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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

Print version ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.26 no.1 Lima Jan. 2015

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i1.10917 

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i1.10917 

Detección del Gen PrP de Scrapie en Ovinos Junín

Detection of the PrP gene in Junin sheep

 

Kamilo Rivera J.1, Lenin Maturrano H.2,3,4, Juan Manuel Aguilar3, Raúl Rosadio A.1,3

1 Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima

2 Laboratorio de Zootecnia y Producción Agropecuaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima

3 Instituto de Investigación y Desarrollo de Camélidos Sudamericanos – CONOPA, Lima

4 E-mail: lenin.maturrano@gmail.com


RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue establecer la frecuencia de genotipos de resistencia y susceptibilidad de padecer la enfermedad de scrapie en ovejas Junín. Se analizaron 56 muestras de sangre de ovinos de una unidad de producción privada de la región central del Perú. Se extrajo el ADN y los productos de PCR fueron analizados mediante digestión enzimática con endonucleasas de restricción que reconocen los polimorfismos del gen PrP. Se pudo identificar 4 de los 5 haplotipos reportados para el gen PrP: ARR (48.2%), ARQ (35.7%), AHQ (10.7%) y VRQ (5.4%). Además, se encontró 7 de los 15 genotipos reportados para el gen Prión: ARR/ARR (17.9%), ARR/AHQ (10.7%), ARR/ ARQ (42.9%),ARQ/AHQ (10.7%),ARQ/ARQ (7.1%),ARR/VRQ (7.1%) yARQ/VRQ (3.6%). El 82.1% de las ovejas presentaron genotipos de resistencia a la enfermedad y el 17.9% presentó genotipos de susceptibilidad.

Palabras clave: scrapie; gen Prión; ovino Junín


ABSTRACT

The aim of this study was to establish the frequency of resistance and susceptible genotypes to scrapie in the Junin sheep breed. For this, 56 blood samples were collected in a sheep farm in the central highlands of Peru. The DNA was extracted and the PCR products were analyzed by enzymatic digestion using restriction endonucleases that recognize the PrP gene polymorphisms. Four of the 5 haplotypes reported for the PrP gene were identified: ARR (48.2%), ARQ (35.7%), AHQ (10.7%) and VRQ (5.4%). In addition, 7 of the 15 reported genotypes for the Prion gene were found: ARR/ARR (17.9%), ARR/AHQ (10.7%), ARR/ARQ (42.9%), ARQ/AHQ (10.7%), ARQ/ARQ (7.1%), ARR/VRQ (7.1%) and ARQ/VRQ (3.6%). Finally, 82.1% of the animals had genotypes resistant to the disease and 17.9% showed genotypes of susceptibility.

Key words: scrapie; Prion gene; Junin sheep


INTRODUCCIÓN

La tembladera o scrapie es una encefalopatía espongiforme transmisible (EET) que afecta a ovejas y cabras. Fue descrita por primera vez en 1732 (Detwiler y Baylis, 2003), y ha recibido especial atención en años recientes, debido a la alarma social generada por la posible transmisión al hombre desde el bovino. La s intomatología incluye prurito, hiperexcitabilidad, temblores y falta de coordinación en la marcha, para acabar en parálisis y muerte. La enfermedad presenta largos periodos de incubación y da lugar a la degeneración progresiva del sistema nervioso central que, en etapas avanzadas de la enfermedad, adquiere el característico aspecto espongiforme (Portela et al., 2006).

El nombre de prión deriva de proteína infecciosa (Prusiner, 1995). Los priones son glucoproteínas de membrana que se anclan a ella por una molécula de glicosil-fosfatidilinositol y cumplen funciones biológicas que están relacionadas con la sinapsis (Brown, 2001) y con rutas de transducción de señales de membrana relacionadas con la apoptosis (Thellung et al., 2000). En el ovino se ha establecido la influencia del gen Prión (PrP o PRNP), en la capacidad de resistir o padecer la enfermedad. Los cambios de bases que se producen en tres codones (posiciones 136, 154 y 171) de la proteína prión van a determinar, en mayor o menor medida, la susceptibilidad de cada animal de padecer dicha enfermedad.

Se han establecido cinco grupos de riesgo de contraer la enfermedad con base al genotipo de cada animal, donde el grupo 1 incluye animales catalogados como muy resistentes o de muy bajo riesgo de contraer la enfermedad, y en el grupo 5 se incluyen los animales muy sensibles o de alto riesgo (Dawson et al., 1998). La variación que presentan los cinco haplotipos denominados ARQ, VRQ, AHQ, ARR y ARH establecen que, en general, los animales ARR/ARR son los más resistentes y los VRQ/VRQ son los más sensibles a padecer la enfermedad (Dawson et al., 1998).

En Francia (Francois et al., 2002), Islandia (Thorgeirdottir et al., 1999), Inglaterra (McIntyre et al., 2009), Bulgaria (Sirakov et al., 2011), Pakistán (Babar et al., 2009), Alemania (Lühken et al., 2004) y Estados Unidos de Norteamérica (Thompson y Gasser, 2008) se ha evaluado la frecuencia de los tipos genéticos del gen Prión en diversas razas de ovinos presentes en sus respectivas áreas geográficas. En la Unión Europea se promueven programas de erradicación de la enfermedad en ovinos, siendo un requisito realizar el genotipado de los animales que ingresan o salen de los países miembros (Comisión Europea, 2003).

En el Perú se tiene cerca de 10 millones de ovinos, entre carneros y corderos (INEI, 2012), los que representan un recurso importante de subsistencia en las regiones alto andinas del país. El grupo racial con mayor número de inividuos es el tipo criollo (81.0%), seguido de las razas Corriedale (11.4%), Hampshire Down (2.6%), Black Belly (0.9%) y otras razas (4.1%) en la que se incluye a la raza Junín (INEI, 2012). El ovino Junín es considerado como la primera raza desarrollada en la región andina y una de las pocas razas creadas en el hemisferio occidental durante el siglo pasado. Se formó por selección masiva dentro de un gran rebaño cerrado, como animal adaptado a las condiciones ambientales de sierra alta y puna. El ovino Junín produce carne y lana, es fértil y de crecimiento acelerado, criado a campo abierto en pasturas naturales (Villareal y Gamarra, 1978).

El objetivo del presente trabajo fue determinar los genotipos del gen Prión en ovinos Junín, con la finalidad de establecer la frecuencia de genotipos de resistencia o susceptibilidad de padecer la enfermedad de scrapie.

MATERIALES Y MÉTODOS

Toma de Muestras y Procesamiento

Se recolectaron 56 muestras de sangre de ovejas mayores de 2 años, provenientes de un núcleo de crianza privada. Las muestras de sangre fueron colectadas mediante punción de la vena yugular, empleando tubos vacutainer® de 3 ml con K­2 EDTA al 15%. Las muestras fueron conservadas a -20 °C y transportadas al Laboratorio de Biología y Genética Molecular de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), Lima.

Extracción de ADN

Para la extracción de ADN se utilizó el kit comercial DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN®), siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y la tasa de pureza (relación entre la concentración de ácidos nucleicos y concentración de proteínas) de las muestras se determinó mediante espectrofotometría a 260 y 280 nm. También se evaluó su calidad mediante electroforesis en un gel de agarosa, con un marcador de ADN de concentración conocida (ADN del fago λ cortados con la enzima Hind III).

Amplificación del Gen PrP mediante PCR

Con la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) se obtuvo un gran número de copias de un fragmento de ADN; en este caso, una región de aproximadamente 300 pb del gen Prión, que incluye las posiciones 136, 154 y 171. Para ello, se prepararon mezclas de reacción con 7.5 µl de Mix Multiplex 2X, 4.5 µl de agua ultrapura, 0.75 µl de cada primer (F y R) y 1.5 µl de ADN de ovino. Las condiciones de amplificación fueron: 95 °C durante 5 min, continuando con 30 ciclos a 95 °C durante 30 s, 63 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min, finalizando con un ciclo de 72°C durante 10 min. Se confirmó la presencia del gen PrP haciendo una electroforesis en gel agarosa al 2%.

Determinación de Genotipos del Gen PrP

Los productos de PCR fueron analizados mediante digestión enzimática con endonucleasas de restricción que reconocen los polimorfismos del gen PrP en estudio. Para determinar los polimorfismos de los codones 136 y 154, el producto de la PCR es digerido con la enzima BspHI (T↓CATAG) a 37 °C durante 2 h, como en el protocolo de Hunter (1997). En el caso del codón 136, si la enzima realiza un corte en el fragmento de ADN se tipifica como alelo V y si no realiza el corte se tipifica como A. Para el codón 154, si la enzima BspHI corta el producto de PCR en esta posición se tipifica como alelo H y si no realiza el corte se tipifica como R.

Los polimorfismos para el codón 171 se determinan según Yuzbasiyan-Gurkan et al. (1999), mediante la combinación de los resultados obtenidos por la digestión del producto de la PCR con la enzima BslI (CCNNNNN↓NNGG) a 55 °C, durante 2 h y del producto de la PCR con AccI (GT↓MKAC) a 37 °C durante 2 h. Si la enzima BslI corta, se le tipifica como alelo R, en caso contrario podría ser alelo Q o H. Para diferenciar los alelos Q y H se emplea la enzima AccI que al realizar corte se tipifica como alelo Q, en caso contrario como alelo H. Los fragmentos de restricción generados son separados por electroforesis en un gel de agarosa al 3%. La detección de los fragmentos se realiza por tinción con bromuro de etidio (0.5 µg/mg) y fotografiado bajo luz UV.

RESULTADOS

La Fig. 1 muestra el ADN en las muestras de sangre, obteniéndose concentraciones de ADN de 25 a 100 ng. Se logró amplificar el gen PrP de todas las muestras de sangre. El tamaño esperado del producto de PCR fue de 300 pb aproximadamente (Fig. 2).

Se encontraron cuatro haplotipos para el gen Prión, siendo el de mayor frecuencia el ARR (48.2 %) y el de menor frecuencia el VRQ (5.4%). La frecuencia para los AHQ y ARQ fue de 10.7 y 35.7%, respectivamente.

Asimismo, se encontraron 7 genotipos, que, de acuerdo a los grupos de resistencia, 4 pertenecieron a genotipos de resistencia y 3 a genotipos de susceptibilidad (Fig. 3. Así, el 17.9% perteneció al grupo de resistencia R1, 10.7% al grupo R2 y 53.6% al grupo R3. En los grupos de susceptibilidad, el 14.2% perteneció al grupo R4 y el 3.6% al grupo R5.

Finalmente, se encontró que el 82.1% de los animales mostraron algún genotipo de resistencia, en tanto que 17.9% de las ovejas presentó un genotipo de susceptibilidad.

DISCUSIÓN

La sintomatología del scrapie incluye signos de rápida identificación; sin embargo, no se ha reportado en forma fehaciente la presencia de esta enfermedad en ovinos en el Perú, aunque tampoco se puede descartar su presencia (R. Rosadio, Lima, comunicación personal). Se conoce que la proteína Prión resiste temperaturas extremas, compuestos orgánicos y otros que normalmente son capaces de desnaturalizar o destruir las proteínas (Arancibia et al., 2004). Además, se ha demostrado que la proteína infecciosa puede transmitirse a través de contacto con tejidos infectados, secreciones, e incluso por exposición a aerosoles liberados por animales infectados (Haybaeck et al., 2011).

El presente estudio permitió identificar 4 de los 5 haplotipos reportados a nivel mundial (Belt et al., 1995) y 7 de los 15 genotipos identificados para el gen Prión (Dawson et al., 1998). ARR fue el haplotipo más frecuente (48.2%), seguido del haplotipo ARQ (35.7%). Ianella et al. (2012) encontraron los mismos haplotipos y en el mismo orden de frecuencia, cuando evaluaron los haplotipos y genotipos en 13 razas de ovinos de Brasil, siendo uno de los pocos estudios realizados a nivel de Sudamérica. Los haplotipos ARR y ARQ son considerados de resistencia y AHQ de resistencia intermedia, mientras que VRQ es un haplotipo de susceptibilidad para el scrapie (Baylis y Goldmann, 2004).

En relación con los 7 genotipos encontrados (Fig. 3), 4 de ellos (ARR/ARR, ARR/ AHQ, ARR/ARQ, ARQ/AHQ) son considerados genotipos de resistencia y ARQ/ ARQ, ARR/VRQ y ARQ/VRQ son considerados genotipos de susceptibilidad (Dawson et al., 1998). De esta forma, el 82.1 % de las ovejas fueron consideradas como resistentes a scrapie, en tanto que el 17.9% fue considerado como susceptible.

Aunque estos valores solo corresponden a un grupo de 56 muestras, puede servir de punto de partida para futuras investigaciones, así como establecer un programa de prevención seleccionando animales resistentes a la enfermedad. El programa de selección en EEUU ha permitido disminuir los casos positivos a scrapie de 0.12% a 0.02% en algunos rebaños (American Sheep Industry Association, 2013). A nivel de América del Sur, Brasil ha reportado casos de scrapie o enfermedades causadas por priones desde 1978 (Ianella et al., 2012). Si bien se desconoce el total de casos reportados, es evidente que la proteína infecciosa está circulando en América del Sur y, por lo tanto, puede aparecer en el país. Brasil ha realizado el genotipado de 1400 ovejas de 13 razas (Ianella et al., 2012) y Uruguay (Artigas et al., 2011) viene realizando algunas pruebas, siendo los únicos estudios de este tipo en esta parte del continente.

La posibilidad de implementar estos análisis en un programa de selección facilitaría una rápida selección de animales con genotipos de alta resistencia a la enfermedad. Inclusive posibilitaría el análisis y trasferencia de embriones a madres con genotipo susceptible, pues fetos portadores del alelo ARR (resistencia a priones) que desarrollen en madres sucesptibles o que lleguen a desarrollar enfermedad pueden resistir y no acumular la proteína infecciosa (Wisniewski et al., 1996; Andreoletti et al., 2002). Por otro lado, los trabajos realizados en la selección de ovinos resistentes a scrapie concluyen que no han tenido efecto negativo contra características productivas deseadas como la producción de carne o lana (Moussaoui et al., 2005; Vitezika et al., 2006; Evoniuk et al., 2007; Sweeney y Hanrahan, 2008; Kastelic y Kompan, 2009; Boulton et al., 2010).

puede infectar al hombre y generarle una nueva EET, pero se conoce la capacidad de adaptación y transmisión de los priones infecciosos (PrPsc) de los ovinos al ganado vacuno (Bradleyy Wilsmith, 1993; Brown et al., 2001) y finalmente al hombre, produciendo la nueva variante de Creuzfeldt Jakob (Bruce et al., 1997); por ello la necesidad de identificar los genotipos de las ovejas y orientar la selección de genotipos de resistencia. Debido a esto, se reconoce el alto riesgo de transmisión de priones infecciosos interespecie y la necesidad de implementar medidas preventivas para evitar la transmisión al hombre. La Unión Europea, EEUU y otros países (Comisión Europea, 2003) han desarrollado planes de erradicación de scrapie, a través de la identificación, selección/eliminación de ovinos resistentes/susceptibles de padecer la enfermedad.

El ovino Junín fue desarrollado con las razas Columbia, Corriedale Americano, Panamá y Warhill (Villareal y Gamarra, 1978), pero se desconoce los genotipos que podrían estar presentes en estas razas. Tampoco se conoce los genotipos que podrían estar presentes en otras razas en el medio como Black Belly, Corriedale, Hampshire Down, y en el ovino criollo, de allí que se hace necesario realizar estudios adicionales en estas razas.

El presente estudio constituye el primer reporte de la identificación de haplotipos y genotipos de resistencia/susceptibilidad de scrapie en ovinos en el país.

CONCLUSIONES

  • Se encontraron 4 de los 5 haplotipos reportados (ARR, ARQ, AHQ y VRQ), y se encontraron 7 genotipos, de los cuales 4 fueron de resistencia y 3 de susceptibilidad al scrapie.

  • El 82.1% de las muestras correspondió a un genotipo de resistencia a scrapie, en tanto que el 17.95% correspondió a un genotipo de susceptibilidad.

  • El haplotipo ARR y el genotipo ARR/ ARQ fueron los más frecuentes.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología – CONCYTEC (Contrato 306-2009-CONCYTEC-OAJ) y al Vicerrectorado de Investigación de la UNMSM por el financiamiento del estudio.

 

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Recibido: 26 de marzo de 2014

Aceptado para publicación: 4 de setiembre de 2014