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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

Print version ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.26 no.2 Lima Apr. 2015

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i2.11006 

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i2.11006

COMUNICACIÓN

Uso de Plasma Seminal en la Criopreservación de Espermatozoides Epididimarios de Equinos

Use of seminal plasma in equine epididymal spermatozoa cryopreservation

 

H. Mauricio Gonzales Molfino1,2,3, Carolina Rodríguez1, Anderson Oropeza1, Yat Sen Wong1, José Llanos1, Hugo Gonzales Figueroa1

1 Laboratorio de Biotecnología y Fisiología Animal, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú

2 Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú

3 E-mail: mauricio.gonzalesm@urp.pe


RESUMEN

Se utilizó plasma seminal equino en un dilutor de lactosa-EDTA para la criopreservación de espermatozoides epididimarios de equinos. Se trabajó con 12 pares de testículos de caballos beneficiados. Se separaron los epidídimos y se utilizó la técnica de lavado retrógrado para obtener los espermatozoides, inyectando 10 ml del dilutor lactosa-EDTA por el conducto deferente. Se utilizaron las muestras con más de 30% de motilidad proresiva. Las muestras fueron diluidas 1:1 con el diluyente lactosa-EDTA-plasma seminal y se envasó en pajillas de 0.5 ml a una concentración 386.3 x 106, y fueron congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas por 10 días. Los valores obtenidos para las muestras frescas y descongeladas fueron: motilidad progresiva: 43.3 y 16.4% (p<0.05), viabilidad: 48.3 y 40.5%, morfología normal: 67.1 y 56.5%, e integridad de la membrana plasmática (HOS): 48.3 y 45.5%.

Palabras clave: espermatozoides, criopreservación, plasma seminal, epidídimo, equinos


ABSTRACT

Equine seminal plasma was used in a lactose-EDTA extender for cryopreservation of equine epididymal sperm. Twelve pairs of testicles of slaughtered horses were used. Epididymides were separated and washed applying the retrograde technique to obtain sperm by injecting 10 ml of lactose-EDTA extender through the vas deferens. Samples with more than 30% motility were used. Samples were diluted 1: 1 with the lactose-EDTAxtender seminal plasma and filled into 0.5 ml straws at a concentration of 386.3 x 106, frozen in liquid nitrogen and stored for 10 days. The values for fresh and thawed samples were: motility: 43.3 and 16.4% (p<0.05), viability: 48.3 and 40.5%, normal morphology: 67.1 and 56.5%, and integrity of the plasma membrane (HOS): 48.3 and 45.5%.

Key words: sperm, cryopreservation, plasma seminal, epididymis, equine


INTRODUCCIÓN

En la actualidad, la recuperación de espermatozoides y la preservación del epidídimo de un semental después de la castración, sea por decisión propia, lesión traumática, enfermedad grave o muerte insperada, ha permitido la conservación genética gracias los avances en biotecnología reproductiva (James, 2004; Bruemmer, 2006). Se ha demostrado que espermatozoides reuperados de epidídimo son viables, incluso cuando se les mantiene a temperatura amiente hasta por 24 horas, lo cual indica que incluso podrían ser utilizados en inseminación artificial (IA) (Papa et al., 2008); no obstante, cuando los testículos se almacenan a 4 ºC, el esperma tiende a tener una mayor viabiliad (James, 2004).

En el equino, el lavado retrógrado es una técnica rápida y eficaz para la recuperación de espermatozoides de la cola de epidídimo, y de calidad similar a la obtenida en eyaculados recogidos con vagina artificial (Papa et al., 2008; Monteiro et al., 2011); asimismo, estos espermatozoides congelados demuestran ser fértiles (Cary et al., 2004). Otros estudios demuestran que espermaozoides de cola de epididimo obtenidos dentro de las 24 horas de la orquiectomía tienen similar fertilidad a los del esperma eyaculado (Armas et al., 2011; Monteiro et al., 2011).

La criopreservación de espermaozoides es una parte esencial de los prograas de mejoramiento genético y selección de reproductores (Barbas et al., 2009). El uso de nuevos dilutores es fundamental para la supervivencia de espermatozoides sometios a procesos físicos como la criopreseración. Los espermatozoides de equinos son extremadamente sensibles a las alteraciones celulares generadas por la congelación, de allí que los dilutores disminuyen el punto de fusión de las soluciones, reduciendo la conentración intra y extra celular de solutos, evitando el daño celular (Palma, 2001).

En la composición de muchos dilutores se encuentra el EDTA (Martin et al., 1979), el cual está compuesto a base de azúcares (lactosa), sales, albúmina y lípidos, garantiando la disminución del shock térmico y la formación de cristales de hielo intracelular, evitando la lisis celular poscongelación. Asimismo, el uso de carbohidratos, especialente de lactosa, proporciona la energía necesaria para el metabolismo celular del espermatozoide. Bruemmer (2006) demostró un aumento de la motilidad espermática en el equino al utilizar como dilutor el medio Lactosa-EDTA.

La adición de plasma seminal equino es otro elemento que puede ayudar a aumentar la viabilidad de los espermatozoides epididimarios después del congelamiento (Troedson et al., 2002). Por consiguiente, el presente estudio fue diseñado con la finaliad de evaluar el efecto del dilutor lactosaDTA-plasma seminal en la viabilidad de espermatozoides epididimarios de equino poscongelación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material Biológico

Se utilizaron 12 pares de testículos de potros criollos adultos, con edades entre 10 a 16 años, beneficiados para consumo en el camal «Casa Blanca», en Pachacamac, Lima, Perú. Los testículos se colectaron inmediatamente después del beneficio, retirándose la túnica vaginal visceral y lavándose con suero fisiológico. Se colocaron en tubos cónicos de 50 ml de polietieleno (Falcon®) contenieno 10 ml de solución fisiológica salina al 0.9% con antibióticos (100 UI/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina).

Los testículos fueron transportados en refrigeración (5 ºC) al Laboratorio de Biotecología y Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, en un lapso no mayor de dos horas. El estudio se realizó durante los mees de abril a julio de 2010.

Espermatozoides Epididimarios

Los testículos fueron lavados cinco veces con una solución buferada (PBS) a 37 ºC, secándolos con papel absorbente. Se separaron los epidídimos y el conducto deferente mediante un corte con tijera recta.

Se hicieron varios cortes transversales en la cola epididimaria con la finalidad de facilitar la salida de los espermatozoides. El lavado retrogrado se hizo insertando una aguja de 18G en la entrada del conducto deferente (Cary et al., 2004; Heise et al., 2011) con 10 ml de diluyente lactosa-EDTA sin yema de huevo. Luego se introdujo 5 ml de aire en el conducto deferente para terminar de evacuar el contenido. Los espermatozoides recuperados fueron recepcionados en placas (Falón® 35-3001) estériles.

Se colocó 1 ml de la muestra epididimaria en tubos Eppendorf® (2 ml), en baño María a 37 ºC por 5 minutos para la evaluación microscópica.

Preparación del Dilutor

Se utilizó el dilutor descrito para la conelación de espermatozoides equinos (Devireddy et al., 2002). La fracción A fue en base a lactosa (11 g), EDTA(0.1 g), citrato de sodio (0.089 g), bicarbonato de sodio (0.008 g) y yema de huevo (10 ml). La fración B se preparó con 6 ml de glicerol comletándose hasta 100 ml con agua bidestilada.

Preparación del Plasma Seminal Equino

El plasma seminal fue obtenido del eyaculado de dos sementales de la raza Caallo Peruano de Paso, de un haras en Mamacona, Lima. El semen colectado fue centrifugado a 900 g durante 9 min.

Volúmenes iguales de plasma seminal de los dos sementales se combinaron y el plasma seminal agrupado se centrifugó a 27 000 g (Allegra® X-30 Series) por 40 min, con la finalidad de eliminar cualquier resto de espermatozoides.

Fase Experimental

Las muestras con motilidad mayor de 30% fueron procesadas y criopreservadas utilizando una dilución de 1:1 con el dilutor, obteniendo una concentración final de 386.3 x 106 espermatozoides/ml. Se tuvo un perioo de equilibrio de 2 horas a 4 ºC y luego el semen diluido fue colocado en pajillas de 0.5 ml (IVM Technologies, Francia) y selladas con alcohol de polivinil. Las pajillas fueron expuesas a vapores de nitrógeno líquido a 4 cm del nivel de nitrógeno por 10 min y luego fueron sumergidas en el nitrógeno líquido (-196 ºC) por 10 días (Monteiro et al., 2011).

Para la descongelación, la pajilla se suergió en agua por 30 s a 37 ºC (Cary et al., 2004; Salazar et al., 2011), evaluándose la motilidad progresiva, viabilidad, morfología e integridad funcional de la membrana (HOS). Para esto, se siguieron los siguientes proceimientos:

  • Motilidad progresiva bajo un objetivo de 10X de un microscopio (CME Leyca®).

  • Viabilidad, mediante coloración eosinaigrosina

  • Morfología, utilizando la batería de Diffuick®, observándose con los objetivos de 40X y 100X.

  • Integridad funcional de la membrana plasmática (HOS). A 10 µl de la muesra se le agregó 1 ml de solución hiposmótica (citrato de sodio 7.35 g/l; fructosa 13.51 g/l; a pH 7.2), e incubada a 37 ºC por 30 min (Jeyendram et al., 1984). En cada parámetro se contaron 100 espermatozoides (Vidament et al., 2002; Sieme et al., 2003; Heise et al., 2011).

  • La concentración espermática se hizo por recuento en una cámara de Neubauer (James, 2004).

Análisis Estadístico

Se evaluaron las características de los espermatozoides en fresco y posterior a la descongelación mediante la prueba de análisis de varianza y «t» Student con un grado de significación de p<0.05 (Álvarez, 2007). En el análisis estadístico se empleó el programa SPSS v. 21.0.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La motilidad progresiva de espermatozoides epididimarios fue de 43.3% (Cuadro 1), siendo menor del 57% reportado por James (2004). No obstante, Heise et al. (2011) obtienen un amplio rango (de 10 a 75%) en epidídimos de cuatro sementales poscastración. Por otro lado, la motilidad posdencogelación fue significativamente mejor (16.3%, p<0.05), en tanto que Heise et al. (2011) reportan entre 5 a 10% y James (2004) y Monteiro et al. (2011) obtienen 46 y 36.2%, respectivamente. En el presente estudio, los espermatozoides estuvieron expuestos al dilutor lactosa-EDTA-plasma seminal por 2 h, en tanto que James (2004) añade glicerol en fracciones de 0.125% del volumen total en 30 min, llegando al volumen apropiado en 2 h.

La motilidad progresiva posdescongelación en el equino debe ser superior al 30% para obtener resultados aceptables de concepción (Samper y Morris, 1998). El valor de 16.4% del presente estudio quedó por debajo de las motilidades obtenidas y recomendadas por Schulman et al. (2003) de 29 a 40% y de Hernández et al. (2012) de 26 a 53% para su uso en programas de IA.

El porcentaje de espermatozoides vivos fue 48.3%, valor inferior al 91% reportado por Heise et al. (2011) en muestras de epidídimo. La diferencia puede estar asociada a la edad de los animales, ya que las muestras corresponden a caballos con más de 10 años, mientras que en el otro estudio se utilizaron sementales de 4 a 5 años de edad, obtenidas después de la castración. No obstante, la viabilidad de los espermatozoides no se vio afectada por la congelación; posiblemente por el efecto benéfico de la yema de huevo, la cual aporta grasas saturadas, protegieno a las células contra el shock osmótico (Crabo, 2001). Asimismo, el plasma seminal podría estar ejerciendo un efecto protector.

El porcentaje de espermatozoides normales fue de 67.1 y 56.5 en las muestras pre y poscongelación, respectivamente; valores superiores al 35.4 y 29.9% reportados por Heise et al. (2011). Las frecuencia de anormalidades encontradas en cabeza, cuello y cola fueron de 14.6, 5.8 y 12.6% en las muestras frescas, coincidiendo con los resultados de Heise et al. (2011).

CONCLUSIONES

  • La técnica de lavado retrogrado, con el uso del diluyente lactosa-EDTA, permiió recuperar espermatozoides epididimarios viables en equinos.

  • La criopreservación de espermatozoides epidimarios de equino, utilizando el dilutor lactosa-EDTA suplementada con plasma seminal equino, afectó negativamente la motilidad posdescongelación.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Programa de Bioemprendimiento y Biocluster Empresarial de la Facultad de Ciencias Biológicas, Uniersidad Ricardo Palma, por la conexión con el haras. Asimismo, a los integrantes del Laboratorio de Biotecnología y Fisiología Anial, por el apoyo en la realización del trabajo.

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 26 de junio de 2014

Aceptado para publicación: 28 de noviembre de 2014

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