores de interfaz entre la psicología y la biología, debido a que estas citocinas se asocian o responden a estímulos psicosociales 7. Estas citocinas son proteínas solubles de bajo peso molecular secretadas por una diversidad de tipos celulares como los linfocitos, macrófagos, células asesinas naturales, mastocitos y células del estroma; participando en la respuesta inmunitaria y actuando como importantes mediadores asociados a la red de comunicación del sistema inmunitario 8.
El estrés agudo induce, principalmente, la expresión de IL-6 5,9. La IL-6 es una glicoproteína de 21 a 26 kDa conformada por 212 aminoácidos, es producida por muchos tipos de células, incluidas las células hematopoyéticas, los miocitos, las células endoteliales y adipocitos 10. Dentro del SNC, la IL-6 es una molécula con potencial tanto beneficioso como destructivo, pues desempeña funciones esenciales en el desarrollo, la diferenciación y la regeneración celular, pudiendo ser secretada por microglías, astrocitos y neuronas 11. Un experimento en ratas reportó que la deficiencia de IL-6, por bloqueo mediante anticuerpos anti-IL-6, produjo déficit en una tarea de aprendizaje inverso 12; sin embargo, otro estudio encontró que la misma deficiencia de IL-6, igualmente por bloqueo, aumentó la potenciación a largo plazo y mejoró la memoria dependiente del hipocampo 13. Otro estudio encontró, en ratones knockout para IL-6, una mejor memoria y aprendizaje espacial comparados con los ratones no modificados genéticamente, al ser evaluados en un laberinto de brazos radial 14. Algunos estudios sobre IL-6 y aprendizaje y plasticidad neuronal mostraron que la eliminación genética de IL-6 no interrumpió el aprendizaje y la memoria, mientras que la sobreexpresión, o la aplicación sistémica de IL-6 causó un amplio deterioro de la memoria 15.
En general, por una parte, se entiende que el estrés agudo eleva la expresión sérica de IL-6, y, por otra parte, que el estímulo masticatorio evita los efectos del estrés sobre las funciones cognitivas entre ellas la memoria y aprendizaje espacial; sin embargo, la relación entre todas estas variables no es entendida claramente ni tampoco ha sido previamente investigada, sino solo de manera parcial y con resultados contradictorios 14,15,16,17. Debido a ello el objetivo de la investigación fue determinar el efecto del estímulo masticatorio sobre el estrés agudo en la expresión sérica de IL-6 y en la memoria y aprendizaje espacial en ratones Balb/c.
MÉTODOS
Diseño y sujetos de experimentación
Realizamos un estudio experimental en 70 ratones albinos machos de 8 semanas de edad de la cepa BALB/c adquiridas en el Centro de Producción de Animales de Experimentación del Instituto Nacional de Salud de Lima, Perú. Los roedores fueron ambientados durante una semana en el bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos; luego de la ambientación, la muestra fue distribuida de manera aleatoria en 7 grupos de 10 ratones cada uno.
Los grupos de experimentación fueron: grupo A1: estrés agudo 1 hora, grupo A2: estrés agudo 1 hora + estímulo masticatorio 1 hora, grupo B1: estrés agudo 2 horas, grupo B2: estrés agudo 2 horas + estímulo masticatorio 2 horas, grupo C1: estrés agudo 3 horas, grupo C2: estrés agudo 3 horas + estímulo masticatorio 3 horas, grupo D: control sin estrés ni estímulo masticatorio.
Inducción del estrés agudo por inmovilización
Después de la semana de ambientación fue inducido estrés por inmovilización a todos los grupos experimentales a excepción del control. Dicha inducción consistió en colocar al roedor en una caja de restricción de movimiento de poliestireno transparente, de acuerdo con el diseño de Lam-Figueroa et al 2020 18, como se observa en la figura 1A.
La cuantificación del estrés agudo fue en base al tiempo de permanencia de los animales en la caja de restricción, fue de 1 hora en los grupos A1 y A2; de 2 horas en los grupos B1 y B2 y de 3 horas en los grupos C1 y C2. Dicha inmovilización se realizó una vez al día entre las 8:00 y 13:00 horas durante 3 días consecutivos en cada grupo experimental.
Inducción del estímulo masticatorio
A los grupos A2, B2 y C2 se les permitió roer una varilla de madera durante todo el tiempo que duró el sometimiento al estrés agudo por inmovilización, siguiendo lo descrito por el diseño de Kubo et al. 19, como se observa en la figura 1B. La cuantificación de dicha variable fue en base al tiempo que los ratones royeron la varilla que fue de 1 hora en el grupo A1, de 2 horas en el grupo B2 y de 3 horas en el grupo C2. A los grupos A1, B1 y C1 no se les suministró dicha varilla.
Procedimiento para evaluarla adquisición de memoria y aprendizaje espacial
Se empleó el laberinto acuático de Morris (LAM), de acuerdo con los parámetros descritos por Aguirre-Siancas 20) y que consistió en un tanque de plástico de forma circular de 60 cm de diámetro y 30 cm de altura que se dividió en 4 cuadrantes. Dentro del LAM se colocó un dispositivo denominado "plataforma de escape" hecho de plástico, con una altura de 23 cm, un área cuadrada superficial de 36 cm2 y que se ubicó siempre en el mismo cuadrante. El LAM se llenó hasta los 24 cm de altura con agua tintada de negro, la cual se mantuvo a una temperatura de 22 ± 2 °C. La plataforma de escape quedó oculta 1 cm por debajo del nivel del agua.
La evaluación de la adquisición de memoria y aprendizaje espacial fue realizada en cada animal a medida que terminaban con su tratamiento de restricción. Dicha evaluación se realizó entre las 08:00 y 13:00 horas. Cada ratón realizó 4 ensayos separados por 60 s de descanso. Un ensayo consistió en la liberación del animal, de manera aleatoria, de alguno de los 4 cuadrantes posibles. El ensayo concluyó cuando el roedor se posó por lo menos 15 s sobre la plataforma oculta o si es que nadó un tiempo máximo de 60 s sin encontrar la plataforma, en tal caso el puntaje asignado al ratón fue de 90 s de duración del ensayo. La cuantificación de esta variable se hizo en base al tiempo en que los animales llegaron a la plataforma oculta. Se consideró una mayor adquisición de memoria y aprendizaje espacial cuando menos tiempo demoró el roedor en llegar dicha plataforma. Dicho procedimiento se realizó por 3 días consecutivos. Todos los ensayos fueron filmados y luego se proyectaron en una computadora para obtener los tiempos que demoró cada ratón mediante mediciones crono-métricas en concordancia con el procedimiento descrito por Oyuela et al. 21
Evaluación de la concentración sérica de IL-6
La determinación de la citoquina se realizó al terminar el tercer día de experimentos, luego de la última evaluación de memoria y aprendizaje espacial. La colección de la muestra de sangre fue mediante punción cardiaca en tubos Minicollect(r) Z serum con una jeringa estéril de 1 mL 25Gx5/8 marca Segurimaxx. La muestra se incubó a 37°C durante 30 minutos y se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente.
La cuantificación de la citoquina fue mediante un kit de ELISA sándwich para IL-6 (Invitrogen 88706488). La concentración de citoquinas fue calculada utilizando regresión polinómica de orden 2 mediante el lector de ELISA (Sinowa ER500) a D.O450 y D.O630, todo esto de acuerdo con el diseño de Aguirre-Siancas et al. 22
Aspectos éticos
El protocolo del estudio fue aprobado por el Vicerrectorado de Investigación y Postgrado de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos con código A1901021. La manipulación de los animales se realizó respetando las normas internacionales de uso de animales de experimentación de la Office of Animal Care and Use of National Institutes of Health.
Análisis estadístico
El análisis y la interpretación de los datos se realizó empleando el programa SPSS versión 20 para Windows. Debido a la normalidad de los datos, evaluado con la prueba de Shapiro-Wilk, utilizamos la prueba t de Student, el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey. El nivel de significancia fue de 0,05.
RESULTADOS
La concentración de IL-6 fue mayor en el grupo de estrés agudo 2 horas + estímulo masticatorio 2 horas respecto a los demás grupos y al control (p < 0,001) (Tabla 1). No se encontró diferencias entre las medias del tiempo para realizar la prueba de memoria y aprendizaje espacial entre los grupos de experimentación, este resultado se dio en los tres días de evaluación (Tabla 2). Respecto a la comparación de medias dentro de cada grupo experimental, se observa que, a excepción del grupo A2, el tiempo para realizar la prueba fue mayor en el primer día. Sin embargo, solo en el grupo A1 se observaron diferencias significativas entre las medias del tiempo para realizar la prueba entre los tres días (p = 0,002) (Tabla 3).
Tabla 1 Comparación entre grupos de experimentación de la concentración sérica de interleuquina 6 en ratones Balb/c
A1: Estrés agudo 1 hora; A2: Estrés agudo 1 hora + estímulo masticatorio 1 hora; B1: Estrés agudo 2 hora; B2: Estrés agudo 2 horas + estímulo masticatorio 2 horas; C1: Estrés agudo 3 hora; C2: Estrés agudo 3 horas + estímulo masticatorio 3 horas, D: grupo control.
DE: Desviación estándar. a Prueba de ANOVA. b Grupo con media que es significativamente diferente a los demás grupos (prueba de Tukey).
Tabla 2 Comparación intergrupos mediante análisis de varianza de la adquisición de la memoria y aprendizaje espacial medido en segundos durante los 3 días de trabajo en ratones Balb/c
A1: Estrés agudo 1 hora; A2: Estrés agudo 1 hora + estímulo masticatorio 1 hora; B1: Estrés agudo 2 hora; B2: Estrés agudo 2 horas + estímulo masticatorio 2 horas; C1: Estrés agudo 3 hora; C2: Estrés agudo 3 horas + estímulo masticatorio 3 horas; D: Control.
DE: Desviación estándar. F: estadístico F
Tabla 3 Comparación intragrupo mediante análisis de varianza de la adquisición de la memoria y aprendizaje espacial medido en segundos durante los 3 días de trabajo
A1: Estrés agudo 1 hora; A2: Estrés agudo 1 hora + estímulo masticatorio 1 hora; B1: Estrés agudo 2 hora; B2: Estrés agudo 2 horas + estímulo masticatorio 2 horas; C1: Estrés agudo 3 hora; C2: Estrés agudo 3 horas + estímulo masticatorio 3 horas. DE: Desviación estándar. F: Estadístico F. a Prueba de ANOVA para muestras relacionadas. b Media es significativamente diferente de las otras dos.
En la comparación de las medias de los tiempos entre los grupos de estrés + estímulo masticatorio vs grupo con solamente estrés, se encontró que, en el primer día de ensayos, el grupo de estrés 1 hora demoró más tiempo que el grupo de estrés 1 hora + estímulo masticatorio 1 hora en encontrar la plataforma de escape (p = 0,042). En las demás comparaciones no hubo diferencias significativas (Tabla 4).
Tabla 4 Comparación entre grupos expuestos a estrés agudo versus estrés agudo más estímulo masticatorio durante diferentes tiempos de exposición
A1: Estrés agudo 1 hora; A2: Estrés agudo 1 hora + estímulo masticatorio 1 hora; B1: Estrés agudo 2 hora; B2: Estrés agudo 2 horas + estímulo masticatorio 2 horas; C1: Estrés agudo 3 hora; C2: Estrés agudo 3 horas + estímulo masticatorio 3 horas.
DE: Desviación estándar. a Prueba t de Student para muestras relacionadas.
DISCUSIÓN
En nuestro estudio, no encontramos diferencias en la adquisición de memoria y aprendizaje espacial entre los grupos de experimentación en ninguno de los 3 días de evaluaciones. Sin embargo, cuando se evaluó, a los animales agrupándolos por tiempo de exposición al estrés, se encontró una mayor adquisición de memoria y aprendizaje espacial en el grupo sometido a estrés de 1 hora + estímulo masticatorio 1 hora vs estrés de 1 hora, solo en el primer día de evaluación. Este hallazgo no es consistente con las investigaciones que reportan que el estímulo masticatorio previene los déficits de aprendizaje al evitar la disminución del factor neurotrófico derivado del cerebro y regular la expresión de los receptores de cortisol a nivel hipocampal, los cuales son biomarcadores involucrados en la memoria y aprendizaje 17,19,23. Se sabe también que una masticación eficiente aumenta la expresión del ARNm de los receptores de glutamato, el cual es necesario para el adecuado metabolismo del neurotransmisor indispensable para la memoria y aprendizaje 24.
Miyake et al. 17, encontraron que el estrés agudo por inmovilización, produce en ratas menor memoria y aprendizaje espacial y menor número de neuronas inmunopositivas al receptor de glucocorticoide en el hipocampo, comparado con el grupo al que se inmovilizó y permitió masticar una varilla de madera; en dicha investigación usaron un protocolo donde previamente entrenaron a los animales en el LAM durante 4 días, después de los cuales los sometieron por una sola vez a estrés agudo por 2 horas y un día después evaluaron su memoria y aprendizaje. En el presente trabajo se empleó un protocolo diferente, pues los animales fueron evaluados en el LAM inmediatamente después del estrés agudo. Estas diferencias procedimentales pueden explicar los resultados no concordantes, aunque hay coincidencias parciales si observamos los resultados entre los grupos A1 vs A2 en el primer día de evaluación.
El estrés agudo, a diferencia del estrés crónico, genera una respuesta adaptativa que proporciona la energía que contribuye a que los organismos vivos puedan superar el factor estresante al cual son sometidos 25. En el estrés agudo se activa inmediatamente el sistema nervioso simpático y poco tiempo después el eje hipotálamo-pituitaria-adrenal (HPA), produciéndose el aumento sistémico de catecolaminas y posteriormente de cortisol, los cuales mantiene sus niveles plasmáticos dependiendo la intensidad del estímulo estresor 26. Se encontró una menor adquisición de memoria y aprendizaje espacial en los ratones sometidos a estrés por 1 hora (grupo A1) en el primer día, comparado con el segundo y tercer día dentro del mismo grupo. Sugiriendo que el estrés de baja intensidad (1h), al pasar los días, tiene algún rol en el mejoramiento de la memoria y aprendizaje. Ye et al. 27, empleando el LAM, encontró que el estrés agudo de baja intensidad mejora la memoria y aprendizaje espacial comparando animales sometidos a estrés agudo vs controles no estresados. Los investigadores explican dichos resultados a través de la regulación de los receptores sensibles a ácido (ASIC), donde el aumento de la corriente de ASIC seria consecuencia del incremento de cortisol en el estrés agudo 27. Resaltando que los ASIC se expresan en gran medida en las neuronas centrales y sensoriales periféricas y están implicadas en múltiples procesos fisiológicos y patológicos 28.
El estrés produce cambios a nivel inmunológico, con variación en la expresión de diversas citoquinas que pueden generar diversas alteraciones como los trastornos psiquiátricos, enfermedades sistémicas como las infecciones, las enfermedades autoinmunes y el cáncer 6. En diversos trabajos en modelos murinos se ha encontrado que el estrés agudo aumentó la expresión de IL-6 y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) comparados con los controles no estresados 5,9,29. En nuestro trabajo se ha encontrado que la IL-6 fue mayor en los roedores tratados con estrés agudo 2 horas + estímulo masticatorio 2 horas. Estos resultados se asemejan a los obtenidos por Chiba et al. (30, quienes encontraron que los ratones inmovilizados en un cilindro masticando una tira de plástico durante 1 hora tuvieron niveles incrementados de IL-6, aunque en los ensayos de nuestro estudio esta diferencia se encontró en los animales después de 2 horas de tratamiento. Del mismo modo, en pacientes con desordenes temporomandibular y en sus controles sanos se halló que el apretamiento repetitivo de los dientes aumentó los niveles de IL-6 (31. Además, en experimentos in vitro de músculos maseteros de ratones estimulados por electrochoque, que fueron alimentados con una dieta extradura, se ha demostrado un aumento en la expresión y liberación de IL-6 en el músculo, lo cual fue mediado por ATP y receptores purinérgicos P2Y/P2X (32,33.
Dentro de las limitaciones, consideramos que el empleo de más pruebas comportamentales, para evaluar la memoria y aprendizaje espacial, podrían habernos dado una visión más completa sobre dicha variable, dada la existencia de laberintos terrestres que tiene otro tipo de marco conceptual al que se ha empleado en el trabajo. Además, el empleo de indicadores más sensibles como pruebas genómicas podrían darnos una mayor precisión en los resultados de las variables estudiadas.
En conclusión, el estímulo masticatorio previene la disminución en la adquisición de memoria y aprendizaje espacial en ratones sometidos a estrés agudo de baja intensidad, como fue visible en el primer día de evaluación en el grupo inmovilizado por 1 hora. Además, en el grupo donde solamente se indujo estrés agudo por 1 hora, se observó una mejora de la adquisición de información espacial a medida que pasaron los días. Por otra parte, la IL-6 fue mayor en el grupo de estrés + el estímulo masticatorio por 2 horas.
