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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

Print version ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.25 no.2 Lima Apr. 2014

 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

Variabilidad genética de cepas de Gallibacterium anatis aisladas de aves comerciales del Perú con infecciones respiratorias

Genetic variability of Gallibacterium anatis strains isolated from Peruvian commercial birds with respiratory infections

 

Karina Mendoza A.1,3, Amparo I. Zavaleta2, Ysabel Koga1, Jorge Rodríguez B.1, Arnaldo Alvarado S.1, Robert Tinoco R.1

1 Bioservice SRL, Lima

2 Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima

3 E-mail: karina604@hotmail.com


RESUMEN

El propósito del estudio fue determinar la variabilidad genética de 96 cepas de Gallibacterium anatis aisladas de aves comerciales con sintomatología respiratoria, provenientes de Arequipa (2), Ica (3), La Libertad (27), Lima (62), Madre de Dios (1) y Ucayali(1), yrecolectadasdesdeel 2007 al 2011. Las cepas setipificaron mediantepruebas de fermentación de carbohidratos y sensibilidad a nueve antimicrobianos. La variabilidad genética de las cepas de G. anatis se determinó mediante ERIC-PCR, previa identificación por PCR usando cebadores específicos. Del análisis de fermentación de carbohidratos se obtuvieron perfiles que correspondieron a 10 biovares, todos los cualesseencontraron en Lima yel 45.8% delascepas pertenecieron albiovar 4. Con respecto a la sensibilidad antimicrobiana, el 40.8% de las cepas fueron resistentes a todos los antimicrobianosestudiados,en tantoqueel94.8 y95.8% fueron resistentesaenrofloxacina yciprofloxacina. Por ERIC-PCRseobtuvieron 24 perfilesdeADNno asociados con los biovares, lo cual indica la existencia de variabilidad genética intraespecífica en cepas de G. anatis circulantes en Perú.

Palabras clave: variabilidad genética, Gallibacterium anatis, aves comerciales, ERICPCR, biovares, Perú


ABSTRACT

The purpose of this study was to determine the genetic variability of strains of Gallibacterium anatis isolated in commercial poultry with respiratory symptoms from Arequipa (2), Ica (3), La Libertad (27), Lima (62), Madre de Dios (1) and Ucayali (1), collected from 2007 to 2011. Strains were typified by carbohydrate fermentation tests and sensitivity to nine antimicrobials. The genetic variability of these strains was determined by ERIC-PCR, after identification by PCR using specific primers. The analysis of carbohydrate fermentation profiles corresponded to 10 biovars, all of which were found in Lima and 45.8% of the strains belonged to biovar 4. Concerning antimicrobial susceptibility, 40.8% of strains were resistant to all antimicrobials studied, while 94.8 and 95.8% were resistant to enrofloxacin and ciprofloxacin. By ERIC-PCR 24 DNA profiles associated with biovars were obtained, indicating the existence of intraspecific genetic variabilityin strains of G. anatis circulating in Peru.

Key words: genetic variability, Gallibacterium anatis, commercial poultry, ERIC-PCR, biovar, Peru


INTRODUCCIÓN

En el sector avícola, las enfermedades infecciosas, principalmente las del sistema respiratorio, representan uno de los mayores problemas de sanidad animal con niveles de morbilidad y mortalidad entre10 y 50% (León, 2009).

En aves comerciales, las enfermedades respiratorias se pueden clasificar en virales y bacterianas. Dentro de los agentes virales destacanParamoxovirus, Coronavirus, Herpesvirus, Metapneumovirus y en las bacterianas se describenAvibacterium paragallinarum, Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella multocida, Gallibacterium anatis y Escherichia coli (agente oportunista), entre otras (Vadillo et al., 2002).

Estos agentes infecciosos ocasionan signos clínicos comunes tales como fluido óculo nasal, ojos con aspecto almendrado, conjuntivitis y edema facial e intermandibular o hipertrofia de senos infraorbitarios, los cuales dificultan la identificación del agente patógeno responsable (Bojesen et al., 2004; Bisgaard et al., 2005; Blackall et al., 2005; García-Gómez, 2005; Leon, 2009; García, 2010).

Gallibacterium anatis es un cocobacilo Gram negativo, que se aísla de muestras clínicas de aves con infecciones respiratorias. El mayor número de casos de G. anatis procede de Dinamarca y Alemania (Christensen et al., 2003). En Perú no existe un estudio sistematizado de las cepas y de los biovares circulantes que afectan a las aves comerciales.

El estudio del mapa epidemiológico de G. anatis y de nuevas técnicas diagnósticas para su caracterización puede permitir elaborar programas efectivos de sanidad aviar, en los cuales se consideren cepas endémicas de las principales zonas de producción avícola de Perú. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue determinar la variabilidad genética de cepas de G. anatis aisladas de aves comerciales con infecciones respiratorias.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas

Se utilizaron 96 cepas de G. anatis aisladas de muestras clínicas de pollos de carne (n=38), gallinas de postura (n=37) y reproductoras (n=19), y gallos de pelea (n=2) con enfermedades respiratorias. Los pollos tenían entre 20 a 50 días, las gallinas de postura entre 6 y 50 semanas y las reproductoras entre 13 y 35 semanas. Las muestras fueron recolectadas desde el 2007 al 2011 de granjasdeArequipa (2),Ica (3), La Libertad(27), Lima (62), Madre de Dios (1) y Ucayali (1). Las cepas fueron guardadas en glicerol a -20 ºC y liofilizadas. Además, se utilizaron cepas como control positivo de G. anatis ATCC 542 y como controles negativo de Pasteurella multocida y Ornithobacterium rhinotraquealle.

Cultivo de G. anatis

Las cepas liofilizadas de G. anatis fueron hidratadas con 2 ml de caldo cerebro corazón e incubadas a 37 ºC por 24 h. Después se sembraron en agar sangre de ovino al 5% (utilizando campanas de microaerobiosis) y se incubaron a 37 ºC por 24 a 48 h.

Prueba de Fermentación de Carbohidratos

Se prepararon 100 mL del medio basal conteniendo peptona 1 g, NaCl 0.5 g, púrpura de bromocresol 1% 0.5 ml a pH 6.8, y se autoclavó a 121 °C por 15 min. Paralelamente, se prepararon soluciones acuosas al 20% de cada uno de los siguientes carbohidratos: arabinosa, xilosa, inositol, sorbitol, maltosa, trealosa y dextrina. Las soluciones se esterilizaron por filtración en membranas de acetato de celulosa 0.22 µm y se conservaron en congelación.

Una colonia de cada cepa bacteriana se sembró en 2 mL de caldo nutritivo en las mismas condiciones de cultivo de G. anatis antes descritas. Para cada cepa se utilizaron siete microtubos estériles. A cada uno se le agregó 200 µL del medio basal, 10 µL del carbohidrato a analizar y 10 µL del inóculo. Adicionalmente, se utilizó un microtubo con medio basal sin inóculo. Los microtubos fueron colocados sobre papel toalla humedecido con agua destilada estéril dentro de una bolsaplásticatransparente,yseincubarona37 ºC de 24 a 48 horas. La reacción se consideró positiva si la solución se tornó amarilla y negativa si fue púrpura.

Las cepas de G. anatis se tipificaron en biovariedades de acuerdo al perfil de fermentación de los carbohidratos descrito en el Cuadro 1.

Sensibilidad Antimicrobiana

Se realizó un antibiograma a cada cepa por el método de difusión en agar sangre al 5% usando discos de nueve antimicrobianos: florfenicol 30 µg, fosfomicina 50 µg, amoxicilina 20 µg, ciprofloxacina 5 µg, enrofloxacina 5 µg, doxicilina 30 µg, norfloxacina 10 µg, espectinomicina 100 µg, sulfatrimetropin 1.25/23.75 µg.

Las placas de agar sangre fueron preparadas con el inóculo y los antimicrobianos se incubaron a 37 ºC de 24 a 48 h. Se midió el halo de inhibición del crecimiento alrededor de los discos, asignando la condición de sensible, intermedio o resistente, según NCCLS (National Conmittee for Clinical Laboratory Standards, 1993).

Extracción del ADN Genómico

Las cepas liofilizadas fueron reactivadas con caldo nutritivo y sembradas en agar sangre a 37 ºC por 24 h. El ADN genómico fue extraído utilizando elWizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, EEUU), siguiendo el procedimiento descrito por el fabricante. El ADN extraído se observó por electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TBE (Tris, Borato, EDTA) 0.5X, tiñéndose con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) y observándose en un transiluminador (Biometra UVstar 312 nm,, Alemania) de luz ultravioleta.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Se usaron los cebadores descritos por Bojesen et al. (2007), los cuales fueron diseñados a partir de las secuencias de los genes ribosómicos 16S y 23S de G. anatis.

La mezcla de reacción fue de 20 µl, la cual contenía buffer PCR 1X, 0.2 mM de cada dNTP, MgCl2 1.5 mM, 5 pmol de cada cebador (114R 5´-GGT TTCCCCATTCGG3´ y 133Fgal 5´-TATTCTTTGTTACCACCGG-3´), Ampli Taq 1 U de ADN polimerasa y 30 ng de ADN genómico. La reacción se realizó en un termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Veriti® 96-Well, EEUU) bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 ºC por 5 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 ºC por 30 s, alineación a 55 ºC por 1 min, extensión a 72 ºC por 2 min, y una extensión final a 72 ºC por 10 min.

Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa 1% en buffer TBE 0.5X, tiñéndose con bromuro de etidio (0.5 µg /ml).

Reacción ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus -PCR)

Se empleó una mezcla de reacción de 20 µL, que contenía buffer PCR 1X, 0.2 mM de cada dNTP, MgCl2 3.5 mM, 10 pmol de cada cebador (ERIC1R 5´-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’ y ERIC2 5´AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3´) descritos por Leotta et al. (2006), 2 U de Ampli Taq ADN polimerasa y30 µgdeADN genómico. La reacción se realizó en el termociclador antes indicado bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 ºCpor3min,35ciclosdedesnaturalización a 94 ºC por 30 s, alineación a 40 °C por 3 min, extensión a 72 °C por 2 min, y una extensión final a 72 °C por 7 min.

Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TBE 0.5X. Para la comparación de los tamaños de las bandas se utilizó Ladder 100 bp-Plus (Fermentas, EEUU).

Análisis de Patrones de ADN

Los patrones de ADN obtenidos por ERIC-PCR se analizaron con el programa Biodoc Analyze v2.2 (Biometra). Luego, se transformaron a una matriz bidimensional utilizando el coeficiente de Jaccard y Dice mediante el programa FAMD v1.25 (Schlüter, 2006). La variabilidad genética intraespecífica de las 96 cepas de G. anatis fue analizada con el programa AMOVA en base a una matriz de distancia genética y se generaron dendrogramas de similitud mediante el método UPGMA usando los programas FAMD v1.25 y Mega v5.0 (Tamura et al., 2011).

RESULTADOS

El 28.4 y 64.2% de las cepas de G. anatis aisladas de aves comerciales procedían de los departamentos de La Libertad y Lima, zonas del país con la mayor población de aves comerciales. Asimismo, el 40% de cepas fueron aisladas de pollos de carne y el 38% de gallinas ponedoras (Fig. 1). En agar sangre de ovino, el 80% de las cepas de G. anatis mostraron hemólisis débil y el restante 20% presentó hemólisis intensa, siendo esta última, una característica de cepas que se diseminan a varios órganos.

En la clasificación de las cepas en biovares, mediante el perfil de hidrólisis a azúcares, se observaron 10 biovares, siendo el biovar 4 el de mayor frecuencia con el 46% de las cepas. Además, se encontró un biovar nuevo (NI) que agrupa al 6% (n=6) de cepas de G. anatis y cuya característica fue la fermentación positiva de todos los azúcares analizados (Fig. 2).

En el Cuadro 2 se observa que los 10 biovares de G. anatis están distribuidos en las 62 cepas procedentes de Lima. Además, el biovar 4 se encuentra en cepas de Ica, La Libertad y Arequipa. Por otro lado, el biovar NI está disperso en La Libertad, Lima y Ucayali.

Las 96 cepas fueron confirmadas como G. anatis mediante PCR usando cebadores específicos. Los productos amplificados fueron tres fragmentos de ADN de 1032, 985 y 789 pb. Asimismo, se evidenció que los cebadores hibridan con P. multocida y O. rhinotracheale, especies filogenéticamente relacionadas con G. anatis, pero producen un fragmento de ADN mayor a 1400 pb (Fig. 3).

En el análisis de la variabilidad genética intraespecífica usando la técnica ERIC-PCR se obtuvieron 20 fragmentos de ADN diferentes cuyos tamaños están entre 100 a 1500 pb. El mayor número de fragmentos de ADN polimórficos (11 bandas) se encontró en las cepas de G. anatis pertenecientes al biovar 3; sin embargo, no se encontraron bandas en los biovares 12 y 19. Además, no se observaron bandas específicas para cada biovar, a excepción del biovar 3 (1 banda). Se obtuvieron 24 patrones o perfiles diferenciados de las 96 cepas de G. anatis. La frecuencia (presencia de bandas) por locus en la totalidad de las cepas analizadas varió entre 0.052 y 0.875, lo cual indica variabilidad genética entre los aislados (Figs. 4 y 5).

Del análisis de los perfiles de ADN obtenidos por ERIC-PCR usando una matriz de similitud y el método UPGMA, las 96 cepas de G. anatis se agruparon en 24 patrones indicando la existencia de variabilidad intraespecífica y por lo menos 24 cepas circulantes. Sin embargo, estos agrupamientos no se correlacionan con los biovares (Fig. 5), ni con la zona geográfica.

DISCUSIÓN

En Perú, la avicultura está siendo afectada por una serie de agentes patógenos que producen infecciones, entre ellas las respiratorias de diversa etiología, pero de parecida sintomatología, lo cual dificulta el diagnóstico clínico. Por otro lado, los microorganismos frecuentemente están en proceso de cambio, ya sea por mutaciones debido a su adaptación al medio en que se desarrollan o como consecuencia del intercambio de material genético entre los mismos. Estos cambios exigen el desarrollo y uso de metodologías alternativas a las convencionales que permitan identificar el agente infeccioso en forma oportuna.

Estudios de variabilidad genética de G. anatis han sido descritos en Dinamarca, Bélgica, Checoslovaquia y Alemania (Bojesen et al., 2003a,b,c; Bojesen y Shivaprasad, 2007; Bojesen et al., 2007; Christensen et al., 2003, 2004; Christensen y Bisgaard, 2010), donde se encuentran 24 biovares de G. anatis, y donde la subespecie haemolytica comprende los biovares 1-4, 6, 7, 10-24, la subespecie anatis el biovar Pa, la genomoespecie 1 el biovar 5 y 8, y la genomoespecie 2 el biovar 9. Asimismo, en estos trabajos se aislaron 37 cepas de G. anatis en diversas especies de aves, encontrándose los biovares 1, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 24, Pa y Uc, siendo 15 de ellos, biovariedades hemolíticas, y Pa y Uc no hemolíticos. De estos dos últimos, Pa es el más frecuente, seguido de los biovares hemolíticos 1, 3, 4, 12 y 18.

En el presente estudio se encontraron cepas de G. anatis hemolíticas correspondientes a los biovares 1, 3, 4, 11, 12, 15, 19, 20 y 24, y los más frecuentes fueron el 1, 3, 4 y NI. Estas diferencias podrían deberse a que en el trabajo de Bojensen et al. (2003b) se utilizaron cepas aisladas de más especies de aves y de diferentes países, dando posibilidad a encontrar mayor número de biovariedades. Además, el biovar NI indicaría que es un nuevo grupo de cepas circulantes, las cuales no han sido descritas y quizás sean únicas del Perú. No obstante, debido a las escasas investigaciones, no se puede indicar que estas cepas han estado en circulación o que son de evolución reciente.

Respecto a la sensibilidad antimicrobiana, Bojesen et al. (2003b, 2011) demostraron que cepas de G. anatis presentaban resistencia a >3 antimicrobianos en el 65% de las cepas de campo; y solo dos cepas fueron sensibles a todos los antimicrobianos. Similar característica se observó en el presente estudio donde todas las cepas de G. anatis mostraron multirresistencia y tres fueron resistentes a todos los antimicrobianos estudiados. La resistencia a sulfamida (98%) fue similar a las observaciones de Bojesen et al. (2011). La disminución a la sensibilidad antimicrobiana puede deberse al uso inadecuado de los antimicrobianos, lo cual constituye un riesgo para el control de la bacteria.

La variabilidad genética intraespecífica de G. anatis se realizó mediante ERIC-PCR. Esta es una técnica fácil y de bajo costo que genera perfiles de ADN reproducibles. Esta misma técnica fue utilizada por Leotta et al. (2006) para analizar 49 cepas de P. multocida de diferente origen, subespecie, biotipo, grupo capsular, serotipo somático y perfil de resistencia antimicrobiana. El método de tipificación ERIC-PCR es útil para distinguir los clones estrechamente relacionados, lo que permite el reconocimiento de los linajes clonales patógenos específicos. El método permite un análisis epidemiológico molecular fácilmente interpretable y puede servir como una herramienta para entender la naturaleza de G. anatis.

Bojesen et al. (2007) realizaron trabajos de variabilidad genética de cepas de G. anatis con el método AFLP (Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados), donde reportaron 94% de similitud genética, en comparación con la observada en esta investigación que fue de 52 a 87%. Esto demuestra una relativa heterogeneidad genética, así como diferencias en los biovares en ambas investigaciones.

CONCLUSIONES

  • Se identificó G. anatis mediante técnicas bioquímicas y PCR usando cebadores específicos.

  • Las cepas de G. anatis presentaron diversos perfiles de ADN mediante ERICPCR, encontrándose 10 biovares circulantes.

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 12 de abril de 2013

Aceptado para publicación: 4 de enero de 2014

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