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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

Print version ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.27 no.4 Lima Oct./Dec. 2016

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v27i4.12564 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

Efecto de formulaciones acuosas y aceitosas de 13 aislamientos nativos de Beauveria Bassiana (Ascomycota) sobre Rhodnius Prolixus (Triatominae) bajo condiciones experimentales

Effect of aqueous and oil-based formulations of 13 native isolates of Beauveria Bassiana (Ascomycota) on Rhodnius Prolixus (Triatominae) under experimental conditions

 

Dalmiro Cazorla Perfetti1,2, Pedro Morales Moreno1

1 Laboratorio de Entomología, Parasitología y Medicina Tropical (L.E.P.A.M.E.T.), Centro de Investigaciones Biomédicas (C.I.B.), Universidad Nacional Experimental «Francisco de Miranda» (UNEFM), Estado Falcón, Venezuela

2 E-mail: lutzomyia@hotmail.com, cdalmiro@gmail.com


RESUMEN

El triatomino Rhodnius prolixus es el principal vector de la enfermedad de Chagas en Venezuela. En el presente estudio se evaluó el efecto de formulaciones de conidias con base acuosa y aceitosa (soya 50%) de 13 aislamientos nativos del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana (Fungi: Ascomycota) en ninfas estadio IV del triatomino Rhodnius prolixus. Se utilizó una concentración de 1x107 conidias/ml bajo condiciones de laboratorio (26 °C, HR >90%). Las suspensiones se aplicaron por inmersión. La mortalidad y la conidiación se evaluaron diariamente durante 24 días. Los resultados mostraron que las suspensiones de conidias aceitosas fueron significativamente más eficientes que las acuosas al incrementar la mortalidad y eficacia y disminuir el TL50 de los aislamientos (p<0.05). En todos los bioensayos, los porcentajes de esporulación en los cadáveres de las ninfas fueron elevados (>88%). Los aislamientos LF14 y LF13 mostraron los mayores porcentajes de mortalidad acumulada, eficacia y menores TL50, tanto en formulaciones acuosas como en las aceitosas. Estos aislamientos de B. bassiana aparecen como buenos candidatos para ser probados a nivel de campo en futuros programas de manejo biorracional de los vectores de la enfermedad de Chagas.

Palabras clave: control biorracional, Beauveria bassiana, enfermedad de Chagas, Rhodnius prolixus, formulaciones aceitosas


ABSTRACT

Rhodnius prolixus is the main vector of Chagas disease in Venezuela. The present study aimed to evaluate the effect of aqueous and 50% soy bean oil-based formulations (1x107 conidia/ml) of 13 native Beauveria bassiana (Fungi: Ascomycota) isolates on fourth instar nymphs of Rhodnius prolixus. The conidial suspension were used under laboratory conditions (26 ºC; RH >90%). The treatment was by immersion and mortality and conidiation were evaluated daily for 24 days. The results showed that the fungal soy-bean oil formulations tested were more effective than the aqueous suspension, as attained significantly higher mortality and efficacy percentages and decreased LT50 in the 13 isolates (p<0.05). In all bioassays, the percentages of sporulation on fungus-killed cadavers of nymphs were elevated (>88%). LF14 and LF13 isolates showed a higher percentage of accumulated mortality, efficacy and a lowest LT50 in aqueous formulations as well as in oil-based ones. These B. bassiana isolates appears to be considered as good candidates to be tested under field conditions in biorational control programmes for Chagas disease vectors.

Key words: biorational control, Beauveria bassiana, Chagas disease, Rhodnius prolixus, oil-based formulations


INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana se encuentra entre una de las más temibles enfermedades metaxénicas, calculándose entre 7 y 8 millones de personas infectadas, así como más de 25 millones de personas en riesgo de infección por el hemoprotozoario flagelado Trypanosoma cruzi, su agente causal. En el control de esta enfermedad, además de los problemas de salud que ocasiona en la población, se debe tener en cuenta la enorme carga social que representa, especialmente para los países de América Latina (OMS, 2014).

Se reconocen varias vías para su adquisición, incluyendo la transfusional; sin embargo, la transmisión natural más frecuente es a través de las heces de los vectores triatominos, de los cuales existen alrededor de 145 especies. Estos insectos son de hábitos hematófagos y mayormente se encuentran distribuidos en el continente americano (Gonçalves et al., 2013; OMS, 2014).

En virtud de que hasta el presente no existe una vacuna contra la enfermedad de Chagas y las drogas en uso poseen una limitada efectividad y efectos colaterales, el método más eficaz, rápido y práctico para su prevención en América Latina es el control de los vectores mediante la aplicación en las viviendas de insecticidas residuales de origen químico (Pedrini et al., 2009; OMS, 2014). Actualmente se viene utilizando formulaciones de insecticidas basados en piretroides sintéticos de tercera generación (Pedrini et al., 2009). Sin embargo, la aplicación de estos agentes químicos también posee inconvenientes por los efectos tóxicos potenciales sobre la salud humana y animal, así como la contaminación de los ecosistemas en general (ecotoxicidad) (Cook et al., 1996; He et al., 2008). Asimismo, insecticidas como los piretroides afectan al sistema nervioso central y periférico (neurotoxicidad) y han sido asociados con enfermedades degenerativas como el mal de Parkinson y varios tipos de cáncer como las leucemias en niños (Roberts y Karr, 2012).

Otro de los inconvenientes del uso de pesticidas de origen químico está referido a la aparición de poblaciones triatominas resistentes a los insecticidas, producto de su aplicación inadecuada o indiscriminada, y por la biología intrínseca del vector (fenómeno preadaptativo de pocos individuos) (Zerba, 2004; Pedrini et al., 2009). En el caso de Rhodnius prolixus, principal vector de la enfermedad de Chagas en Venezuela, se ha detectado resistencia hacia carbamatos, piretroides, organofosforados y organoclorados (Zerba, 1999; Vassena et al., 2000; Molina de Fernández et al., 2004). Este fenómeno trae como consecuencia que se tengan poblaciones de triatominas fuera de control y que exista un aumento en el uso y frecuencia del químico, con el subsecuente impacto sobre el ambiente, la salud pública y la biósfera (Zerba, 2004; Pedrini et al., 2009).

Ante esta problemática, surge la necesidad de buscar nuevas estrategias de control enmarcadas dentro de un esquema de Manejo Integrado de Plagas (MIP), más aún cuando se sabe que los principales vectores de Chagas, como R. prolixus, no son estrictamente domiciliarios. En este sentido, se ha usado con éxito, tanto a nivel experimental como de campo, hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae (Ascomycota: Hipocreales) (Luz et al., 2004; Pedrini et al., 2009).

Los hongos son organismos que dependen de numerosos factores, tanto bióticos como abióticos, que pueden determinar o influenciar su acción patógena sobre los insectos. Estos incluyen la cepa (aislamiento) o especie de hongo, estado fisiológico del hospedador, microorganismos cuticulares y epicuticulares, y otros factores diversos como los de tipo ambiental (temperatura, humedad relativa [HR], luz, radiación UV) (Goettel y Inglis, 1997; Pedrini et al., 2009). Es por ello que se recomienda ensayar con aislamientos o cepas nativas adaptadas a las condiciones locales, las cuales pudieran exhibir una mejor capacidad patogénica y de virulencia (Goettel y Inglis, 1997; Vázquez-Martínez et al., 2014), así como ensayar formulaciones fúngicas con sustancias como aceites minerales o vegetales, que protegen a las conidias de altas temperaturas, resequedad y radiaciones UV (Luz et al., 2004).

En el presente trabajo se evalúa, bajo condiciones de laboratorio, el efecto entomocida de 13 aislamientos nativos de B. bassiana en bases acuosa y aceitosa sobre ninfas IV de R. prolixus.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamientos Fúngicos

Los ensayos se hicieron con 13 aislamientos de B. bassiana (LF01, LF02, LF03, LF04, LF06, LF07, LF08, LF09, LF10, LF11, LF12, LF13 y LF14), de la micoteca del Laboratorio de Fitopatología (LF), Núcleo Universitario «Rafael Rangel» (NURR), Universidad de Los Andes, Trujillo, Venezuela. La procedencia de estos aislamientos fue indicado en un trabajo previo (Cazorla y Morales, 2010).

Insectos

Los triatominos se criaron en masa en el insectario del Laboratorio de Entomología, Parasitología y Medicina Tropical (LEPAMET), Centro de Investigaciones Biomédicas (C.I.B.), Universidad Nacional Experimental «Francisco de Miranda» (UNEFM), Coro, Venezuela, alimentándose sobre gallina cada 1-2 semanas. Se mantuvieron a una temperatura promedio de 26.1 °C (24-30 °C) y a una HR promedio de 62.4% (58-67%), con una fotofase de 12 horas. Los ensayos se hicieron con colonias de la especie R. prolixus, empleándose ninfas estadio IV recién emergidas o alimentadas.

Reactivación de los Aislamientos Fúngicos

Los 13 aislamientos fúngicos permanecieron entre 12 y 18 meses en medios de cultivo Sabouraud-agar (25 g de glucosa, 10 g de peptona, 20 g de agar y 1000 cc de agua destilada), de allí que fueron reactivados en ninfas IV y V de R. prolixus antes de iniciar los bioensayos. Una vez que la micosis se desarrolló sobre los cadáveres de los insectos, el micelio fue sembrado en medio Sabouraud, a partir de los cuales se desarrollaron los bioensayos del estudio.

Formulaciones Acuosas

Las conidias se obtuvieron removiendo, mediante asa de platino, la superficie de cultivos esporulados de 15 días desarrollados sobre medio sólido (Sabouraud-agar), y mantenidos a 26 °C y HR >90% en cámara de ambientación o climatizada (Biotronette Mark II 84, Lab Line Instruments, EEUU). El material fúngico cosechado fue suspendido en agua destilada estéril con 0.1% Tween® 20 (monolaurato de sorbitán de polietileno) (Fisher Scientific, EEUU) y filtrado a través de gasa para separar el micelio de las conidias. La suspensión acuosa de conidias fue ajustada mediante hemocitómetro (Nebauer improved, Marienfeld, Alemania) a 1x107conidias/ml (Goettel y Inglis, 1997) y utilizada de inmediato.

Formulaciones Aceitosas

El inóculo fúngico de 1x107 conidias/ml fue preparado en solución con 49% de suspensión acuosa, 50% aceite comestible estéril de soya (Diana®, Industrias Diana, Venezuela) y 1% Tween® 20.

Bioensayos

Las ninfas se sumergieron por 5-6 s en las suspensiones descritas. En cada caso se utilizaron cuatro réplicas de 20 insectos. El grupo control se trató con agua destilada con 0.1% Tween 20 en las formulaciones acuosas y con agua destilada, 1% Tween 20 y 50% aceite comestible estéril de soya en las formulaciones aceitosas.

Una vez aplicada la suspensión de conidias, los insectos fueron secados durante 10-15 min, transferidos a envases de vidrio transparentes (60 mm de diámetro x 140 mm) que contenían papel filtro en forma de abanico, y se taparon con gasa. Los envases se mantuvieron en oscuridad en cámara de ambientación o climatizada ajustada a 26 ºC y HR >90%, i.e., cercana a la saturación.

La mortalidad fue chequeada diariamente durante 24 días. Los insectos muertos se removieron diariamente y se transfirieron a cámaras húmedas para observar la esporulación del hongo en las mismas condiciones del experimento. Se asumió que la causa de muerte era debida a la acción patógena de B. bassiana (Figura 1A), cuya morfo-taxonomía se verificaba coloreándose en placas con azul de lactofenol (Figura 1B) (Romaña y Fargues, 1992; Vásquez et al., 2005).

Análisis Estadístico

Se hizo un análisis de supervivencia teniendo en cuenta los métodos no paramétricos de producto-límite de Kaplan-Meier y la prueba generalizada de Gehan-Wilcoxon (Kaplan y Meier, 1958; Gramatges, 2002). Asimismo, se calculó el TL50 (tiempo letal 50) que corresponde a la mediana o percentil 50 (Beltrán et al., 2008).

Se determinó el porcentaje de eficacia de cada aislamiento mediante la fórmula de Schneider-Orelli, citada por Carrillo (1973), la cual corrige los efectos de la mortalidad natural, permitiendo determinar la verdadera eficacia de los tratamientos. Porcentaje de eficacia = [(b-k)/(100-K) x100], donde «b» equivale al porcentaje de individuos muertos en el tratamiento y «k» equivale al porcentaje de individuos muertos en el testigo.

Adicionalmente, se utilizó el análisis de varianza y el de comparación múltiple de Student-Newman-Keusl (SNK) para evidenciar diferencias entre tratamientos. Se consideró como significativo una probabilidad de p<0.05. Los datos se analizaron con los paquetes estadísticos Minitab v. 13.20 y STATISTICA.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al determinarse la acción biocontroladora de los 13 aislamientos de B. bassiana con base acuosa sobre las ninfas IV de R. prolixus, se encontró que los mayores porcentajes de mortalidad acumulada, eficacia y menores TL50 fueron causados por los aislamientos LF14 y LF13 (97.5, 97.5 y 5; 96.3, 96.3 y 6, respectivamente). Por contraste, los aislamientos LF03 y LF02 obtuvieron los menores porcentajes de mortalidad acumulada y eficacia (13.8, 13.8 y 47.5, 47.5, respectivamente), sin llegar a alcanzar el 50% de mortalidad en los insectos (Cuadro 1, Figura 2). Los porcentajes de esporulación en los cadáveres de las ninfas fueron superiores a 88% cuando los insectos se expusieron a todos los aislamientos.

En la comparación entre las formulaciones acuosas y las de base aceitosa se aprecia que, en general, hubo una mejoría significativa con la adición del aceite, en términos de mayores porcentajes de mortalidad y eficacia, y en la reducción del TL50.

Así por ejemplo, LF03 en la formulación acuosa se obtuvo 13.8 y 13.8% de mortalidad y eficacia, respectivamente (Cuadro 1), mientras que con la adición del aceite de soya estos valores fueron de 72.5 y 72.5%, respectivamente (p<0.000) y el TL50 disminuyó a 8 días (Cuadro 2).

El análisis de la acción entomocida de los 13 aislamientos de B. bassiana aplicados con mezcla de aceite de soya al 50% sobre las ninfas IV de R. prolixus, indica que los aislamientos LF03 y LF01 presentaron los menores porcentajes de mortalidad acumulada y eficacia (72.5, 72.5% y 76.3 y 76.3%, respectivamente) (Cuadro 2, Figura 3); sin embargo, al analizar el TL50 se tiene que los aislamientos LF03 y LF08, así como LF04 y LF06 exhibieron los mayores valores, con 8 y 7 días, respectivamente (Cuadro 2). Los análisis estadísticos mostraron que los aislamientos LF06 (Z=-1.11, p=0.130) y LF08 (Z=- 0.29, p=0.400) no presentaron diferencias significativas en mortalidad cuando se compararon los tratamientos con base acuosa y aceitosa (Cuadro 3). Por otro lado, los porcentajes de conidiación fueron mayores de 94% en los cadáveres de las ninfas en todos los aislamientos.

Aunque las ninfas IV de R. prolixus resultaron susceptibles para los 13 aislamientos fúngicos, no obstante, aquellos tipificados como B. bassiana LF14 y LF13 exhibieron las mayores tasas de mortalidad y eficacia, así como los menores TL50. Además, los cadáveres de los insectos presentaron altas tasas de conidiación, constituyéndose en una fuente potencial para la transmisión horizontal (i.e., autodiseminación), lo cual se acentúa si se considera la conducta gregaria característica de los triatominos en los sitios de reposo (Pedrini et al., 2009). Es importante señalar que los altos porcentajes de esporulación obtenidos en las ninfas IV de R. prolixus con la concentración en estudio, sugieren que la dosis de 1x107 permite una mayor producción de oosporeina y de otros antibióticos, ya que no se desarrollaron hongos saprófitos o bacterias oportunistas sobre los cadáveres de los insectos que pudieran inhibir el crecimiento de B. bassiana (Noma y Stickler, 2000). Esto indica que ambos aislamientos fúngicos aparecen como patotipos promisorios para ser ensayados en futuros programas de MIP de la enfermedad de Chagas en el país.

Los aislamientos originales de B. bassiana LF14 y LF13 fueron obtenidos a partir de cadáveres de insectos del orden Coleóptera (Cazorla y Morales, 2010), por lo que su patogenicidad sobre las ninfas IV de R. prolixus puede considerarse como inespecífica. Más aún, ambos aislamientos fueron más virulentos hacia las ninfas de R. prolixus que los aislamientos LF01 y LF07, aislados originalmente de cadáveres esporulados de triatominos, y particularmente de R. prolixus en el caso de LF01. Esto sugiere que la especificidad «hospedadorpatógeno » no fue tan estricta como fue observada en otro estudio donde solo las cepas aisladas de Hemípteros resultaron altamente patogénicas para R. prolixus (Romaña y Fargues, 1987).

Pineda et al. (2003) expusieron ninfas V de R. palllescens, vector de T. cruzi en Colombia (Guhl et al., 2007), a la acción de cuatro aislamientos de Beauveria spp. Estos autores detectaron que los triatominos fueron más susceptibles a la cepa B. brongniartii Bt UdeA, la cual se aisló a partir de coleóptero, en tanto que las otras cepas fueron obtenidas de R. pallenscens o de insectos- coleópteros. Asimismo, Lecuona et al. (2001) hallaron en Argentina cepas de B. bassiana más virulentas para Triatoma infestans, principal vector de la enfermedad de Chagas en el Cono Sur (OMS, 2014), que para sus hospedadores-artrópodos de origen: Nezara viridula (Hemiptera: Pentatomidae) y Diatraea saccharalis (Lepidoptera). Por otro lado, Luz et al. (1998) trabajaron con T. infestans ensayando 23 aislamientos de B. bassiana obtenidos inicialmente de varios órdenes de insectos, y encontraron que a 50% de HR, los cuatro aislamientos de mayor eficacia entomocida provenían de especies de insectos del orden Hemíptera.

La literatura científica muestra una tendencia a desarrollar formulados con hongos entomopatógenos de bases aceitosas (Bateman et al., 1993; Bateman, 1997). Las conidias contenidas en formulaciones aceitosas poseen ventajas comparativas con respecto a las formuladas en base acuosa. El aceite brinda a los propágulos fúngicos protección potencial contra las altas temperaturas, la resequedad y los efectos deletéreos de la radiación ultravioleta (UV). Asimismo, además de incrementar la adhesión a la cutícula y las membranas intersegmentales lipofílicas, interfiere con la defensa natural de la cutícula y ayuda a dispersar el inóculo sobre el cuerpo de los artrópodoshospedadores (Bateman et al., 1993; Bateman, 1997; Moslim et al., 2004; Luz y Batagin, 2005). En el caso de los triatominos, cuyos hábitos hematofágicos hace que la manera más práctica para la invasión de las conidias sea mediante la penetración cuticular (Luz et al., 1998; Cazorla 2011), obliga que ensayen formulaciones fúngicas que ayuden a la penetración y degradación de la cutícula de estos artrópodos-hospedadores.

En forma general, los resultados del presente estudio demuestran que la adición de aceite de soya (50%) a las formulaciones fúngicas mejoraron significativamente la actividad entomocida sobre ninfas IV de R. prolixus, cuando se compara con la acción obtenida con las formulaciones acuosas; resultados que concuerdan con otros estudios (Luz et al., 2004; Luz y Batagin, 2005). Esto es alentador y promisorio, toda vez que en Argentina se ha detectado que un incremento en el grosor de la cutícula de T. infestans está asociado con la resistencia de sus poblaciones a los piretroides (Pedrini et al., 2009); pues al contar con aislamientos nativos de B. bassiana que sean capaces de degradar eficientemente la cutícula de poblaciones de R. prolixus resistentes a los piretroides, es una ventaja que debe explotarse. Asimismo, es importante acotar que el aceite de soya no interfiere con la capacidad germinativa in vitro de las conidias de estos 13 aislamientos (Cazorla, 2010).

Como bien lo señalan Luz y Batagin (2005), faltan realizar estudios para mejorar las formulaciones fúngicas y las técnicas de aplicación, lo que abriría nuevas posibilidades de controlar de una manera permanente a las poblaciones triatominas, especialmente en los ambientes peridomiciliares.

CONCLUSIONES

  • Las formulaciones aceitosas de los 13 aislamientos del hongo entomopatógeno B. bassiana mejoraron de una manera global la eficiencia sobre ninfas IV de R. prolixus.

  • Los patotipos LF13 y LF14 presentaron los mayores porcentajes de mortalidad acumulada, eficacia y menores TL50.

LITERATURA CITADA

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Recibido: 29 de febrero de 2016

Aceptado para publicación: 18 de julio de 2016