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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versión impresa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.24 no.3 Lima ago. 2013

 

Identificación y caracterización molecular de cepas nativas de lactobacillus aisladas de material de cama de pollos de engorde

Identification and molecular characterization of native strains of lactobacillus isolates from poultry litter

 

Carlos Shiva1,3, Luis M. Jara2

1 Laboratorio de Microbiología,

2 Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Veterinaria y Zootecnia, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

3 E-mail: carlos.shiva@upch.pe


RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue aislar e identificar bacterias del género Lactobacillus provenientes de material de cama de 1 a 3 usos con bajos registros de amoniaco de granjas de pollos de engorde. Se evaluó la resistencia a condiciones de pH 5 y 8, así como la capacidad de inhibición sobre bacterias con actividad ureasa (Staphylococcus spp y Pseudomona spp) aisladas a partir de material de cama. Se aislaron 73 colonias consideradas como sospechosas de Lactobacillus a partir de siembra en medios selectivos y patrones morfológicos. Mediante tinción de Gram y prueba de catalasa se comprobó que 19 cepas correspondieron al género Lactobacillus y con PCR se encontró que el 53% correspondió a L. reuteri, el 32% a L. plantarum, el 10% a L. vaginalis y el 5% a L. salivarius. Todas las cepas sobrevivieron a condiciones de pH 5 y 8 y todas produjeron algún tipo de biocina activa contra Staphylococcus spp o Pseudomonas spp que podrían ser útiles a futuro como aditivo para regular la microbiota en el material de cama.

Palabras clave: Lactobacillus, pollos de engorde, probióticos, aislamiento, amoníaco


ABSTRACT

The aim of this study was to isolate and identify bacteria of Lactobacillus genus from poultry litter with 1, 2 or 3 uses and low ammonia records. Resistance for conditions at pH 5 and 8 was evaluated as well as the ability to inhibit activity in urease bacteria (Staphylococcus spp and Pseudomona spp) isolated from poultry litter. Seventy three suspected colonies of Lactobacillus were identified by culture in selective media and morphological patterns. Gram staining and catalase test revealed that only 19 strains were of Lactobacillus genus. Furthermore, through PCR was found that 53% corresponded to L. reuteri, 32% to L. plantarum, 10% to L. vaginalis and 5% to L. salivarius. All isolates survived at conditions of pH 5 and 8 and all strains produced some type of active biocin against Staphylococci spp or Pseudomona spp which might be useful as additive to regulate the microbiota in poultry litter.

Key words: Lactobacillus, broiler, probiotics, isolation, ammonia


INTRODUCCIÓN

El uso de bacterias probióticas ha sido el resultado de búsquedas de alternativas para la mejora del crecimiento de los pollos de engorde, luego de la prohibición del uso de antibióticos como promotores de crecimiento por parte de la Unión Europea (Shiva, 2007). El término probiótico ha sido utilizado para designar a aquellos microorganismos que al ser administrados en el alimento ejercen una acción moduladora sobre la microflora intestinal, mejorando la respuesta inmunitaria y logrando un mejor estado sanitario. Los microorganismos probióticos más representativos son los pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, cuya acción benéfica se atribuye principalmente a la producción de ácidos orgánicos, además de algunas biocinas que inhiben el crecimiento de patógenos como Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium spp y Salmonella spp (Valdés et al., 2005; Parra, 2010).

Se sabe además que el modo de acción de algunas especies de Lactobacillus en aves incluye el mantenimiento normal de la microbiota intestinal por exclusión competitiva y antagonismo, incrementando la actividad digestiva y reduciendo la actividad enzimática microbiana y productora de amonio (Kabir, 2009). Así por ejemplo, cepas de Lactobacillus casei confieren protección contra coccidias, mejorando la ganancia de peso y obteniendo un índice anticoccidial similar al obtenido cuando se utiliza una vacuna comercial contra Eimeria (Bautista et al., 2003). Otras propiedades importantes demostradas in vitro incluyen la reducción de sulfuro y amonio (Naidu, 2002), así como la reducción de compuestos orgánicos volátiles dentro de los galpones (Chang y Chen, 2003), los cuales involucran procesos mediados por bacterias con actividad ureasa capaces de hidrolizar la urea en amoniaco, lo que afecta la integridad respiratoria del ave y disminuye su rendimiento (Rothrock et al., 2010).

Se dispone de escasos estudios sobre caracterización de la población de especies de Lactobacillus nativas en material de cama de aves comerciales. Han sido reportadas especies como L. plantarum, L. delbrueckii, L. agilis y L. salivarius, entre otras (Paço et al., 2003), desconociéndose el rol que cumplen dentro de la comunidad microbiana de la cama.

Los objetivos del presente estudio fueron aislar e identificar las especies nativas de Lactobacillus provenientes de cama de galpones de pollos con registros de bajos niveles de amoníaco, así como evaluar su capacidad de resistencia a diferentes niveles de pH y actividad inhibitoria sobre dos cepas bacterianas con actividad ureasa, con la finalidad de establecer las bases de un producto biológico útil para el control de las poblaciones microbianas involucradas en la producción elevada de amoniaco en granjas de aves comerciales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Lugar de Estudio y Muestras

Se seleccionaron 35 galpones correspondientes a siete planteles comerciales de pollos broiler de la costa central del Perú, comprendidas entre Cerro Azul al sur y Huacho al norte. Las granjas pertenecían al mismo consorcio avícola y los niveles de amoniaco en los galpones era bajo (no mayor a 13 ppm en su record histórico).

Las aves tenían entre 30 y 38 días, de acuerdo a la disponibilidad de ingreso a los planteles. Las camas eran de segundo a cuarto uso. De cada galpón se recolectaron 300 g de material de cama en bolsas estériles. Las muestras se transportaron a 4 °C al laboratorio de la Facultad de Veterinaria y Zootecnia, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, para su procesamiento (Paço et al., 2003).

La medición del nitrógeno en los galpones se hizo con un equipo electrónico portátil a la altura del pico de las aves, semanalmente y a una misma hora durante cada campaña de crianza, realizado por el encargado de cada granja.

Identificación Microbiológica

Se colocó 5 g de material de cama en 40 ml de caldo MRS y se incubó a 37 °C por 24 h. Luego, se traspasó hacia el medio MRS suplementado con ácido acético (1.32 ml/L) a través de una siembra por agotamiento. Las placas se incubaron en anaerobiosis por 48 h.

Las colonias resultantes se consideraron como sospechosas de Lactobacillus si eran blanquecinas y pequeñas, Gram positivas, catalasa negativa y morfología bacilar no esporuladas. Las cepas fueron conservadas en alícuotas en crioviales con caldo MRS y glicerol al 20%.

Identificación Molecular

Se procedió con la extracción del ADN genómico de cada cepa de acuerdo a las indicaciones del kit comercial Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen®, EEUU). El espacio intergénico 16S-23S se amplificó mediante la técnica de PCR, utilizando los cebadores y condiciones descritas por Dubernet et al. (2002) para la identificación molecular de Lactobacillus a nivel de género. Asimismo, para la identificación a nivel de especie se utilizaron los cebadores y protocolos descritos por Song et al. (2000) y Berthier y Ehrlich (1998) para la técnica de PCR múltiple, usando como controles a cepas comerciales de L. plantarum ATCC 8014, L. delbrueckii ATCC 7830, L. acidophilus ATCC 4356 y L. reuteri Protetics BioGaia®.

Crecimiento según pH

Por evaluar la resistencia y crecimiento a diferentes niveles de pH de las cepas seleccionadas, el medio MRS se ajustó a pH 5 y pH 8 mediante adición de ácido clorhídrico 0.1 N e hidróxido de sodio 0.1 N, respectivamente. La concentración de las cepas fue ajustada a escala 2 de McFarland y 20 µl de la suspensión fue inoculada en 200 µl de medio MRS líquido ajustado al pH requerido en pocillos de fondo plano de placas para ELISA (por triplicado). El crecimiento bacteriano fue medido en un espectrofotómetro para microplacas a una densidad óptica (OD) de 620 nm a las 0 y 24 h de la incubación, y el resultado fue comparado con un estándar del caldo MRS sin Lactobacillus (Weesel et al., 2004).

Los resultados se expresaron como índice de crecimiento bacteriano (ICB). Para esto, se midió la OD a las 0 h de inoculado y se dividió entre la OD del mismo pocillo transcurridas 24 h. Asimismo, el ICB se midió en una escala de 0 a 1, considerándose las cepas bacterianas con mejor ICB a aquellas con los valores numéricos más bajos.

Actividad Inhibitoria

Para la medición de la actividad inhibitoria frente a patógenos se utilizó el método de difusión en agar según Hechard et al. (1990). Una cepa de Staphylococcus spp y otra de Pseudomonas spp, ambas con actividad ureasa provenientes del material de cama de uno de los planteles en estudio, fueron aisladas e identificadas de acuerdo a protocolos estándar de laboratorio de microbiología (Win et al., 2008).

Se preparó una suspensión a escala 0.5 de Mcfarland de ambas cepas y se sembraron en placas de agar tripticasa de soya (TSA) en tres direcciones; se dejaron secar por 5 min y se depositó en su superficie cuatro porciones de agar MRS de 2 cm de diámetro conteniendo cuatro cepas diferentes de Lactobacillus a evaluar. Se incubó a 37 °C y las lecturas se hicieron a las 24 y 48 h. Los resultados se expresaron en radio de inhibición, medido en centímetros, que fue la medida formada alrededor de la porción de agar con la cepa de Lactobacillus sembrada.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se encontraron 73 cepas sospechosas y 19 fueron confirmadas a nivel molecular como integrantes del género Lactobacillus. De estas, el 53% correspondió a L. reuteri, el 32% a L. plantarum, el 10% a L. vaginalis y el 5% a L. salivarius. Las cepas fueron identificadas a nivel de especie mediante la técnica de PCR múltiple, a diferencia del empleo de métodos bioquímicos, en donde el patrón fenotípico resultante puede ser similar entre dos especies genéticamente diferentes, como se demostró en el estudio de Teanpaisan y Dahlén (2006), donde L. salivarius y L. acidophilus fueron identificados como L. fermentum.

L. plantarum ha sido encontrada en el suelo de granjas de pollos en Senegal (Ibourahema et al., 2008). Asimismo, las demás especies han sido reportadas en Brasil (Paço et al., 2003), a excepción de L. vaginalis que fue identificado en dos cepas en el presente estudio. Esta especie se le encuentra usualmente en el tracto genital de las mujeres (Vásquez et al., 2002), aunque también ha sido aislada del tracto gastrointestinal de pollos broiler (Stephenson et al., 2009), pero se desconoce su importancia dentro de la flora microbiana endógena del intestino y su aplicación como probiótico en aves comerciales.

Los aislados a partir de material de cama sugieren que dichas especies se encuentran colonizando de forma activa el tracto intestinal en las aves. L. salivarius ha sido identificada a partir de íleon y ciego de pollos de engorde (Rondón et al., 2008) y L. salivarius y L. reuteri en muestras de cloaca (Cauwerts et al., 2006). Igualmente, L. crispatus, L. salivarius, L. reuteri y L. johnsonii han sido recientemente encontradas en intestino y ciego de broilers (Majidzadeh et al., 2011), lo que demuestra que más de una especie puede ser aislada de las excretas, pudiendo además ser un indicativo de la microbiota gastrointestinal en condiciones normales.

Factores como la dieta, temperatura, pH, reutilización de material de cama, y la localización en intestino determinan la presentación de determinadas especies de Lactobacillus en aves (Paço et al., 2003); por ejemplo, en íleon se han reportado otras especies mesofílicas como L. colehominis, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonnii y L. mucosae, donde además, L. crispatus y L. salivarius se encontraron mayoritariamente en pollos orgánicos mientras que L. salivarius y L. johnsonii prevalecieron en aves convencionales (Bjerrum et al., 2006). De igual forma, L. acidophilus ha sido aislada de heces de broilers (Lee et al., 2008) y del buche, íleon y ciego (Guan et al., 2005) y la especie termotolerante L. thermotolerans ha sido aislada de heces (Niamsup et al., 2003). Asimismo, otros estudios indican que la composición endógena de Lactobacillus y otras bacterias en intestino está más influenciada por el medio ambiente que por la genética del organismo hospedador (de Waard et al., 2002), incluyendo además la edad y el material de elección para la cama (Torok et al., 2007); lo que explicaría la diversidad de especies de Lactobacillus que pueden ser aisladas en aves vivas o a partir de cama.

 

Las cepas de Lactobacillus con mayor crecimiento, luego de 24 horas a niveles de pH 5, correspondieron a L. salivarius (cepa #30) y L. reuteri (cepa #3), mientras que a pH 8 fue L. reuteri (cepas #3, 12 y 13) (Cuadro 1). Los diferentes ICB registrados en las cepas aisladas sugieren que la adaptabilidad a diversos niveles de pH está modulada por factores de crecimiento propios de cada cepa.

Recientemente se ha sugerido que las proteínas de superficie de ciertas cepas de Lactobacillus estarían asociadas al crecimiento y supervivencia a niveles de pH bajo (Hossein et al., 2010).

Todas las cepas presentaron actividad inhibitoria frente a Staphylococcus spp luego de 24 h, pero solo el 63% a las 48 h. Asimismo, el 68% de las cepas presentó actividad inhibitoria frente a Pseudomonas spp a las 24 h y el 26% a las 48 h (Cuadro 2). Además, solo las cepas 15 y 30 no mostraron reducción del halo inhibitorio entre las 24 y 48 h de incubación frente a Staphylococcus spp y Pseudomonas spp, respectivamente.

 

Las bacterias ácido lácticas producen biocinas extracelulares con actividad bactericida o bacteriostática, las cuales desestabilizan la membrana citoplasmática bacteriana y alteran su permeabilidad (Nithya et al., 2012). Además, producen ácidos orgánicos, diacetil y enzimas inhibitorias, los cuales en conjunto tienen actividad antagónica contra la microflora competitiva e inhiben su crecimiento (Mohankumar, 2011). La secreción de biocinas alcanza su mayor producción durante la fase de crecimiento exponencial (Sumathi y Reetha, 2012), de allí que la reducción de la actividad inhibitoria en algunas cepas del presente estudio podría explicarse por el tiempo transcurrido (48 horas) coincidente con la fase estacionaria.

La variación del grado de inhibición entre cepas aisladas frente a los dos patógenos evaluados demanda estudios adicionales con la finalidad de aislar, purificar y caracterizar los compuestos activos con actividad antimicrobiana presentes en las cepas que mostraron mayor actividad inhibitoria in vitro. La capacidad productora de bacteriocinas de L. salivarius aislado de ciego de pollos ha sido demostrada frente a especies de Campylobacter (Messaoudi et al., 2011). En forma similar, una bacteriocina de la cepa L. plantarum F12 contra Listeria monocytogenes (Sifour et al., 2012) y la cepa TN627 contra Staphylococcus aureus y Salmonella enterica (Bejar et al., 2011). Así también, la reuterina proveniente de L. reuteri en concentraciones cercanas a los 30 µg/ml ha resultado útil como antimicrobiano contra patógenos entéricos como Salmonella y Campylobacter (Edens, 2003), lo que posibilita además una alternativa para la reducción de la diseminación de bacterias zoonóticas asociadas a alimentos.

CONCLUSIONES

Se obtuvieron 19 cepas nativas del género Lactobacillus de material de cama de broilers con bajo nivel de amoniaco, correspondiendo a las especies L. reuteri, L. plantarum, L. vaginalis y L. salivarius.

Agradecimientos

El presente estudio fue realizado gracias al financiamiento del Proyecto 123- FINCyT-PITEI-2010. Los autores expresan su agradecimiento al Dr. Giuseppe Blaiotta por las facilidades técnicas para la confirmación de la identificación de las cepas de Lactobacillus.

 

LITERATURA CITADA

1. Bautista C, Arriola M, Trejo L, Ixta O, Rojas E. 2003. Comparación entre el efecto de Lactobacillus casei y el de una vacuna comercial en pollos contra la coccidiosis. Tec Pec Mex 41: 317-327.

2. Bejar W, Farhat-Khemakhem A, Smaoui S, Makni M, Farhat M, Abdelmalek B, et al. 2011. Selection of Lactobacillus plantarum TN627 as a new probiotic candidate based on in vitro functional properties. BBE 16: 1115-1123.

3. Berthier F, Ehrlich S. 1998. Rapid species identification within two groups of closely related lactobacilli using PCR primers that target the 16S/23S rRNA spacer region. FEMS Microbiol Lett 161: 97-106.

4. Bjerrum L, Engberg R, Leser T, Jensen B, Finster K, Pedersen K. 2006. Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques. Poultry Sci 85: 1151-1164.

5. Cauwerts K, Pasmans F, Devriese L, Martel A, Haesebrouck F, Decostere A. 2006. Cloacal Lactobacillus isolates from broilers show high prevalence of resistance towards macrolide and lincosamide antibiotics. Avian Pathol 35: 160-164.

6. Chang M, Chen T. 2003. Reduction of broiler house malodor by direct feeding of a Lactobacilli containing probiotic. Int J Poultry Sci 5: 313-317.

7. de Waard R, Snel J, Bokken G, Tan P, Schut F, Huis In’t Veld J. 2002. Comparison of faecal Lactobacillus populations in experimental animals from different breeding facilities and possible consequences for probiotic studies. Lett Appl Microbiol 34: 105-109.

8. Dubernet S, Desmasures N, Guéguen M. 2002. A PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level. FEMS Microbiol Lett 214: 271-275.

9. Edens F. 2003. An alternative for antibiotic use in poultry: probiotics. Rev Bras Cienc Avic 5: 75-97.

10. Guan L, Hagen K, Grayson T, Tannock G, Korver D, Fasenko G, Allison G. 2005. Detection of Lactobacillus acidophilus species in the gut of chickens. In: Proc XVII Australian Poultry Science Symposium. Sydney.

11. Hechard Y, Dherbomez M, Cenatiempo Y, Letellier F. 1990. Antagonism of lactic acid bacteria from goat’s milk against pathogenic strains assessed by the ‘sandwich method’. Lett Appl Microbiol 11: 185-188.

12. Hossein N, Stenzel D, Britz M. 2010. Effect of growth at low pH on the cell surface properties of a typical strain of Lactobacillus casei group. Iran J Microbiol 2: 144-151.

13. Ibourahema C, Dauphin R, Jacqueline D, Thonart P. 2008. Characterization of lactic acid bacteria isolated from poultry farms in Senegal. Afr J Biotechnol 7: 2006-2012.

14. Kabir S. 2009. The role of probiotics in the poultry industry. Int J Mol Sci 10: 3531-3546.

15. Lee N, Yun C, Kim S, Chang H, Kang C, Paik H. 2008. Screening of Lactobacilli derived from chicken feces and partial characterization of Lactobacillus acidophilus A12 as an animal probiotics. J Microbiol Biotechnol 18: 338- 342.

16. Majidzadeh Heravi R, Kermanshahi H, Sankian M, Nassiri MR, Heravi Moussavi A, Roozbeh Nasiraii L, Varasteh AR. 2011. Screening of lactobacilli bacteria isolated from gastrointestinal tract of broiler chickens for their use as probiotic. Afr J Microbiol Res 5: 1858-1868.

17. Messaoudi S, Kergourlay G, Rossero A, Ferchichi M, Prévost H, Drider D, et al. 2011. Identification of lactobacilli residing in chicken ceca with antagonism against Campylobacter. Int Microbiol 14: 103-110.

18. Mohankumar A. 2011. Characterization and antibacterial activity of bacteriocin producing Lactobacillus isolated from raw cattle milk sample. Int J Biol 3: 128-143.

19. Naidu AS, Xie X, Leumer DA, Harrison S, Burrill MJ, Fonda EA. 2002. Reduction of sulfide, ammonia compounds, and adhesion properties of Lactobacillus casei strain KE99 in vitro. Curr Microbiol 44: 196-205.

20. Niamsup P, Sujaya I, Tanaka M, Sone T, Hanada S, Kamagata Y, et al. 2003. Lactobacillus thermotolerans sp. nov., a novel thermotolerant species isolated from chicken faeces. Int J Syst Evol Microbiol 53: 263-268.

21. Nithya K, Senbagam D, Senthilkumar B, Udhayashree N, Gurusamy R. 2012. Characterization of bacteriocin producing lactic acid bacteria and its application as a food preservative. Afr J Microbiol Res 6: 1138-1146.

22. Paço R, Leme I, Bottino J, Piantino A. 2003. Identification of Lactobacillus spp from broiler litter in Brazil. Braz J Microbiol 34: 236-237.

23. Parra R. 2010. Bacterias ácido lácticas: papel funcional en los alimentos. Rev Bio Agro 8: 93-105.

24. Rondón AJ, Samaniego LM, Bocourt R, Rodriguez S, Milián G, Ranilla MJ, et al. 2008. Aislamiento, identificación y caracterización parcial de las propiedades probióticas de cepas de Lactobacillus sp procedentes del tracto gastrointestinal de pollos de ceba. Cienc Tecnol Aliment 6: 56-63.

25. Rothrock MJ Jr, Cook K, Warren J, Eiteman M, Sistani K. 2010. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. J Environ Qual 39: 1848- 1857.

26. Shiva CM. 2007. Estudio de la actividad antimicrobiana de extractos naturales y ácidos orgánicos. Posible alternativa a los antibióticos promotores de crecimiento. Tesis Doctoral. España: Universidad Autónoma de Barcelona. 173 p.

27. Sifour M, Tayeb I, Haddar H, Namous H, Aissaoui S. 2012. Production and characterization of bacteriocin of Lactobacillus plantarum F12 with inhibitory activity against Listeria monocytogenes. TOJSAT 2: 55-61.

28. Song Y, Kato N, Liu C, Matsumiya Y, Kato H, Watanabe K. 2000. Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S-23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA. FEMS Microbiol Lett 187: 167-173.

29. Stephenson D, Moore R, Allison G. 2009. Comparison and utilization of repetitive-element PCR techniques for typing Lactobacillus isolates from the chicken gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 21: 6764-6776.

30. Sumathi V, Reetha D. 2012. Effect of storage time and temperature for maximum bacteriocin production by lactic acid bacteria. IJPBA 3: 831-834.

31. Teanpaisan R, Dahlén G. 2006. Use of polymerase chain reaction techniques and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for differentiation of oral Lactobacillus species. Oral Microbiol Immunol 21: 79-83.

32. Torok V, Ophel-Keller K, Hughes R, Forder R, Ali M, Macalpine R. 2007. Environment and age: impact on poultry gut microflora. In: Proc XIX Australian Poultry Science Symposium. New South Wales.

33. Vásquez A, Jakobsson T, Ahrné S, Forsum U, Molin G. 2002. Vaginal Lactobacillus flora of healthy Swedish women J Clin Microbiol 40: 2746-2749.

34. Weesel JS, Anderson ME, Lowe A, Penno R, Da Costa TM, Button L, Goth KC. 2004. Screening of the equine intestinal microflora for potential probiotic organisms. Equine Vet J 36: 351-355.

35. Win W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P, Woods G. 2008. Koneman, diagnóstico microbiológico: texto atlas y en color. 6° ed. Buenos Aires: Médica Panamericana. 1475 p.

 

Recibido: 23 de noviembre de 2012

Aceptado para publicación: 15 de abril de 2013