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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versión impresa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú v.23 n.3 Lima ago. 2012

 

Genotipificación y subtipificación molecular de cepas de clostridium perfringens aisladas en alpacas muertas por enterotoxemia

Molecular genotyping and subtyping of clostridium perfringens isolated from fatal enterotoxemia in alpacas

 

David Pérez1, Lenin Maturrano2,4, Raúl Rosadio2,3

1 Servicio Nacional de Sanidad Agraria – SENASA, Perú

2 Unidad de Biología y Genética Molecular, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima

3 CONOPA – Instituto de Investigación y Desarrollo de Camélidos Sudamericanos, Perú

4 E-mail: lenin.maturrano@gmail.com


RESUMEN

A pesar de que la enterotoxemia causada por el Clostridium perfringens ocasiona elevadas tasas de mortalidad neonatal en alpacas, muy poco se conoce acerca de las toxinas que participan en la patogénesis de la enfermedad. El presente estudio reporta resultados de análisis moleculares de 47 cepas de C. perfringens aislados de casos mortales de enterotoxemia en alpacas, basados en la amplificación de los genes cpa, cpb, etx y iap codificantes de las toxinas α, β, g, e Ǯ (genotipificación), así como la detección de genes secundarios codificantes de la enterotoxina (cpe) y toxina β2 (subtipificación). El ADN bacteriano de las 47 cepas fue sometido a prueba de PCR múltiple evidenciando que 46/47 (97.9%) de los aislamientos correspondieron al genotipo A y de estos, 13/46 (28.3%) contenían adicionalmente el gen β2 (subtipo cpe-vocpb2+vo), mientras que las restantes 33 muestras (71.7%) fueron negativas para ambos genes secundarios (subtipo cpe-vocpb2-vo). Solo una de las 47 (2.1%) muestras correspondió al genotipo C y positivo al gen CPE (subtipo cpe+vocpb2-vo). Estos resultados sugieren la posible participación de la toxina alfa y beta2 en los casos de enterotoxemia de las alpacas, pero excluyen a la enterotoxina.

Palabras clave: Clostridium perfringens, genotipificación, enterotoxemia, alpacas


ABSTRACT

Although enterotoxemia produced by Clostridium perfringens causes elevated neonatal mortality in the alpaca, scarce information exists on the virulence factors (toxins) which play an important role in the pathogenesis of the disease. The objective of this study was to genotype and subtype C. perfringens isolates from enterotoxemia induced mortalities based on the presence of genes cpa, cpb, etx and iap which encode the toxins α, β, g, and Ǯ, and the genes cpe and cpb2 which encode the enterotoxin (cpe) and β2- toxins, respectively. A total of 47 C. perfringens isolates were obtained from the small intestine of neonatal alpaca mortalities which presented clinical signs, as well as gross and histological injuries typical of enterotoxemia. The results showed that 46/47 (97.9%) of the isolates were genotype A, 13 of these 46 (28.3%) also had cpb2 (genotype A, subtype cpe-cpb2+), while the remaining 33 (71.3%) were negative for both cpe and cpb2 genes (genotype A, subtype cpe-cpb2 -) and only 1/47 (2.1%) had the cpa, cpb y cpe genes (genotype C, subtype cpe+cpb2-). The results indicate that both the alpha and beta2 toxins likely play an important role in enterotoxemia aetiology, but excluded participation of the enterotoxin.

Key words: Clostridium perfringens, genotyping, enterotoxemia, alpacas


INTRODUCCIÓN

La enterotoxemia en el Perú es la principal enfermedad infecciosa que afecta a las alpacas (Vicugna pacos) neonatas. Moro (1966) la describió por primera vez, mencionando al Clostridium perfringens, principalmente del tipo A, y en algunos casos al tipo C, como el agente causal. La enfermedad tiene un comportamiento epizoótico, alcanzando tasas de mortalidad neonatal de 50% en varios centros de crianza alpaquera del sur del Perú (Carbajal, 1974; Ramírez et al., 1985; Ameghino y DeMartini, 1991). El cuadro clínico corresponde a una toxemia, generalmente de curso fatal (Ramírez et al., 1985; Moro, 1987), causando una severa enteritis hemorrágica o necrótica (Ameghino y DeMartini, 1991; Palacios, 2004).

Se tiene un conocimiento limitado sobre las toxinas de C. perfringens participantes en la patogenia de la enfermedad. Ramírez (1987) identificó cepas C. perfringens tipo A de casos típicos con capacidad de producir una enterotoxina (CPE), que lo condujo a proponer el posible rol patogénico de la CPE. Algunas de esas cepas, inoculadas en llamas, fueron capaces de inducir acumulaciones de fluido intestinal, responsabilizando a la CPE de los cambios observados. Esta propuesta ha sido contrastada por otros investigadores, quienes sugirieron principalmente la participación de las exotoxinas (Fowler, 1998; Prehn et al., 1999) y, tal vez, la presencia de una toxina secundaria, potencialmente patogénica, la beta2, detectada en algunas cepas aisladas de casos de enterotoxemia en alpacas (Bueschel et al., 2003; Ellis, 2006).

La tipificación del C. perfringens ha dependido, tradicionalmente, de inoculaciones de sobrenadantes bacterianos en animales de laboratorio; sin embargo, la disponibilidad de técnicas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple, que permite detectar de manera simultánea y en una misma reacción, la presencia de genes codificantes de las principales toxinas necesarias para arribar a una genotipificación [genes cpa ( toxina α), cpb (toxina β), etx (toxina g) e iap (toxina Ǯ), incluyendo una subtipificación (gen cpe codificante de la enterotoxina y cpb2 codificante de la toxina β2) (Songer y Meer, 1996; Yoo et al., 1997; Herholz et al., 1999; Baums et al., 2004). Esta técnica es una herramienta de diagnóstico rápida y confiable para determinar genotipos y subtipos de C. perfringens, en contraposición con la seroneutralización evidenciada en letalidad de ratones, técnica invasiva e incapaz de detectar bajos niveles de toxinas o cepas que no producen toxinas in vitro (Petit et al., 1999; Baums et al., 2004).

El presente estudio describe el aislamiento de ADN microbiano de 47 aislamientos de C. perfringens obtenidos de alpacas neonatas muertas por enterotoxemia y sometidos a amplificaciones moleculares con el objetivo de genotipificar y subtipificar usando la técnica de PCR múltiple.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras

Se obtuvieron 47 muestras de intestino de alpacas neonatas con diagnóstico de enterotoxemia en el año 2005. Los animales provenían de cuatro hatos alpaqueros localizados sobre los 3500 msnm en los departamentos de Cusco y Puno. El diagnóstico de la enfermedad se hizo de acuerdo a características epidemiológicas, signos clínicos, lesiones anatomopatológicas e histopatológicas. Las muestras consistieron en segmentos de intestino delgado afectado y ligado en sus extremos para ser transportadas a la Unidad de Biología Molecular y Genética (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos), Lima, en bolsas con tetraborato de sodio como preservante.

Aislamiento e Identificación de C. perfringens

Las muestras fueron cultivadas en caldo tioglicolato e incubadas a 45 ºC por 48 h en ambiente de anaerobiosis. Luego se tomaron alícuotas del medio para ser sembradas en agar sangre e incubadas bajo las mismas condiciones. Las colonias de C. perfringens fueron identificadas en base a características morfológicas de la colonia, patrón hemolítico, coloración Gram y reacción negativa a la catalasa. Estos aislados fueron luego sembrados en agar yema de huevo e incubadas a 37 ºC durante 18-24 h bajo anaerobiosis para evidenciar la reacción de Nagler. Finalmente, los aislados positivos fueron reactivados en caldo tioglicolato y conservados a -20 ºC para los análisis moleculares.

Extracción de ADN Bacteriano

Para la extracción de ADN bacteriano se utilizó 5 ml de cultivo en caldo tioglicolato. Se les centrifugó a 13000 rpm por 10 min, y el precipitado fue re-suspendido en 800 μl de EDTA 50 mM más 200 μl de lisozima. Se mezcló suavemente, se incubó a baño maría a 37 ºC durante 1-2 h y se centrifugó a 13000 rpm por 10 min. El precipitado resultante fue utilizado para la extracción de ADN con el kit comercial “DNA Purification Kit” (Promega, Madison, USA), siguiendo las indicaciones del fabricante. El ADN extraído fue almacenado a -20 ºC.

PCR Múltiple

Para determinar los genotipos y subtipos de los aislados de C. perfringens, se utilizó la técnica de PCR múltiple descrita por Baums et al. (2004) con algunas modificaciones: la mezcla de PCR múltiple consistió en 15 μM de los cebadores CPA5L y CPA5R, 9 μM de los cebadores CPBL y CPBR, 5.3 μM de los cebadores CPEL y CPER, 7.5 μM de los cebadores CPETXL y CPETXR, 7.5 μM de los cebadores CPIL y CPIR, 9 μM de los cebadores CPB2L y CPB2L, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris•Cl (pH 8.3), 1.5 mM de MgCl2, 250 μM de cada dNTP, 3.8 U de Taq polimerasa (Promega, Madison, USA) y 50 ng de ADN bacteriano. La amplificación se hizo en un termociclador 2720 (Applied Biosystems) a través de una desnaturalización inicial de 4 min a 95 ºC, 35 ciclos de 1 min a 95 ºC, 1 min a 55 ºC y 1.5 min a 72 ºC, y finalmente una etapa de extensión de 7 min a 72 ºC. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer TBE 0.5X y teñidos con bromuro de etidio. Las bandas amplificadas fueron visualizadas y fotografiadas bajo iluminación UV. Para la estandarización de la técnica se utilizaron como controles positivos cepas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT): C. perfringens tipo A (CECT 563) y C. perfringens tipo C (CECT 820), mientras que C. septicum y C. chauvoei sirvieron como controles negativos.

Genotipificación y Subtipificación

La genotipificación de C. perfringens (tipos A, B, C, D, y E) se realizó en base a la presencia de los genes cpa, cpb, etx e iap, según la clasificación establecida por Petit et al. (1999). La subtipificación se realizó detectando la presencia de los genes cpe y cpb2, según lo descrito por Garmory et al. (2000).

 

 

RESULTADOS

Se logró aislar C. perfringens en las 47 muestras intestinales de crías muertas por enterotoxemia. Todos los aislados fueron positivos a la tinción Gram, presentaron una doble hemólisis, fueron catalasa negativa y, mayoritariamente (42/47), fueron positivas a la Reacción de Nagler.

Los resultados obtenidos por la PCR múltiple de las cepas de referencia de C. perfringens tipo A y C amplificaron genes correspondieron a los tipos A y C, respectivamente, mientras que las cepas de C. chauvoei y C. septicum no evidenciaron amplicones similares (Cuadro 1). La amplificación genética determinó que el 97.9% (46/47) de los aislamientos de C. perfringens fueron del genotipo A y el restante (2.1%) correspondió al genotipo C. El 71.7% (33/46) de los aislamientos de C. perfringens con genotipo A que no tenían los genes secundarios cpe y β2 correspon- dieron al subtipo cpe-vocpb2-vo y el 28.3% (13/ 46) restante correspondió al subtipo cpevocpb2+ vo (presencia del gen cpb2). El único C. perfringens genotipo C aislado presentó el gen de la enterotoxina (subtipo cpe+vocpb2- vo) (Cuadro 2).

DISCUSIÓN

La técnica de PCR múltiple permitió la geno y subtipificación de los 47 aislados de C. perfringens obtenidos de casos confirmados de enterotoxemia en neonatos de alpacas, evidenciando ser una herramienta de diagnóstico rápida y confiable (Petit et al., 1999; Baums et al., 2004), contrastando con el método de tipificación clásico de la prueba de seroneutralización in vivo, basada en la letalidad de ratones o por dermato-necrosis en cobayos. Estas ventajas han permitido a la PCR múltiple ser empleada en forma exitosa en este estudio y por otros investigadores interesados en elucidar la participación de las toxinas de C. perfringens en procesos entéricos en lechones (Kanakaraj et al., 1998; Garmory et al., 2000; Waters et al., 2003), enteritis necrótica en pollos (Engstrom et al., 2003; Gholamiandekhordi et al., 2005), enterotoxemia en corderos (Gkiourtzidis et al., 2001; Kalender et al., 2005), enterotoxemia en ciervos (Embury-Hyatt et al., 2005), tiflocolitis en caballos (Herholz et al., 1999) y en intoxicación de origen alimentaria en humanos y diarreas asociadas a antibióticos en humanos (Sparks et al., 2001).

El 97.9% de los aislamientos correspondieron al genotipo A, concordando con otros resultados (Moro, 1987; Ramírez, 1987), quienes mediante la seroneutralización determinaron al tipo A del C. perfringens como el principal agente causal de la enterotoxemia en alpacas. Los aislados pertenecientes al genotipo A y de acuerdo a la presencia de genes secundarios fueron agrupados en subtipos, siguiendo la clasificación propuesta por Garmory et al. (2000), determinando que el 71.7% fueron del subtipo cpe-vocpb2-vo, es decir, cepas incapaces de producir enterotoxina o toxina β2, mientras que los 13 restantes correspondieron al subtipo cpevocpb2+ vo, con sólo la capacidad de producir la toxina β2.

En ninguno de los 46/47 aislados se logró amplificar el gen cpe productor de enterotoxina, sugiriendo que la enterotoxina de C. perfringens no participaría en el desarrollo de la enterotoxemia de las alpacas. Estos resultados son similares a otros estudios donde no se detectó la presencia del gen cpe en aislamientos de C. perfringens provenientes de alpacas con problemas entéricos (Garmory et al., 2000; Bueschel et al., 2003; Baums et al., 2004; Ellis, 2006), e incluso asociados a casos de muertes súbitas (Sawires y Songer, 2006). La ausencia del gen cpe también ha sido demostrado en reportes de casos de enterotoxemia de terneros, cabras, venados y corderos (Manteca et al., 2002; Dray, 2004; Embury-Hyatt et al., 2005; Kalender et al., 2005), así como en cuadros descritos como disentería hemorrágica en corderos (Gkiourtzidis et al., 2001), enteritis necrótica en pollos (Engstrom et al., 2003; Gholamiandekhordi et al., 2005), enteritis necrótica en lechones (Kanakaraj et al., 1998; Garmory et al., 2000, Waters et al., 2003) y tiflocolítis en caballos (Herholz et al., 1999). La ausencia del gen cpe llama enormemente la atención, pues la enterotoxina fue siempre considerada como el principal factor de virulencia del C. perfringens en la patogénesis de la enterotoxemia en las alpacas (Ramírez, 1987), pese a que no se descartaron en dichos estudios la presencia de otras toxinas (toxinas y β2).

Por otro lado, el efecto patogénico de la enterotoxina no encaja con los cuadros de enterotoxemia descritos en alpacas, pues la producción de esta toxina está frecuentemente asociada a problemas de intoxicación alimentaria que ocasionan diarreas profusas, esporádicas y autolimitantes en individuos inmunocompetentes (McClane, 2000; Sparks et al., 2001). Los casos clásicos de enterotoxemia en alpacas raramente se observan o se asocian con diarreas y cuando ocurren son generalmente a consecuencia de infecciones mixtas por E. coli (Ameghino y DeMartini, 1991).

La alta frecuencia de C. perfringens genotipo A subtipo cpe-vo y cpb2-vo (71.7%) tiende a señalar que solamente la presencia del gen cpa y su expresión (toxina α) sería suficiente para la producción de la enfermedad. Similares resultados fueron encontrados en estudios de geno y subtificación de C. perfringens aislados de casos de enteritis necrótica en pollos y en cerdos (Kanakaraj et al., 1998; Engstrom et al., 2003; Gholamiandekhordi et al., 2005; Kalender y Ertas, 2005), enterotoxemia en corderos y terneros (Songer, 1996; Dennison et al., 2005; Kalender et al., 2005) y gastroenteritis hemorrágica en perros (Songer, 1996).

Este trabajo reporta por primera vez en el Perú la presencia de C. perfringens genotipo A subtipo β2-toxigénico aislados de casos de enterotoxemia de alpacas, evidenciando la posible participación de esta toxina en la etiopatogénesis de la enfermedad. Similares hallazgos han sido reportados por otros investigadores, quienes detectaron la presencia del gen cpb2 en 18.6% (8/43) de los C. perfringens aislados de alpacas con problemas entéricos (Bueschel et al., 2003).

La presencia del gen cpb2 ha sido asociada con problemas entéricos en varias especies; por ejemplo, cerca del 90% de C. perfringens β2 aislados en lechones se encuentran asociados con enteritis necrótica, mientras que en aislamientos de cerdos clínicamente sanos el gen cpb2 no está presente o no ha sido detectado (Garmory et al., 2000; Bueschel et al., 2003). Similarmente, se reporta que el 50 a 75% de los aislamientos de C. perfringens β2 de casos de tiflocolitis en potros (Herholz et al., 1999; Garmory et al., 2000), así como en cuadros de enterotoxemia en terneros, cabras y venados (Manteca et al., 2002; Dray, 2004; Embury-Hyatt et al., 2005) y disentería hemorrágica en corderos (Gkiourtzidis et al., 2001) demuestran una posible asociación patológica con cepas cpb2 positivas.

En el presente estudio, se aisló solamente una cepa (2.1%) perteneciente al genotipo C, corroborando la eventualidad de su presencia en casos patológicos (Moro, 1987). Curiosamente, este genotipo fue también el único subtipo enterotoxigénico (cpe+vocpb2-vo). No se lograron aislar los genotipos B ni D como los descritos en Chile (Prehn et al., 1999) y en EEUU (Fowler, 1998), respectivamente.

CONCLUSIONES

  • El C. perfringens genotipo A y subtipo cpe-vocpb2-vo (no enterotoxigénico ni β2- toxigénico) es el genotipo y subtipo más prevalente en casos de enterotoxemia en alpacas.

  • Se reporta por primera vez en el Perú, la presencia del gen cpb2 y la casi ausencia del gen codificante de la enterotoxina.

  • Los resultados apuntan básicamente a la toxina a y, posiblemente, a la toxina b2 como los principales factores de virulencia asociados en la enterotoxemia de las alpacas.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los médicos veterinarios y criadores que participaron en la toma de muestras en los hatos alpaqueros localizados en la zona sur del Perú. El estudio fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología e Innovación (CONCYTEC) (Desarrollo de vacunas de nueva generación para prevenir enterotoxemia en alpacas), el Consejo Superior de Investigaciones de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (CSIUNMSM), INCAGRO (Identificación y selección de marcadores moleculares de resistencia genética a enterotoxemia y neumonía en crías de alpacas) y CONOPA – Instituto de Investigación y Desarrollo de Camélidos Sudamericanos.

 

LITERATURA CITADA

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