RESULTADOS
El 28.4 y 64.2% de las cepas de G. anatis aisladas de aves comerciales procedían de los departamentos de La Libertad y Lima, zonas del país con la mayor población de aves comerciales. Asimismo, el 40% de cepas fueron aisladas de pollos de carne y el 38% de gallinas ponedoras (Fig. 1). En agar sangre de ovino, el 80% de las cepas de G. anatis mostraron hemólisis débil y el restante 20% presentó hemólisis intensa, siendo esta última, una característica de cepas que se diseminan a varios órganos.
En la clasificación de las cepas en biovares, mediante el perfil de hidrólisis a azúcares, se observaron 10 biovares, siendo el biovar 4 el de mayor frecuencia con el 46% de las cepas. Además, se encontró un biovar nuevo (NI) que agrupa al 6% (n=6) de cepas de G. anatis y cuya característica fue la fermentación positiva de todos los azúcares analizados (Fig. 2).
En el Cuadro 2 se observa que los 10 biovares de G. anatis están distribuidos en las 62 cepas procedentes de Lima. Además, el biovar 4 se encuentra en cepas de Ica, La Libertad y Arequipa. Por otro lado, el biovar NI está disperso en La Libertad, Lima y Ucayali.
Las 96 cepas fueron confirmadas como G. anatis mediante PCR usando cebadores específicos. Los productos amplificados fueron tres fragmentos de ADN de 1032, 985 y 789 pb. Asimismo, se evidenció que los cebadores hibridan con P. multocida y O. rhinotracheale, especies filogenéticamente relacionadas con G. anatis, pero producen un fragmento de ADN mayor a 1400 pb (Fig. 3).
En el análisis de la variabilidad genética intraespecífica usando la técnica ERIC-PCR se obtuvieron 20 fragmentos de ADN diferentes cuyos tamaños están entre 100 a 1500 pb. El mayor número de fragmentos de ADN polimórficos (11 bandas) se encontró en las cepas de G. anatis pertenecientes al biovar 3; sin embargo, no se encontraron bandas en los biovares 12 y 19. Además, no se observaron bandas específicas para cada biovar, a excepción del biovar 3 (1 banda). Se obtuvieron 24 patrones o perfiles diferenciados de las 96 cepas de G. anatis. La frecuencia (presencia de bandas) por locus en la totalidad de las cepas analizadas varió entre 0.052 y 0.875, lo cual indica variabilidad genética entre los aislados (Figs. 4 y 5).
Del análisis de los perfiles de ADN obtenidos por ERIC-PCR usando una matriz de similitud y el método UPGMA, las 96 cepas de G. anatis se agruparon en 24 patrones indicando la existencia de variabilidad intraespecífica y por lo menos 24 cepas circulantes. Sin embargo, estos agrupamientos no se correlacionan con los biovares (Fig. 5), ni con la zona geográfica.
DISCUSIÓN
En Perú, la avicultura está siendo afectada por una serie de agentes patógenos que producen infecciones, entre ellas las respiratorias de diversa etiología, pero de parecida sintomatología, lo cual dificulta el diagnóstico clínico. Por otro lado, los microorganismos frecuentemente están en proceso de cambio, ya sea por mutaciones debido a su adaptación al medio en que se desarrollan o como consecuencia del intercambio de material genético entre los mismos. Estos cambios exigen el desarrollo y uso de metodologías alternativas a las convencionales que permitan identificar el agente infeccioso en forma oportuna.
Estudios de variabilidad genética de G. anatis han sido descritos en Dinamarca, Bélgica, Checoslovaquia y Alemania (Bojesen et al., 2003a,b,c; Bojesen y Shivaprasad, 2007; Bojesen et al., 2007; Christensen et al., 2003, 2004; Christensen y Bisgaard, 2010), donde se encuentran 24 biovares de G. anatis, y donde la subespecie haemolytica comprende los biovares 1-4, 6, 7, 10-24, la subespecie anatis el biovar Pa, la genomoespecie 1 el biovar 5 y 8, y la genomoespecie 2 el biovar 9. Asimismo, en estos trabajos se aislaron 37 cepas de G. anatis en diversas especies de aves, encontrándose los biovares 1, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 24, Pa y Uc, siendo 15 de ellos, biovariedades hemolíticas, y Pa y Uc no hemolíticos. De estos dos últimos, Pa es el más frecuente, seguido de los biovares hemolíticos 1, 3, 4, 12 y 18.
En el presente estudio se encontraron cepas de G. anatis hemolíticas correspondientes a los biovares 1, 3, 4, 11, 12, 15, 19, 20 y 24, y los más frecuentes fueron el 1, 3, 4 y NI. Estas diferencias podrían deberse a que en el trabajo de Bojensen et al. (2003b) se utilizaron cepas aisladas de más especies de aves y de diferentes países, dando posibilidad a encontrar mayor número de biovariedades. Además, el biovar NI indicaría que es un nuevo grupo de cepas circulantes, las cuales no han sido descritas y quizás sean únicas del Perú. No obstante, debido a las escasas investigaciones, no se puede indicar que estas cepas han estado en circulación o que son de evolución reciente.
Respecto a la sensibilidad antimicrobiana, Bojesen et al. (2003b, 2011) demostraron que cepas de G. anatis presentaban resistencia a >3 antimicrobianos en el 65% de las cepas de campo; y solo dos cepas fueron sensibles a todos los antimicrobianos. Similar característica se observó en el presente estudio donde todas las cepas de G. anatis mostraron multirresistencia y tres fueron resistentes a todos los antimicrobianos estudiados. La resistencia a sulfamida (98%) fue similar a las observaciones de Bojesen et al. (2011). La disminución a la sensibilidad antimicrobiana puede deberse al uso inadecuado de los antimicrobianos, lo cual constituye un riesgo para el control de la bacteria.
La variabilidad genética intraespecífica de G. anatis se realizó mediante ERIC-PCR. Esta es una técnica fácil y de bajo costo que genera perfiles de ADN reproducibles. Esta misma técnica fue utilizada por Leotta et al. (2006) para analizar 49 cepas de P. multocida de diferente origen, subespecie, biotipo, grupo capsular, serotipo somático y perfil de resistencia antimicrobiana. El método de tipificación ERIC-PCR es útil para distinguir los clones estrechamente relacionados, lo que permite el reconocimiento de los linajes clonales patógenos específicos. El método permite un análisis epidemiológico molecular fácilmente interpretable y puede servir como una herramienta para entender la naturaleza de G. anatis.
Bojesen et al. (2007) realizaron trabajos de variabilidad genética de cepas de G. anatis con el método AFLP (Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados), donde reportaron 94% de similitud genética, en comparación con la observada en esta investigación que fue de 52 a 87%. Esto demuestra una relativa heterogeneidad genética, así como diferencias en los biovares en ambas investigaciones.
CONCLUSIONES
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Se identificó G. anatis mediante técnicas bioquímicas y PCR usando cebadores específicos.
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Las cepas de G. anatis presentaron diversos perfiles de ADN mediante ERICPCR, encontrándose 10 biovares circulantes.
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Recibido: 12 de abril de 2013
Aceptado para publicación: 4 de enero de 2014