INTRODUCCIÓN

Las micosis son consideradas como enfermedades desatendidas en la región latinoamericana, y entre ellas resalta la aspergilosis invasiva (AI). Esta infección es producida por Aspergillus fumigatus sensu stricto (AFSS), su diagnóstico es fenotípica y molecularmente. Tiene una elevada mortalidad (cercana a 50%) y morbilidad en pacientes con enfermedades crónicas. Estudios multicéntricos han detectado una mortalidad de 19 a 28% y se incrementa a 49% cuando hay resistencia a voriconazol (VOR) ¹. En los Estados Unidos un estudio de vigilancia nacional de Aspergillus fumigatus (AF) entre 2015 a 2017, encontró a partir de 179 cepas clínicas y 12 cepas ambientales (granjas de cultivo), una prevalencia de 26% de resistencia a triazoles, y 25% de detección de mutaciones del gen cyp51A². En Latinoamérica existen estudios aislados de resistencia a triazoles en cepas clínicas y ambientales, que reportan una prevalencia aproximada de 3,2%, del cual AF ocupa el 78% de casos ³.

Los estudios epidemiológicos diferencian la condición clínica de las personas como portador o colonizado, y la infección como la AI, aspergilosis pulmonar crónica (APC) y aspergilosis bronco pulmonar alérgica (ABPA) ⁴. Las guías de práctica clínica utilizan a los azoles como terapia de primera línea contra infecciones por AF hasta que surja el evento de falla terapéutica por resistencia ⁵. La alarma de salud pública por esta infección debe justificarse por la alta diseminación de conidias ambientales que generan resistencia por generación de novo (espontánea) o diseminación clonal de genes asociados ^2,6. El mecanismo de resistencia a azoles en AF puede ser simplificado en 2 vías según el origen de la cepa: 1. la presión selectiva ejercida por pesticidas tipo azoles en agricultura (en Europa y Asia el uso es de 20 a 40%, en EE.UU. es <5%, y en Latinoamérica solo hay registros de Colombia) ^1,3,6,7 y 2. la generación de resistencia en conidias ambientales, o por el uso prolongado de azoles como terapia antifúngica sobre todo en pacientes con enfermedades crónicas pulmonares ^3,6.

Se han identificado filogenéticamente dos clados de AF resistente a azoles a partir de la vigilancia estadounidense: clado A (12%) portador de la mutación TR34/L98H específicos de Europa y Asia; y el clado B (83%) donde se encuentran cepas sin el marcador TR34/L98H aunque diseminadas en cepas ambientales y clínicas ². Las cepas clínicas obtenidas de especímenes invasivos (AI, APC, aspergiloma) son de utilidad para la identificación y evaluación de factores de virulencia en ensayos in vitro, y el reconocimiento de genes asociados a resistencia a antifúngicos ⁸. Un estudio demostró que 4 aislamientos peruanos procedentes de AI poseen una tasa de crecimiento vegetativo más rápido hasta en 48°C de incubación (factor de virulencia), significativamente más alto en comparación a cepas obtenidas en otros países ⁹.

El mecanismo de infección es a través de las conidias que se encuentran en el medio ambiente y la existencia de una persona susceptible. Los pacientes colonizados por AF de la sección Fumigati en las vías respiratorias, junto a comorbilidad por fibrosis quística o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, son una de las principales fuentes de diseminación de conidias al ambiente a través de la tos ^6,10.

La última actualización documentada del Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) M38M51SED3E ¹¹ ha estandarizado el punto de corte clínico de Mínima Concentración Inhibitoria (MCI o MIC por sus siglas en inglés) de voriconazol para Aspergillus fumigatus. Esto permite dejar en desuso el reporte de puntos de corte epidemiológico para aquellos antifúngicos que no tenían un punto de corte clínico, lo cual brinda más información farmacológica para los médicos tratantes. Esto es de relevancia para un tamizaje oportuno y confiable para la detección de resistencia a azoles por mutaciones puntuales del gen cyp51A¹².

El objetivo de este estudio es conocer la susceptibilidad de nuestros aislamientos clínicos a antifúngicos triazólicos. Los datos de frecuencia y prevalencia de resistencia a azoles en AFSS continúa siendo subnotificado y subestimado, por ello, es necesario el reporte de más estudios a partir de cepas clínicas y ambientales en Sudamérica ^1,3,9. Igualmente, es necesario implementar la vigilancia y reporte de datos de susceptibilidad a los azoles, y la estandarización en laboratorio debido a la complejidad de las metodologías, preparación del inóculo de conidias para ensayos y la necesidad de personal experimentado ⁴.

MÉTODOS

RESULTADOS

Las 20 cepas sembradas a 25°C desarrollaron colonias de entre 35 a 70 mm de diámetro, de color verde azulado, sin difusión de pigmento en el agar; a 37°C desarrollaron colonias de entre 50 y 80 mm de diámetro de color blanco y algunos casos con aspecto algodonoso. La forma microscópica presentó cabezas aspergilares uniseriadas, vesículas piriformes con fiálides ocupando dos tercios de las vesículas, con conidios globosos y superficie lisa, tanto a 25°C como a 37°C.

A las 20 cepas se les realizó identificación molecular dando como resultado que todas fueron identificadas como AFSS. Se observó una banda de PCR de 213 pb correspondiente a la amplificación de la región específica del CIP51A de A. fumigatus sensu stricto en todas las cepas.

En la tabla 1 se resume la identificación fenotípica, espécimen biológico del cual fue aislado la cepa clínica de AF y el resultado de amplificación molecular para la confirmación de AFSS.

Se realizó la distribución de los valores de MIC para cada antifúngico considerando frecuencias absolutas y rangos para percentiles 50 y 90 (Tablas 2 y 3). En la sensibilidad del ITC en el IMT se obtuvieron 2 cepas con MIC de 0,06 ug/mL, 17 cepas con 0,12 ug/mL, 2 cepas con 0,06 ug/mL y en la sensibilidad realizada en UNL se encontró 12 cepas con 1,0 ug/mL, 7 cepas con 0,5 ug/mL y 1 cepa con 0,25 ug/mL (Tabla 1). Según la distribución de percentiles se obtuvo un MIC 50 de 0,12 ug/mL en el IMT y en UNL un MIC 50 de 0,50 ug/mL. Mientras que el MIC 90 fue 0,5 ug/mL en el IMT y 1,0 en UNL ug/mL (Tabla 2). El punto de corte evaluado fue el epidemiológico con valor menor igual a 1 ug/ml. Se presenta la distribución de las MIC para las 20 cepas tanto la sensibilidad realizada en el IMT y en UNL.

Así mismo, en la tabla 4 se exponen los datos de los MIC comparativos de ITC entre resultados obtenidos en IMT/DAC y UNL, donde observamos que los datos del IMT/DAC se encuentran 1 o 2 diluciones por debajo a los obtenidos por la UNL.

Ninguna de las cepas presentó MIC por encima de los puntos de corte clínicos (existen solo para voriconazol), ni por encima de los puntos de corte epidemiológicos (ITC, ISA, AMB y CSF). El POS fue la droga más potente frente a la colección de cepas evaluadas (media geométrica (GM) de MIC de 0,042 ug/mL), seguido por ANF y VRC (GM de 0,071 y 0,297 ug/mL, respectivamente). Los rangos de MIC fueron estrechos. Ningún antifúngico presentó rangos de más de 4 o 5 diluciones con la excepción de ISA que presentó todas las MIC entre 0,5 y 1 ug/mL (Tabla 5).

DISCUSIÓN

De las 20 cepas clínica de AF obtenidas de especímenes biológicos de fuente del tracto respiratorio de pacientes con AI, se realizó la identificación molecular como AFSS en todas. La técnica de PCR screening permite la discriminación de A. fumigatus sensu stricto de las principales especies cripticas de la sección Fumigati aisladas de aspergilosis invasivas. En la evaluación de los azoles, la realizamos con el VOR que es el único antimicótico que en estos momentos tiene un punto de corte clínico para inferir si hay resistencia clínica o no. En las 20 cepas evaluadas no se encontraron niveles de resistencia, por lo que afirmamos no tienen fenotipo de resistencia y no ameritó realizar en un estudio posterior la detección del gen cyp51A. Para ITC, POS e ISA se evaluaron con los puntos de corte epidemiológicos y también confirmamos que los MIC obtenidos son menores a estos puntos y serían consideradas a tipo salvaje (wild type).

Actualmente un estudio en Perú evaluó el perfil de susceptibilidad a azoles en cepas clínicas y ambientales de AF. El estudio de Bustamante y colaboradores (2020) recolectaron 143 cepas de AFSS en dos hospitales de nivel III durante 1 año, de las cuales el 81% provenían de especímenes respiratorios, 50% de pacientes con antecedente clínico de tuberculosis y 22% expuestos a azoles previamente. En este estudio 3 cepas (2,1%) procedentes de muestras respiratorias no definidas fueron catalogadas como no susceptibles para itraconazol por mutaciones del cyp51A, muy por debajo de lo obtenido en España con 38,1% por este mecanismo ^14,15. En Argentina a partir de 50 cepas de AF (78% fueron AFSS) obtenidas de pacientes con fibrosis quística se detectó que el 90% eran portadores, 50% eran pacientes pediátricos, y una relación entre AF y ABPA en 12 casos. Como desenlace se evidenció 1 muerte por falla respiratoria asociado a APC ¹⁰. En Brasil, se detectó 1,8% de AF resistentes a VOR ¹⁶. En Martinica (mar Caribe) se reportó 8,9% de AF clínicos resistentes a azoles con altos MIC ¹⁷.

En cuanto a cepas obtenidas por muestreo de suelos, a nivel sudamericano la resistencia de AF a azoles se encuentra entre 7 a 10%, incluyendo 106 cepas de origen peruano (Lima) de las cuales AF cuenta con 57,7% de aislamiento y 6 de ellas por encima del punto de corte epidemiológico (PCE) a azoles (ITR >16 ug/mL, VOR >2 ug/mL, POS 1 ug/mL) detectando mutación del gen cyp51A¹⁸. Filogenéticamente, las cepas peruanas de AF se asignaron al mismo clado de las cepas clínicas de Francia, suponiendo una diseminación muy rápida y entre fronteras; aunque otro estudio la incluye en el clado I, junto a cepas mexicanas ^9,19.

El estudio más extensivo en el uso de estas cepas se realizó en España quienes a partir de un estudio nacional se detectó ―a partir de 828 cepas de AFSS en 98% de lavados bronquiales― resistencia a más de 1 azoles en 5,5% y 95% de resistencia en especies cripticas de la sección Fumigati¹⁵. En sentido contrario, el contexto clínico puede elegir análisis más oportunos como la detección de galactomanano en suero >1,04 como factor pronóstico de mortalidad (OR=37,9) en una UCI de India debido a su alta mortalidad de 29,7% en 14 días, y 17,6% de resistencia a azoles en AF ²⁰.

El estudio de cepas ambientales de AF es un segundo asunto gravitante a la aparición de cepas clínicas resistentes a azoles. En un estudio de muestreo de ambientes hospitalarios se encontró un caso de asociación entre el cultivo de AF detectado en el baño de un paciente con EPOC a partir de esputo. Tanto la cepa clínica como la ambiental coinciden en identificación molecular y perfil de resistencia a ITR >8 ug/mL, VOR de 4 ug/mL, y POS de 0,5 ug/mL ²¹. Es así como las conidias podrían ser vehículos de genes de resistencia hacia los humanos colonizados, especialmente cuando las cepas ambientales son sometidas a presión selectiva por fungicidas azólicos (inhibidores de demetilasa, imidazol).

También se detectan mutaciones del cyp51A (G228S específico para VOR) en cepas clínicas evaluadas prospectivamente ^2,21,22. Un estudio ha evaluado cepas ambientales de nuestro medio ²⁰, donde a partir de 61 cepas de AF (57,5% de hongos ambientales) se encontró resistencia a los azoles en 6 cepas y además se detectó la mutación del gen cyp51A en 9,8% de las cepas. Existe evidencia de la presencia de cepas ambientales con la mutación de resistencia a los azoles, por lo que debe implementarse la vigilancia de infecciones y resistencia por parte del Ministerio de Salud del Perú, ya que, haciendo monitoreo nos podrá garantizar si hay tendencia al aumento de MIC a itraconazol en cepas clínicas de AF y poder tomar las medidas de salud pública necesarias para su control.

Entre las principales limitaciones, respecto a otros estudios, mencionamos la hetero resistencia intra-colonias o inter-especie de un cultivo de AF y el protocolo estándar que se utiliza que es un cultivo monospórico ^6,9,15,16. Por otro lado, es asunto pendiente realizar ensayos de identificación molecular y susceptibilidad a azoles en más de una colonia de la misma placa de cultivo, así como recolectar un número mayor de cepas clínicas. Nuestro estudio evaluó un escaso número de cepas en comparación a otros estudios; por ello, es importante que existan más reportes de este tema de investigación en nuestro país para que los tomadores de decisiones en salud pública visibilicen brotes latentes en áreas críticas de atención. Por ejemplo, en Martinica se legisló la disminución de azoles como fungicidas en campos de cultivo, y a ello atribuyen su baja prevalencia de resistencia a azoles 2% en cepas ambientales de AF ¹⁸.

Específicamente se recomienda estudiar, dentro de los aislamientos con MIC superior al PCE, cepas con valores de MIC superiores al MIC 50 de los antifúngicos para generar evidencia en el establecimiento de puntos de corte clínicos según CLSI ^11,19. Finalmente, las mutaciones puntuales de cyp51A no es el único mecanismo de resistencia a azoles en AF y amerita que los laboratorios implementen y estandaricen procedimientos para su detección oportuna a futuro en la región sudamericana ¹⁶.

La AI no es una enfermedad de notificación obligatoria ante entidades nacionales de salud pública, por lo que no se conoce la cantidad de pacientes afectados. Del mismo existe carencia de laboratorios gubernamentales con la capacidad instalada para obtener un diagnóstico clínico y de laboratorio oportuno y confiable ^12,20. La estandarización de los procedimientos y técnicas de laboratorio puede ser otro punto de inflexión debido a que se debe tener personal calificado y entrenado. El reto es implementar procesos de identificación molecular de rutina, y las pruebas de sensibilidad in vitro, que utilizan una técnica compleja que muy pocos laboratorios comerciales realizan ^4,6. Por último, los laboratorios de referencia del país optan por estudiar la presencia de los genes de resistencia en laboratorios fuera del Perú, por la dificultad intrínseca del método manual y la pendiente implementación de métodos automatizados; y la disponibilidad de recursos biotecnológicos.

Concluimos que las 20 cepas evaluadas de aspergilosis invasiva no presentaron resistencia a los antifúngicos itraconazol, voriconazol y posaconazol. No se identificó al gen cyp51A. Nuestros hallazgos aportan a incrementar la escasa información sobre la etiología y sensibilidad a los antifúngicos de uso clínico de las aspergilosis invasiva en nuestro país.