http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i3.11185

Agentes crioprotectores alternativos para el congelamiento lento de espermatozoides epididimarios de alpaca (Vicugna pacos)

Alternative cryoprotectans suitable for an slow freezing method of epididymal spermatozoa of alpaca (Vicugna pacos) 

 

Nadia Canorio Pariona^1,2,3, Fernando Paredes Arnedo¹, Martha Valdivia Cuya¹

1 Laboratorio de Fisiología de la Reproducción Animal (LFRA), Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

2 E-mail: ncanorio@gmail.com

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RESUMEN

El objetivo del estudio fue utilizar agentes crioprotectores alternativos para el congelamiento lento de espermatozoides epididimarios de alpaca (Vicugna pacos). Epidídimos obtenidos en el camal de la ciudad de Huancavelica fueron transportados a 4 °C en solución fisiológica al laboratorio en Lima, Perú. Los espermatozoides fueron extraídos de la cola del epidídimo e incubados en medio HAMF10 a 37 °C. Se usó el medio Tes-Tris-Yolk como medio de criopreservación y suplementado con los agentes crioprotectores dimetilsulfóxido (Me2 SO4 ) en concentraciones de0.5, 0.25 y 0.125M y dimetilacetamida (DMA) en concentraciones de 0.75, 0.385 y 0.18M, y comparados con el grupo control criopreservado con glicerol 0.6M. Se evaluó la motilidad, viabilidad e integridad de membrana antes y después del congelamiento. Se obtuvo una mejor viabilidad e integridad de membrana posdescongelamiento con DMA 0.375M (p<0.05). La motilidad fue mejor en los grupos de Me2 SO4 0.25 y 05M y de DMA 0.375 y 0.75M (p<0.05).

Palabras clave: alpaca, espermatozoide, criopreservación, dimetilacetamida, dimetilsulfóxido

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ABSTRACT

The objective of this study was to use alternative cryoprotectans suitable for freezing epididymal spermatozoa of alpaca (Vicugna pacos) in a slow freezing method. Epididymides obtained in the slaughterhouse of Huancavelica city were transported at 4 °C in saline solution to the laboratory in Lima, Peru. The sperm cells were extracted from the epididymis and incubated in HAMF10 medium. The Tes-Tris-Yolk-Citrate medium was used and supplemented with the cryoprotectants dimethyl sulfoxide (Me2 SO4 ) at 0.5, 0.25 and 0.125M concentrations, and dimethylacetamide (DMA) at 0.75, 0.385 and 0.18M concentrations, and compared with a control group cryopreserved with glycerol 0.6M. Motility, viability and integrity of membrane before and after freezing were assessed. The results showed a better viability and membrane integrity post-freezing when using DMA 0.375M (p<0.05). Motility was better with Me2 SO4 0.25 and 05M and DMA 0.375 and 0.75M (p<0.05).

Key words: alpaca, sperm, cryopreservation, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide

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INTRODUCCIÓN

La criopreservación del semen de alpaca es una técnica muy limitada debido a su escaso desarrollo (Bravo et al., 2000). Además, el semen es generalmente pobre en calidad y altamente viscoso, haciendo difícil su manejo, dilución y evaluación. Trabajos sobre criopreservación de semen de alpaca reportan entre 6 y 20% de motilidad posdescongelamiento (Vaughan et al., 2003; Santiani et al., 2005) y raramente superan el 40%, aunque Bravo et al. (1996) reportaron 45%, pero sin dar detalles que permitan la réplica de su metodología.

En años recientes se ha trabajado en la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca con mejores resultados. Morton et al. (2010) reportaron diferencias en las propiedades de la membrana plasmática entre los medios usados, especialmente debido a la fuente de la muestra (eyaculado o epidídimo).

El uso de agentes crioprotectores permeables es esencial para la viabilidad posdescongelamiento de los espermatozoides, ya que se minimiza la formación de hielo intracelular; sin embargo, la introducción y remoción de estos agentes crioprotectores pueden dañar la célula. La mayoría de trabajos sobre criopreservación de espermatozoides de alpaca ha empleado glicerol (6-7%) como agente crioprotector, donde los resultados demuestran una recuperación pobre tras la descongelación, acompañada con la pérdida parcial de la motilidad inicial (Vaughan et al., 2003; Santiani et al., 2005; Valdivia et al., 2005). Recientemente, una metodología eficiente de criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca ha sido desarrollada utilizando glicerol a una concentración de 3% (Morton et al., 2007). A pesar de sus beneficios, el glicerol es potencialmente citotóxico a ciertas concentraciones (Almilid y Jhonson, 1988; Holt, 2000; Watson, 2000) y tiene un efecto contraceptivo en algunas especies (Sexton, 1975; Hay et al., 1997).

Son pocos los estudios que se han enfocado en crioprotectores alternativos para la criopreservación de espermatozoides de alpaca, estimulando la búsqueda de agentes como dimetilacetamida (DMA) o dimetilsulfóxido (Me2 SO4 ) (Lovelock et al., 1959; Ball et al., 2001), en consideración a su naturaleza altamente hidrofílica y su bajo tamaño molecular. Así mismo, DMA ha sido usada en la criopreservación de espermatozoides de aves (Blanco et al., 2000) y mamíferos como el koala y el canguro (McClean et al., 2008), y es el agente crioprotector más usado en la criopreservación de espermatozoides de peces (Tiersch et al., 2004; Vuthiphandchai et al., 2009; Yang et al., 2010).

El estudio tuvo como objetivo evaluar la efectividad de DMA y Me2 SO4 como agentes crioprotectores en el proceso de congelamiento lento de espermatozoides epididimarios de alpaca.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Se utilizaron 30 muestras provenientes de 30 alpacas de 4 a 7 años de edad. Los animales fueron sacrificados en el camal municipal de la ciudad de Huancavelica. Los testículos fueron colectados con el escroto completo bajo condiciones de higiene y transportados a 4-8 °C al Laboratorio de Fisiología de la Reproducción Animal (LFRA) de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, donde llegaron dentro de las 14 horas del sacrificio.

Colección de la Muestra

En el laboratorio se procedió a aislar la región de la cola del epidídimo, el cual fue limpiado y liberado de venas residuales y restos de sangre. Fue cortado en pedazos pequeños para permitir la salida de los espermatozoides en solución salina (0.9% NaCl) a 37 °C. La suspensión de espermatozoides fue transferido a tubos plásticos de 10 ml.

Se evaluó la concentración espermática, motilidad, viabilidad e integridad de membrana. Las muestras de espermatozoides fueron centrifugadas y resuspendidas en medio HAM F10 (Sigma, Cat. N.° N6635) por 30 min a 37 °C. Se recuperó el sobrenadante que contenía los espermatozoides móviles y morfológicamente normales, y se procedió a la evaluación de la concentración, viabilidad, motilidad e integridad de membrana.

Evaluación Espermática

• Concentración espermática. Se hizo una dilución de 10 µL de la muestra fresca en 90 µL de agua. Se colocó 10 µL de esta dilución en cada cámara de un hemocitómetro (Improved Naebauer, Weber, Londres, Reino Unido). Se contaron los espermatozoides en las rejillas de cada lado de la cámara y el promedio de ambos lados fue usado para calcular el número de espermatozoides ml-1 en la muestra inicial.

• Motilidad. Se evaluó en forma subjetiva. Se colocó una alícuota de 10 µL de la muestra resuspendida de espermatozoides en una lámina precalentada y cubierta con una laminilla precalentada, como describen Evans y Maxwell (1987), y se observó bajo microscopía de luz. Se expresó en porcentaje.

• Viabilidad. Se evaluó utilizando el colorante vital eosina. Se colocó una gota de muestra y una gota del colorante y se incubó a 37 °C por 5 min. Luego, se procedió a realizar el conteo de espermatozoides no coloreados (espermatozoides vivos). Los espermatozoides coloreados de naranja/rosa corresponden a espermatozoides muertos. Se expresó en porcentaje.

• Integridad de membrana plasmática. Se empleó el test hipoosmótico (Jeyendran et al., 1984), el cual consiste en incubar 100 µl de la muestra en 900 µl de medio hipoosmótico (7.35 g de citrato de sodio y 13.51 g de fructosa en 1000 ml, 150 mOsm/kg). La incubación se hizo a 37 °C por 30 min. Se evaluó por microscopía. Espermatozoides con la cola enrollada correspondían a espermatozoides con membrana plasmática intacta y espermatozoides con cola recta correspondían a espermatozoides con la membrana plasmática alterada. Se expresó en porcentaje.

Diseño Experimental

Las concentraciones de crioprotectores usadas en este trabajo fueron realizadas en base a trabajos previos realizados en nuestro laboratorio (Valdivia et al., 2005).

En las primeras pruebas se evaluaron agentes crioprotectores como dimetilsulfóxido, propilenglicol, glicerol y dimetilacetamida en varias concentraciones con resultados desalentadores. En el caso de glicerol y propilenglicol (1.5, 1.0, 0.5 y 0.25M) no hubo espermatozoides móviles posdescongelamiento y la viabilidad e integridad de membrana fueron inferiores al 30% (resultados no mostrados). En el caso de dimetilsulfóxido (Me2 SO4 ) y dimetilacetamida (DMA) en concentraciones de 2.0, 1.5 y 1.0M, se encontró una motilidad posdescongelamiento de 10% y viabilidad e integridad de membrana cercanas al 50%. Ante esto, se procedió a evaluar concentraciones menores.

Las muestras fueron divididas en tres grupos: Un grupo criopreservado con glicerol al 3% (grupo control), otro criopreservado con dimetilsulfóxido (0.5M, 0.25M y 0.125M) y otro criopreservado con dimetilacetamida (0.75M, 0.375M y 0.18M). Al final, se obtuvo cuatro pajuelas de 0.25 ml para cada concentración de cada crioprotector, incluido el grupo control.

Proceso de Criopreservación

Se usó el medio Tes-Tris-Yolk para el proceso de criopreservación, el cual incluía una solución de citrato de sodio al 5% (Sigma, código D1546), solución de Tes al 2% (Sigma, código T1375), Trizma Base al 8% (Sigma, código T6066) y yema de huevo al 20%. La solución final fue suplementada con estreptomicina y penicilina (1:1000). El medio preparado fue suplementado con los agentes crioprotectores dimetilacetamida y dimetilsulfóxido en sus diversas concentraciones y glicerol en la concentración de 0.6M.

La muestra de espermatozoides fue ajustada a 20 x 106 espermatozoides/ml, la cual fue mezclada en una proporción de 1:1 con el medio Tes-Tris-Yolk suplementado con el agente crioprotector logrando una concentración espermática final para la criopreservación de 10 x 106 espermatozoides/ml. Esta dilución fue mantenida a 4 °C por una hora, lo cual correspondió al tiempo de estabilización, periodo donde hay un descenso en la temperatura de 37 °C a 4 °C a una velocidad de 0.55 °C/min. Luego, las muestras fueron colocadas en pajuelas de criopreservación de 0.25 ml, selladas y colocadas en el sistema de congelamiento (CL3300, Cryologic, Australia) termocontrolado por el software Cryogenesis 4.1 del equipo, a velocidades de 3-5 °C/min.

El protocolo de congelamiento fue el siguiente: La temperatura inicial de 4 °C fue mantenida por 5 min. Luego se hizo un descenso de +4 a -2 °C a 3 °C/min y mantenidos a -2 °C por 1 min. Allí se procedió a hacer la siembra (seeding), que consiste en tocar la base de las pajuelas con la punta de una pinza a -196 °C hasta que se viera un ligero cambio de color en las paredes de las pajuelas, lo cual indica la formación de microcristales. Se continuó con el descenso de la temperatura hasta -30 °C (velocidad de congelamiento de 5 °C por min) y de -30 a -80 °C  (velocidad de congelamiento de 8 °C/min). Finalmente, las pajuelas se colocaron en nitrógeno líquido (-196 °C).

A las 72 h de la congelación se procedió a la descongelación de las pajuelas en baño maría a 50 °C por 7 s. La muestra descongelada fue centrifugada y el pellet obtenido fue resuspendido en 0.5 mL de medio HAM F1 y mantenido a 37 °C por 10 min. Luego se procedió a evaluar la motilidad, viabilidad e integridad de membrana en los espermatozoides.

Análisis Estadístico

Los valores obtenidos en la evaluación espermática fueron analizados mediante el análisis de varianza de un factor, luego de realizar la transformación de los datos con el arc-sen. Se rechazaron comparaciones mediante el análisis estadístico no paramétrico (Prueba de Tukey) y las diferencias fueron consideradas significativas cuando p<0.05. Los resultados fueron expresados como media ± desviación estándar (d.e.). Los análisis fueron realizados usando el paquete estadístico SPSS (v. 17.00 para Windows).

RESULTADOS

El presente estudio evaluó el efecto de dos agentes crioprotectores (Me2 SO4 y DMA) durante el proceso de criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca. Los resultados fueron comparados con aquellos obtenidos con la muestra control (criopreservados con glicerol 0.6M). La muestra inicial presentó una concentración espermática promedio de 56 x 106 espermatozoides/ml, motilidad de 77.3 ± 5%, viabilidad de 72.5 ± 4.2% e integridad de membrana plasmática de 63.2 ± 5.2%.

Los resultados de motilidad, viabilidad e integridad de la membrana plasmática luego del proceso de estabilización a 4 °C por 1 h indican que se obtuvieron mejores valores con el uso de DMA en sus tres concentraciones (p<0.05; Cuadro 1).

En el Cuadro 2 se presentan los resultados luego del proceso de congelación y descongelación. La viabilidad e integridad de membrana fueron mejores cuando se usó DMA 0.375M. En el caso de la motilidad, los resultados fueron bastante similares, con excepción de Me2 SO4 0.125M, DMA 0.18M y glicerol 0.6M donde los valores fueron los más bajos (p<0.05).

DISCUSIÓN

La criopreservación de semen de alpaca ha tenido un progreso pobre y desalentador comparado con otras especies domesticas (Vaughan et al., 2003; Santiani et al., 2005). El uso reciente de espermatozoides del epidídimo para desarrollar técnicas de congelamiento de semen en alpacas han cambiado la percepción sobre el espermatozoide de alpaca y brinda luces en la fisiología de esta célula. En el presente trabajo se evaluaron dos nuevos agentes crioprotectores, dimetilacetamida y dimetilsulfóxido, en el congelamiento lento de espermatozoides epididimarios de alpaca.

Se trabajó con el medio Tes-Tris-Yolk para el proceso de criopreservación, el cual ha sido usado en otras especies, como en toro (Vishwanath y Shannon, 2000), carnero (Evans y Maxwell, 1987), cabra (Leboeuf et al., 2000), alpaca (Vaughan et al., 2003), llama (Ratto et al., 1999) y camello (NiasariNaslaji et al., 2006). Por otro lado, Wani et al. (2005) reportaron mejores resultados de viabilidad usando Tes-Tris-Yolk y TrisLactosa-Yolk en comparación con los medios citrato yolk, sucrosa yolk and Trisfructosa yolk en semen de camellos.

La velocidad de enfriamiento empleada fue entre 4-7 °C/min, la cual es ideal para estos agentes crioprotectores. Asimismo, los cuatro puntos de temperatura de referencia durante el enfriamiento (+4, -2, -30 y -80 °C) son puntos estándares en las curvas de enfriamiento lento que se emplean en otras especies (Willadsen et al., 1976; Curry et al., 1994). Por otro lado, el ambiente intra y extracelular es muy diferente cuando el espermatozoide llega a -196 °C, pudiendo ocurrir daño si la velocidad de descongelación no es compatible con la velocidad de congelación, de allí que se haya usado un descongelamiento rápido (50 °C por 7 s).

Glicerol al 3% es el agente crioprotector más usado para criopreservar espermatozoides de alpaca (Morton et al., 2007), pero puede producir efectos tóxicos y contraceptivos en espermatozoides criopreservados de otras especies (Holt et al., 2000); asimismo, su comportamiento durante el congelamiento depende de la velocidad de enfriamiento. En los preliminares del presente estudio se utilizaron varias concentraciones (1.5, 1.0, 0.5 y 0.25M) con resultados posdescongelamiento inadecuados (resultados no mostrados), lo cual posiblemente se debía al comportamiento molecular del glicerol, ya que es un buen agente crioprotector en procesos de congelamiento rápido debido a la alta viscosidad que muestra, donde la velocidad de enfriamiento óptima sería de 10-50 °C/min.

Crioprotectores como DMA y Me2 SO4 (Lovelock et al., 1959; Ball et al., 2001; Alvarenga et al., 2005) son buenos candidatos debido a su naturaleza altamente hidrofílica, bajo peso molecular y nivel de toxicidad inferior al del glicerol. DMA reduce la formación de cristales de hielo intracelular e incrementa la permeabilidad de la membrana decreciendo el daño osmótico (Ball et al., 2001), en tanto que la penetración del Me2 SO es también rápida debido a su bajo peso molecular (Lovelock et al., 1959) y ha sido usado con éxito en varias especies (Kundu et al., 2000).

Las concentraciones de DMA empleadas en el presente estudio fueron evaluadas en otras especies, como conejo (Dalimata y Graham, 1997, Okuda et al., 2007), jabalí (Kim et al., 2011), tortuga y peces (Tiersch et al., 2004; Vuthiphandchai et al., 2009; Yang et al., 2010), canguro (McClean et al., 2008), caballo (Medeiros et al., 2002, Squires et al., 2004) y koala (Zee et al., 2008; Johnston et al., 2012), donde emplearon concentraciones de 0.25 a 1.25M, reportando valores posdescongelamiento de 45% de motilidad, 58% de viabilidad y 60% de integridad de membrana plasmática.

El Me2 SO ha sido usado en diversas especies como cabra (Kundu et al., 2000), lobo colorado (Johnson et al., 2014), peces (Anchordoguya et al., 1988; Thirumala et al., 2005, 2006; Vuthiphandchai et al., 2009; Sanches et al., 2013), cerdo (Hood et al., 1970), caballo (Devireddy et al., 2002) y humano (Serafini et al., 1986), en concentraciones de 0.25 a 1.5M, encontrando valores posdescongelamiento de 35% de motilidad, 59% de viabilidad y 50% de integridad de membrana.

Los resultados posdescongelamiento muestran un descenso en los parámetros de motilidad, viabilidad e integridad de membrana, siendo la motilidad la más afectada, como lo reportan otros autores (Watson, 1995). Los valores más altos de motilidad obtenidos en el presente estudio concuerda con las concentraciones empleadas para Me2 SO4 y DMA en otros estudios (Kundu et al., 2000; Devireddy et al., 2002; Medeiros et al., 2002; Squires et al., 2004; Tiersch et al., 2004; Thirumala et al., 2006; Okuda et al., 2007; McClean et al., 2008; Vuthiphandchai et al., 2009; Yang et al., 2010; Kim et al., 2011; Sanches et al., 2013; Johnson et al., 2014).

CONCLUSIONES

• La motilidad, viabilidad e integridad de membrana del espermatozoide epididimario de la alpaca se ven afectadas durante el proceso de congelamiento, siendo la motilidad el parámetro más afectado (p<0.05).

• Luego del proceso de congelación y descongelación se obtuvieron mejores valores de viabilidad e integridad de la membrana plasmática cuando se usó DMA 0.375M (p<0.05).

• Los agentes crioprotectores dimetilsulfóxido (0.75M y 0-375M) y dimetilacetamida (0.5M y 0.25M) son buenos candidatos para ser usados en los procedimientos de congelamiento lento de espermatozoides epididimarios de alpaca, ofreciendo mejores resultados posdescongelamiento en comparación con el glicerol (0.6M).

 

Literatura Citada

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Recibido: 7 de enero de 2015

Aceptado para publicación: 20 de abril de 2015