http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v27i1.11453

ARTÍCULOS PRIMARIOS

Valores hematológicos y lesiones anatomopatológicas en gallinas white leghorn afectadas por la enfermedad respiratoria crónica

Hematological values and anatomopathological lesions in White Leghorn hens Affected by chronic respiratory disease

 

Manuel Colas C.^1,5, Raiden Grandía G.², Nelson Merino G.³, Yaima Burgher P.⁴, Michel Báez A.⁴, Ivette Espinosa C.⁴, José López R.¹

1 Instituto de Investigaciones Avícolas – IIA, Cuba

2 Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio - CENPALAB, Cuba

3 Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos - CECMED, Cuba

4 Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria - CENSA, Cuba

5 E-mail: manuelcc@unah.edu.cu

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RESUMEN

La enfermedad respiratoria crónica (ERC) es considerada como una de las enfermedades infectocontagiosas de etiología múltiple que ocasiona grandes pérdidas económicas en la avicultura. Las manifestaciones clínicas y lesiones pueden ser muy severas cuando ocurren infecciones mixtas. Este complejo respiratorio ha estado presente en Cuba; sin embargo, no se conoce cómo varían los valores hematológicos en aves afectadas. El objetivo del presente estudio fue determinar los valores hematológicos y las lesiones anatomopatológicas en gallinas White Leghorn afectadas por la ERC. Se muestrearon 34 animales de 32 semanas de edad dentro de un foco activo (17 afectados y 17 clínicamente sanos) para la exploración clínica, necropsia, aislamiento e identificación de bacterias, y evaluación hematológica. Se compararon frecuencias de microorganismos y lesiones presentes, así como las medias de las variables hematológicas entre aves enfermas y sanas. Se evidenció la presencia de Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum y Escherichia coli solos o en infección mixta (5.9-35.3%). Se observaron lesiones predominantes (p<0.05) como la traqueítis catarral (76.5%), atrofia genital (52.9%), aerosaculitis (47.1%), rinoconjuntivitis fibrinosa y alteraciones hepáticas (41.2%), entre otras. El análisis hematológico evidenció menores valores de hemoglobina (8.9 g/dl), hematocrito (29.7%) y leucocitos totales (9.9×103/mm3) con incremento de heterófilos (18.2%) en animales enfermos en comparación con los sanos. Se concluye que en las aves afectadas por la ERC predominan las lesiones respiratorias y se afectan los valores hematológicos.

Palabras clave: enfermedad respiratoria crónica, hematología, lesiones anatomopatológicas, White Leghorn

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ABSTRACT

The chronic respiratory disease (CRD) is considered as an infectocontagious disease of multiple etiology that causes great economic losses in poultry farming. The clinical signs and lesions in affected animals can be severe when mixed infections occur. In Cuba this respiratory complex is evident; however, it is not known how the hemathological values vary in affected fowls. The objective of this study was to determine the hemathological values and anatomopathological lesions in CRD affected White Leghorn hens. A total of 34 hens of 32 weeks of age were sampled in an affected flock (17 affected and 17 healthy) and was conducted the clinical evaluation, necropsy, isolation and identification of bacteria and hematological analysis. The frequencies of microorganisms and lesions present, as well as means of hematological variables between ill and healthy birds were compared. The presence of Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum and Escherichia coli were evidenced alone or in mixed infections (5.9- 35.3%). Main lesion observed were catarrhal tracheitis (76.5%), genital atrophy (52.9%), airsacculitis (47.1%), fibrinous rhinoconjunctivitis and hepatic alterations (41.2%) (p<0.05). The hematological analysis showed lower values of hemoglobin (8.9 g/dl), hematocrit (29.7%) and total leukocytes (9.9×103/mm3) with increase of heterophils (18.2%) in ill animals in comparison with the healthy ones. It is concluded that in CRD affected fowls respiratory lesions are predominant and hematological values are affected.

Key words: chronic respiratory disease, hematology, anatomopathological lesions, White Leghorn

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INTRODUCCIÓN

La enfermedad respiratoria crónica (ERC) es considerada como una enfermedad infectocontagiosa de etiología multifactorial (factores predisponentes) y multietiológica (agentes infecciosos virales, bacterianos y micóticos) y constituye una de las enfermedades más importantes dentro del grupo de las respiratorias, porque ocasiona grandes pérdidas económicas en la industria avícola moderna (Bradbury y Morrow, 2008; Sánchez y Lamazares, 2010).

Los hallazgos clínicos-anatomopatológicos observados en las aves son de variable severidad, debido a la participación de los factores predisponentes (Sánchez y Lamazares, 2010) y de la virulencia de los agentes microbianos que participen en el proceso, como los virus inmunosupresores en asociación con micoplasmas y Ornithobacterium rhinotracheale (Babaahmady et al., 2002; Merino, 2008).

Los principales signos clínicos descritos en la ERC son estertores traqueales y secreción nasal catarral bilateral (Bradbury y Morrow, 2008; Sánchez y Lamazares, 2010). Otros autores refieren signos severos (disnea, exudado nasal, tos, palidez de la cresta y barbillas, plumas erizadas y disminución del consumo de alimento con pérdida de peso) cuando ocurren infecciones mixtas por Avibacterium paragallinarum, O. rhinotracheale, Pasteurella sp, Bordetella avium, Escherichia coli, virus de la Bronquitis Infecciosa (BI), cepas de baja patogenicidad de la Enfermedad de Newcastle y de Influenza Aviar (El-Sukhon et al., 2002; Thachil et al., 2009).

Según Lobo et al. (2006), Muñoz et al. (2006) y Bradbury y Morrow (2008), las principales lesiones macroscópicas causadas por infecciones con Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae y M. pullorum son la presencia de exudado mucoso y hemorragias en los senos nasales e infraorbitarios, laringe y tráquea. También se ha observado exudado fibrinoso que puede llegar hasta el acúmulo caseoso en las vías respiratorias superiores e inferiores, causado por infección simultánea de E. coli asociada a micoplasmas, O. rhinotracheale, B. avium y virus de la BI (Cavanagh, 2003; Spears et al., 2003; Van Empel, 2008; Sánchez y Lamazares, 2010). Se señala, en otros órganos, pericarditis fibrinopurulenta, hepatitis purulenta, peritonitis, salpingitis, atrofia genital y tendosinovitis (Lobo y Roche, 2000; Lobova et al., 2012).

Estas lesiones pueden llegar a causar anemia. Olson et al. (1968) refieren que la anemia puede estar asociada con enfermedades agudas y crónicas que suprimen la eritropoyesis u ocasionar la destrucción tóxica de los eritrocitos. Asimismo, Sturkie (1986) y Campbell (1995) indicaron que la edad, sexo, estación del año, producción de huevos, condiciones ambientales y agentes microbianos influyen sobre la composición de la sangre. En este sentido, los cambios hematológicos ante las diversas situaciones clínicas no han sido debidamente estudiados en Cuba, especialmente aquellas referidas a las aves domésticas con ERC. De allí que el presente estudio se trazó como objetivo determinar los valores hematológicos y las lesiones anatomopatológicas en gallinas White Leghorn afectadas por la ERC.

MATERIALES Y MÉTODOS

Tamaño, Selección y Toma de Muestra

El estudio se realizó en una unidad de gallinas ponedoras (n = 65 045) con foco activo de ERC (1% de prevalencia), ubicada en la provincia Mayabeque de la región occidental de Cuba, donde se encuentra la mayor concentración de esta categoría de aves. La zona se encuentra a 50 msnm, con temperatura de 23 °C y humedad relativa de 75%.

Se efectuó un muestreo tendencioso que comprendió 34 aves White Leghorn de 32 semanas de edad, siendo 17 con ERC (grupo afectado) y 17 sin manifestaciones clínicas (grupo sano). Los animales recibieron el alimento concentrado balanceado normado, mientras que el agua de bebida fue suministrada a libertad.

Las aves fueron vacunadas según el programa de vacunación vigente en Cuba (Cuadro 1). Todas las gallinas ponedoras afectadas por la ERC manifestaron alguna forma clínica como disnea profusa, estertores, secreción nasal catarral bilateral, tumefacción facial en algunos casos con pérdida de la visión, además de palidez de la cresta y barbillas.

Las muestras de sangre para la evaluación hematológica se tomaron con jeringuilla de 5 ml y aguja 21 G, por punción de la vena yugular. Se recolectaron en tubos estériles de 0.5 ml que contenían EDTA como anticoagulante (Microtainer®) y con previa antisepsia de la zona de extracción con alcohol al 70%. Las muestras fueron trasladadas al Laboratorio Clínico de la Dirección de Toxicología y Experimentación Animal del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) y procesadas dentro de las cuatro horas de extraídas.

Exploración Clínica y Necropsia

Se realizó la exploración clínica y la necropsia según la metodología descrita por Sánchez y Lamazares (2010). El estudio macroscópico incluyó todos los órganos y el estado físico de las aves. Se registraron los resultados de todos los animales en los dos grupos en estudio.

Aislamiento e Identificación de Bacterias

Se hizo la detección de agentes bacterianos en todas las aves mediante procedimientos bacteriológicos.

Bacterias

Las muestras de exudados de senos paranasales, tráquea y pulmón se colectaron en microtubos de 1.5 ml que contenían 500 μl de PBS estéril. Los fragmentos de senos infraorbitarios y tráquea-pulmón se colocaron en tubos estériles. Las muestras de exudados y de órganos se sembraron en agar sangre, agar chocolate y agar MacConkey, todos procedentes del Centro Nacional de Biopreparados (BioCen). Las placas inoculadas se incubaron a 37 °C durante 48-72 h en presencia de CO2 (Genbox, Oxoid) y en condiciones de aerobiosis.

La identificación de las bacterias se realizó según las características culturales (morfología, tamaño, elevación y coloración de las colonias), empleando las pruebas de tinción de Gram, las pruebas bioquímicas como oxidasa (Oxoid), y los sistemas API 20NE y 20E (BioMérieux) (Hirsh et al., 2004).

Micoplasmas

Los exudados de senos paranasales, tráquea, pulmón y sacos aéreos se depositaron en dos tubos de cultivo que contenían 2.5 ml de medio Micoplasma Base caldo con rojo fenol como indicador de pH. Uno de ellos se incubó a 37 ºC en condiciones de aerobiosis y microaerofilia con una atmósfera de 0.5% de CO2 durante 21 días. El segundo tubo se utilizó para la extracción de ADN.

A partir de los cultivos que mostraron cambios de color, se sembraron 100 μl en medios sólidos Micoplasma Base y se incubaron en las condiciones de aerobiosis y microaerofilia mencionadas anteriormente. Se observó la presencia de colonias típicas de micoplasmas con apariencia de ‘huevo frito’ con la ayuda de un microscopio óptico (Opton) de luz ordinaria a 400X.

Para el aislamiento de las colonias crecidas se cortó un bloque de 1 cm2 de las placas, se transfirieron a 2.5 ml de medio Micoplasma Base, y se incubaron hasta la aparición de cambio de color, como se describió anteriormente, y nuevamente se sembró en medio sólido. Este procedimiento se repitió hasta la obtención de colonias aisladas. Finalmente, se tomó 1 ml del cultivo para la identificación de M. gallisepticum mediante la prueba bioquímica de reducción de tetrazolium (Hirsh et al., 2004) y PCR especie específico (García et al., 2005).

Identificación Molecular

La identificación de O. rhinotracheale y M. gallisepticum se realizó mediante la PCR con cebadores específicos para fragmentos de genes conservados en cada una de estas entidades, siguiendo las metodologías descritas por Van Empel (1998) y García et al. (2005). El ADN de las bacterias se purificó según la metodología descrita por Espinosa et al. (2011).

La extracción del ADN de Mycoplasma sp se realizó a partir de muestras de exudados de senos paranasales, tráquea, pulmón y sacos aéreos. Estas fueron colocadas en 1 ml de PBS estéril, según la metodología de lisis física por calentamiento descrita por Fernández y Chávez (1999). Se empleó como control positivo el ADN de una cepa S6 de M. gallisepticum que forma parte de la colección del laboratorio MYCOLAB del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA).

Los productos de la amplificación de la PCR se revelaron por electroforesis de ADN en gel de agarosa al 2% (Sigma), con el uso de un marcador de peso molecular de 100 pb (Bio-Rad). Las corridas se realizaron a 100 v y 50 mA por 35 min en cámara de electroforesis 2012 Maxiphor (LKB Bromma) con buffer TBE 0.5X, teñido con bromuro de etidio (0.5 μg/ml). Se empleó un transluminador de luz ultravioleta MacroVue (Pharmacia) para visualizar los productos amplificados.

Evaluación Hematológica

Se determinaron las variables hematológicas de hemoglobina, hematocrito, y cuenta total y diferencial de leucocitos. Adicionalmente se realizó la evaluación de la morfología celular. Para el conteo leucocitario (GB) se utilizó como diluyente la Solución Natt y Herrick referida por Campbell (1995). Se hizo el recuento total de leucocitos presentes en 9 mm3 del hemocitómetro o cámara de Neubauer y el empleo de la fórmula siguiente: Total GB contados + 10% de los GB × 200 = GB por microlitro (Campbell, 1995).

Análisis Estadístico

Primeramente se verificaron si los datos (variables hematológicas) seguían una distribución normal (método de Kolmogorov- Smirnov) y si cumplían con la homogeneidad de varianza (prueba de Levene). Al no seguir estos una distribución normal, se realizó la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis para la comparación de medias (enfermos vs. sanos), y la prueba T de Student para las medias de aves positivas vs. negativas a O. rhinotracheale, M. gallisepticum y E. coli, apoyado por el paquete estadístico InfoStat v. 2.0.

Se realizaron comparaciones de proporciones individuales entre los microorganismos aislados y entre las lesiones macroscópicas observadas (enfermos). Se utilizó la Dócima de Duncan para evidenciar las diferencias entre las variables estudiadas con el empleo del programa COMPAPRO v. 2.1. Para todos los casos se consideró una p<0.05 como significación estadística en el análisis de los resultados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de la PCR confirmaron la presencia de O. rhinotracheale en tres aves (Figura 1) y M. gallisepticum en 12 aves (Figura 2).

En el Cuadro 2 se evidencia la presencia de O. rhinotracheale en infecciones simultáneas con M. gallisepticum y E. coli. Sin embargo, se encontraron aislados de M. gallisepticum sin asociación con otras bacterias, como también se demostró para el caso de E. coli.

En los casos donde se presentó el aislamiento de O. rhinotracheale en presencia de M. gallisepticum y E. coli se observaron lesiones macroscópicas en el sistema respiratorio debido a la inducción de estos agentes microbianos. La presentación de estas lesiones depende de la virulencia particular de cada uno de ellos, unido a las deficientes condiciones de bioseguridad de las instalaciones y del manejo de las aves que propician el estrés en las mismas (Reinhardt et al., 2005; Rahimi y Bahami, 2007; Sánchez y Lamazares, 2010).

Entre las lesiones macroscópicas que se apreciaron en las vías respiratorias superiores de las aves afectadas por la ERC, se destaca de manera significativa la traqueítis catarral, en comparación con la rinitis serosa, catarral y mucofibrinosa; sin embargo, no difiere de la rinoconjuntivitis fibrinosa (Cuadro 3).

La traqueítis catarral y rinitis catarral se presentan ante un estímulo causado por las bacterias en el sistema mucociliar de las aves afectadas por la ERC. El epitelio de las vías aéreas superiores (nasal y traqueal) constituye la línea de defensa principal, el cual posee dos mecanismos importantes, el celular (epitelio respiratorio) y el mecánico (sistema o escalador mucociliar), que impide la entrada de los agentes patógenos y partículas al hospedero (Zekaria, 2005).

La presencia de la rinitis mucofibrinosa y rinoconjuntivitis fibrinosa indicó el carácter crónico de la enfermedad debido a la infección mixta por M. gallisepticum, O. rhinotracheale y E. coli. Estos agentes microbianos están considerados como inductores de exudado de naturaleza fibrinosa mezclado con mucus. Barnes et al. (2003) y Sydenstricker et al. (2006) señalan que esta respuesta exudativa está presente en infecciones crónicas causadas por estos agentes microbianos que ingresan a través de los aerosoles.

La aerosaculitis se caracterizó por alteraciones que variaron desde la opacidad de los sacos aéreos hasta la exudación fibrinosa. La aerosaculitis fibrinosa observada en el presente estudio fue similar a la referida por Boado et al. (1988). En ese estudio epidemiológico, clínico y anatomopatológico de la ERC se encontraron tres grados de presentación de la aerosaculitis crónica fibrinosa y la clasificaron como leve (1.6%), media (10.5%) y grave (57.9%).

La caquexia y la atrofia serosa de la grasa coronaria observadas en el presente estudio están descritas como lesiones resultantes de alteraciones en el metabolismo de los lípidos en los procesos consuntivos de la desnutrición, tras la inapetencia ocasionada por la infección mixta con varios agentes infecciosos que ingresan en el organismo ante situaciones de estrés, muy particular en esta categoría estudiada. Lo anterior coincide con lo planteado por Chamizo (2009), quien refiere a estas alteraciones fisiopatológicas asociadas con procesos crónicos.

La esplenomegalia se caracterizó por una hiperplasia de la pulpa blanca. Este hallazgo puede tener su origen por la infección con E. coli. Asimismo, la atrofia genital pudo deberse a la infección mixta y persistente por M. gallisepticum y E. coli identificadas en estas aves. Por otro lado, los animales aparentemente sanos no evidenciaron lesiones en órganos y sistemas en la necropsia.

Aunque existe una gran variabilidad en los reportes de valores hematológicos de las aves en general, el hematocrito, la hemoglobina y los leucocitos son característicos de cada individuo y dependen en gran medida del método utilizado para su estimación (Sturkie, 1986).

Los valores de hemoglobina y leucocitos totales observados (Cuadro 4) se encontraron dentro del rango fisiológico descrito para esta especie (Bounus y Tedman, 2000), pero con considerables diferencias entre las aves afectadas por la ERC y las clínicamente sanas. El número total de leucocitos fue muy similar a los hallazgos obtenidos por Samour (2006) con valores de 1.9 a 9.5×103/mm3 y Tarun et al. (2011) con 10.6×103/mm3. Asimismo, los valores de hemoglobina fueron similares a los reportados por Samour (2006) en Gallus domesticus con 10.2-15.1 g/dl, Martínez et al. (2012) en gallinas White Leghorn de 30 semanas de edad (9.1 g/dl), y por Ajakaiye et al. (2010), quienes obtuvieron en Cuba valores de 8.9 g/dl en esta raza ligera pero con 39 semanas de edad.

En el caso del hematocrito se evidenció una diferencia estadística (p<0.05) entre los dos grupos de aves (Cuadro 4), aunque ambos promedios se encuentran circunscritos en el rango fisiológico (22-35%) notificado por Bounus y Tedman (2000). Asimismo, estos resultados fueron similares a los reportados por Samour (2006) con valores de 30 a 49%, Ajakaiye et al. (2010) con 29.3% y Martínez et al. (2012) con 29%.

En relación con la evaluación diferencial de los leucocitos se encontraron diferencias estadísticas (p<0.05) entre los grupos de aves (Cuadro 5), donde los valores de heterófilos fueron superiores en las aves afectadas por la ERC. Los valores de las aves clínicamente sanas fueron similares al valor de 7.6% de heterófilos reportado por Samour (2006) y al de 10.7% en gallinas White Leghorn de 21 semanas de edad según Cheng et al. (2001).

Los valores predominantes de heterófilos observados en los animales afectados por la ERC, es un indicador de infección de origen bacteriano como se pudo demostrar tras el aislamiento e identificación de O. rhinotracheale, M. gallisepticum y E. coli (Figuras 1 y 2, Cuadro 2), pues estos constituyen la línea de defensa fundamental contra bacterias (Bounus y Tedman, 2000).

Los valores de linfocitos (Cuadro 5) fueron similares a los obtenidos por Hester et al. (1996) con 71.5% en gallinas White Leghorn de 33 semanas de edad, así como a los reportados por Cheng et al. (2001) con 83.4% en esta raza pero con 21 semanas de vida. Estos hallazgos también coinciden con Bounus y Tedman (2000), quienes indicaron en leucogramas normales el predominio de los linfocitos en sangre circulante, seguidos en orden por los heterófilos, monocitos, eosinófilos y basófilos. Es por ello, que en este conteo diferencial no se observaron basófilos ni eosinófilos en las 100 células analizadas por ave en ambos grupos.

Los valores de monocitos fueron similares en ambos grupos (Cuadro 5) y circunscritos dentro del rango descrito por Samour (2006) para Gallus domesticus (0-1%), aunque se ha observado un valor de 2.6% en otro reporte en gallinas White Leghorn con 21 semanas de edad (Cheng et al., 2001).

Al analizar las variables hematológicas y su relación estadística con las entidades microbianas aisladas en las gallinas afectadas por la ERC (Cuadro 6), se evidenció que los bajos valores medios de hemoglobina y hematocrito estuvieron asociados en orden de importancia con la presencia de M. gallisepticum y E. coli; mientras que los elevados niveles de heterófilos estuvieron relacionados en orden significativo con la presencia de E. coli, O. rhinotracheale y M. gallisepticum, como ya se señaló anteriormente.

En otro sentido, los valores de leucocitos totales y monocitos no se afectaron con la presencia de las bacterias identificadas. Asimismo, no se evidenciaron alteraciones hematológicas en la evaluación de la morfología celular.

Se concluye que en las aves afectadas por la ERC predominan las lesiones respiratorias y se afectan los valores hematológicos.

LITERATURA CITADA

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Recibido: 27 de noviembre de 2014

Aceptado para publicación: 25 de agosto de 2015