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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versão impressa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.28 no.2 Lima abr./jun. 2017

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v28i2.13075 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

Análisis Genómico de Mannheimia haemolytica Serotipo A2 para la Identificación de Potenciales Candidatos Vacunales contra la Neumonía en Alpacas

Whole-Genome Analysis of Mannheimia Haemolytica Serotype A2 to Identify Potential Vaccine Candidates Against Acute Pneumonia in Alpacase

 

Eduardo Juscamayta L.1,3, Lenin Maturrano H.1,2, Raúl Rosadio A.1

1 Sección de Biología y Genética Molecular, Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria

2 Laboratorio de Zootecnia y Producción Agropecuaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

3 E-mail: ejuscamaytal@gmail.com


RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue identificar antígenos inmunoprotectivos en la secuencia genómica de Mannheimia haemolytica serotipo A2 Ovino, aislado de ovino y disponible en las bases de datos, que puedan ser utilizados como potenciales candidatos vacunales contra la neumonía en alpacas. Para ello, se empleó la secuencia completa del genoma de este microorganismo disponible en las bases de datos y mediante el uso de herramientas bioinformáticas se procedió a la búsqueda e identificación de genes candidatos, la anotación funcional, la predicción de la localización subcelular y la identificación de motivos de secuencias, incluyendo dominios transmembrana, peptidos señal de secreción y lipoproteínas. Los factores de virulencia fueron identificados en la base de datos de factores de virulencia (VFDB) y en la base de datos microbiana de virulencia (MvirDB). Los criterios de selección incluyeron proteínas conservadas, secretadas y asociadas a superficie con hélices transmembrana <1. Se realizó la búsqueda de homología de genes con la base de datos de antígenos protectivos (Protegen), permitiendo la identificación de 23 antígenos potencialmente inmunoprotectivos, conservados entre los serotipos virulentos de M. haemolytica y otros patógenos de la familia Pasteurellaceae. Los genes identificados están relacionados con la patogénesis, virulencia y evasión del sistema immune del hospedero y podrían ser grandes candidatos a ser evaluados como potenciales vacunas contra la pasteurelosis neumónica.

Palabras clave: Mannheimia haemolytica, pasteurelosis neumónica, vacunología reversa, factores de virulencia, candidatos vacunales inmunoprotectivos


ABSTRACT

The aim of this study was to identify immunoprotective antigens in the genomic sequence of Mannheimia haemolytica serotype A2 isolated from sheep and available in databases that can be used as potential vaccine candidates against pneumonia in alpacas. To do this, the complete genome sequence of this organism available in databases was used and by using bioinformatics tools was proceeded to search for and identification of candidate genes, functional annotation, predicting the subcellular localization and identification of sequence motifs including transmembrane domains, secretion signal peptides and lipoproteins. Virulence factors were identified in the database of virulence factors (VFDB) and the microbial database of virulence factors (MvirDB). Selection criteria included conserved proteins, secreted and associated surface with transmembrane helices <1. Homology search of genes was performed with the database of protective antigens (Protegen), allowing the identification of 23 potentially immunoprotective antigens conserved between virulent M. haemolytica serotypes and other pathogens of the family Pasteurellaceae. The genes identified are related to the pathogenesis, virulence and immune system evasion of the host and they could be great candidates to be evaluated as potential vaccines against pneumonic pasteurellosis.

Key words: Mannheimia haemolytica, pneumonic pasteurellosis, reverse vaccinology, virulence factors, vaccine candidates, immunoprotective


INTRODUCCIÓN

Mannheimia haemolytica es una bacteria Gram-negativa, perteneciente a la familia Pasteurellaceae, y principal agente etiológico de la neumonía o pasteurelosis neumónica en bovinos y ovinos. Esta bacteria causa grandes pérdidas económicas en la industria ganadera a nivel mundial (Mohamed y Abdelsalam, 2008; Lawrence et al., 2010), y ha sido asociada, junto con Pasteurella multocida, a casos de neumonía en camélidos sudamericanos domésticos, siendo la segunda causa más importante de mortalidad de alpacas en Perú (Rosadio et al., 2011).

Mannheimia haemolytica comprende 12 serotipos capsulares (Angen et al., 1999), siendo A1 y A6 los serotipos más aislados en casos de procesos neumónicos en bovinos (Davies et al., 2001), en tanto que A2 es en ovinos (Saadati et al., 1997), aunque también se observa un incremento en la prevalencia de los serotipos A5, A6 y A7 (Ewers et al., 2004); sin embargo, se desconoce los serotipos asociados a los casos neumónicos en crías de alpacas.

El uso extensivo de antibióticos como terapia contra la neumonía ha incrementado la incidencia de multidrogoresistencia de M. haemolytica (Kehrenberg et al., 2001), de allí que el control se ha enfocado hacia el desarrollo de vacunas a partir de la identificación de los factores de virulencia, especialmente en bovinos (Zecchinon et al., 2005). Se dispone de vacunas comerciales contra pasteurelosis neumónica para bovinos y ovinos; sin embargo, solo inducen protección a corto plazo contra la infección y no proveen una inmunidad protectiva cruzada contra serotipos heterólogos de M. haemolytica (Lacasta et al., 2015). La falta de vacunas efectivas radica principalmente en la multiplicidad de serotipos de esta bacteria (Gonzalez et al., 2013), las diferencias genéticas y la pobre inmunogenicidad entre los factores de virulencia de cepas de un mismo serotipo (Davies et al., 1997; Davies y Baillie, 2003).

No se dispone actualmente del secuenciamiento del genoma de M. haemolytica aislado de alpacas; no obstante, el secuenciamiento del serotipo A1 (Gioia et al., 2006) y del serotipo A2 (Lawrence et al., 2009), aislados de bovinos y ovinos, respectivamente, ofrecen una nueva estrategia para la identificación de candidatos vacunales, denominada vacunología reversa, que ha permitido el desarrollo de vacunas efectivas, mediant el apredicción de potenciales antígenos utilizando herramientas bioinformáticas (Bambini y Rappuoli, 2009).

El presente estudio se basa en el enfoque genómico de la vacunología reversa para identificar potenciales factores de virulencia conservados e inmunoprotectivos utilizando el genoma de M. haemolytica serotipo A2 Ovino disponible en la base de datos del NCB I ( Número de accesión : ACZX01000000). Se parte de la base de que existe una crianza mixta de alpacas y ovinos, y que las herramientas de la vacunología reversa permiten identificar candidatos vacunales comunes a varios serotipos. El objetivo del presente estudio fue identificar dichos candidatos vacunales en un genoma disponible en la base de datos que puedan ser empleados en el desarrollo futuro de vacunas de tercera generación contra la pasteurelosis neumónica de las alpacas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la identificación de regiones codificantes del genoma de M. haemolytica serotipo A2 Ovino y poder seleccionar potenciales candidatos vacunales, se diseñó un in-house pipeline semiautomático usando programas bioinformáticos y scripts en Perl (Stajich et al., 2002) (Figura 1). El análisis y filtro de la información generada fue basada en una serie de criterios según el enfoque genómico de la vacunología reversa.

Anotación Estructural y Funcional

Se utilizó la secuencia del genoma borrador de M. haemolytica A2 Ovino, disponible en la base de datos del National Center of Biotechnology Institute (NCBI) (Número de accesión: ACZX00000000). El genoma fue obtenido en formato FASTA y en 144 contigs. Los contigs fueron concatenados en un solo archivo multifasta, utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan, 1999).

Las secuencias codificantes (CDS) fueron identificadas en los mismos contigs utilizando el conjunto de programas pertenecientes a Glimmer 3.0.2 (Delcher et al., 2007). El training set of genes fue obtenido a partir de todos los contigs del genoma, con el programa long-orfs, y la lista de coordenadas de secuencias fueron extraídas con el programa extract. Los training set of genes fueron utilizados para construir el Modelo de Contexto Interpolado (ICM), mediante el programa build-ICM. Este modelo fue finalmente utilizado en el programa Glimmer para la identificación de genes presuntivamente codificantes de proteínas, considerando al genoma de tipo lineal por estar en contigs. Asimismo, un script en Perl fue utilizado para adicionar a la lista de coordenadas de los marcos abiertos de lectura (ORFs, orf.predict), un campo extra que especifique los contigs específicos donde pertenecen dichas coordenadas, necesarios para ser extraídos mediante el programa multi-extract (orfs.seq).

Previo a la anotación funcional, cada CDS fue traducida a secuencias de aminoácidos (protein.seq), utilizando el programa transeq del paquete EMBOSS (Rice et al., 2000) aplicando el código genético estándar de bacterias. Estos genes potenciales traducidos fueron anotados por una búsqueda local de homología de secuencias contra la base de datos completa de proteínas no redundantes (nr) del NCBI, usando el programa BlastP del paquete BLAST (Altschul et al., 1997), tomando en cuenta una identidad mayor al 70% sobre el 90% de longitud (cobertura) y un e-value <1e-10.

Predicciones

De factores de virulencia

Las posibles proteínas, homólogas a otras previamente caracterizadas como factores de virulencia en otros organismos, fueron identificadas por análisis de BlastP contra la Base de Datos de Factores de Virulencia (VFDB) (Chen et al., 2016) y la base de datos microbiana de virulencia (MvirDB) (Zhou et al., 2007), respectivamente, considerando un e-value <1e-10 y una identidad >30%. Las secuencias de los posibles factores de virulencia obtenidas, fueron analizadas y seleccionadas, en función del e-value, identidad, cobertura y en base a publicaciones previas.

De localización subcelular, de hél ices transmembrana y péptidos señal de secreción y lipoproteínas

Se utilizó el programa PSORTb (Yu et al., 2010) para predecir la localización subcelular de todas las proteínas codificadas del genoma de M. haemolytica A2 Ovino. Además, se usó algoritmos de búsqueda de secuencias específicas para la identificación de motivos de secuencia, incluyendo péptidos señal de secreción (SignalP) (Petersen et al., 2011), sitios de clivaje de lipoproteínas (LipoP) (Juncker et al. ,2003) y dominios transmembrana para la identificación de proteínas potenciales de membrana (TMHMM) (Krogh et al., 2001).

Análisis de Datos

El análisis y filtro de la información generada fue basada en una serie de criterios según el enfoque genómico de la vacunología reversa. En general, las proteínas citoplásmáticas y periplásmicas fueron descartadas, considerando únicamente las proteínas con hélices transmembrana <1. En este punto, se seleccionaron proteínas con péptidos señal de secreción y lipoproteínas.

Todas las proteínas de localización en la membrana interna fueron eliminadas y se incluyeron manualmente factores de virulencia de localización extracelular y de membrana externa, además de proteína hipotéticas de origen desconocido. Intencionalmente, un pequeño grupo de factores de virulencia de localización citoplasmática y membrana interna fueron incluidos, con el fin de verificar la eficiencia del pipeline de predicción. La selección de todas las proteínas incluidas fue en base a la comparación entre los factores de virulencia identificados y las proteínas anotadas, teniendo como criterio el nivel de conservación entre serotipos virulentos, evalue, identidad, cobertura y publicaciones previas.

Todos los antígenos obtenidos fueron analizados contra la base de datos curada de antígenos protectivos (Protegen) (Yang et al., 2011), para luego realizar una búsqueda de homología con proteínas de ratón. Finalmente, todos los antígenos menores de 150 aminoácidos y mayores de 1000 aminoácidos fueron removidos.

RESULTADOS

La anotación del genoma de M. haemolytica serotipo A2 Ovino resultó en 2656 secuencias codificantes de proteínas (41.1% G+C) (Cuadro 1), de las cuales 1948 fueron asignados a una función y entre las proteínas hipotéticas, 645 fueron únicas para M. haemolytica, 6 para el fago phiMHaA1 y el resto fueron proteínas «hipotéticas» conservadas dentro de la familia Pasteurellaceae, considerando un e-value <e-10 y una identidad mayor al 90% (Cuadro 1).

La mayoría de las proteínas homólogas identificadas (98%) fueron altamentes conservadas entre las tres cepas de M. haemolytica: A1, A2 Bovino y A2 Ovino con una identidad promedio de 99%, incluyendo una gran cantidad de factores de virulencia. El 2% de prot eínas rest antes tuvi eron homología con secuencias del fago phiMHaA1 (100% de identidad) y otras proteínas pertenecientes a diferentes especies de la familia Pasteurellaceae (73-100% de identidad) (Figura 2).

Se identificaron 742 posibles factores de virulencia usando la base de datos MvirDB. Por otro lado, se identificaron 295 posibles factores de virulencia usando la base de datos VFDB, representando las proteínas de captación de hierro (24%), factores de adherencia (10%), proteínas antifagocíticas (7%), proteínas relacionadas a la regulación (4%), endotoxinas (3%), toxinas (2%) y proteasas de IgA1 (2%), entre los más abundantes (Figura 3).

Siguiendo el enfoque genómico de la vacunología reversa, se hizo un screening a las 2656 proteínas y se seleccionaron aquellas con localización celular desde la membrana bacterial interna hacia la externa, seguida por predicción de hélices transmembrana, encontrándose 618 proteínas de membrana plasmática y extracelulares. De estas, solo se consideraron las que tenían hélices transmembrana <1, obteniéndose 237 proteínas. Posteriormente, se seleccionaron proteínas que tuvieran las secuencias señal de secreción y de lipoproteínas, excluyéndose manualmente todas aquellas con localización en la membrana interna; se adicionaron 38 factores de virulencia conservados entre nuevos e hipotéticos de localización citoplasmática, membrana interna, membrana externa, extracelular y desconocida, para finalmente contar con 75 factores de virulencia potenciales. De estos, solo se eligieron aquellos que tuvieron homología con proteínas de la base de datos Protegen (e-value <1e-5 y una identidad >25%, obteniéndose 26 potenciales candidatos vacunales. Ninguno de estos candidatos tuvo homología con alguna proteína del ratón. Finalmente, las proteínas menores que 150 aminoácidos y mayores que 1000 aminoácidos fueron removidas, resultando en 23 potenciales candidatos vacunales, la mayoría de ellos asociados a membrana externa (Figura 4).

La lista de los 23 potenciales candidatos vacunales se muestran en el Cuadro 2.

DISCUSIÓN

En la presente investigación se realizó el análisis del genoma de M. haemolytica serotipo A2 Ovino con la finalidad de identificar potenciales candidatos vacunales que brinden una protección cruzada y universal contra la pasteurelosis neumónica, teniendo como estrategia el enfoque genómico de la vacunología reversa.

En número de genes identificados (2656) y el %GC (41.1%) (Cuadro 1) fueron comparables a los reportados en previas anotaciones del genoma de M. haemolytica A1 (2839; 41%GC) (Gioia et al., 2006) y A2 (2682; 41%GC) (Lawrence et al., 2009). El 98% de las proteínas homólogas fueron identificadas entre las tres cepas de M. haemolytica: A1 y A2 Bovino y A2 Ovino, lo que sugiere que la mayoría de los genes son altamente conservados para los tres aislados (identidad >90%).

La predicción de candidatos vacunales dio como resultado 23 potenciales antígenos inmunoprotectivos (Cuadro 2). Para los efectos del presente estudio se seleccionaron moléculas asociadas a superficie y proteínas secretadas (con peptidos señal), ya que se ha demostrado que estas moléculas son potenciales dianas para inducir una fuerte respuesta inmune celular en el hospedero (Gamberini et al., 2005). Por el contrario, proteínas no superficiales, así como proteínas citoplasmáticas o de membrana interna, no representan buenos blancos para el desarrollo de vacunas debido a que no tienen un contacto cercano a las células B del hospedero. Sin embargo, para la identificación de potenciales candidatos vacunales, donde la respuesta de células T es crítica, la localización subcelular no es un problema, ya que una respuesta de células T puede ser dirigidas a cualquier proteína objetivo (He et al., 2010).

Debido a lo anteriormente expuesto, posterior al screening secundario, se adicionaron manualmente y en base a literatura publicada, 38 factores de virulencia potenciales, incluyendo proteínas de localización citoplasmática, de membrana externa y extracelular. Además, fueron incluidas proteínas hipotéticas de localización desconocida con el fin de identificar nuevos antígenos. No obstante, ninguna proteína citoplásmática resultó incluida en la lista final de candidatos vacunales, lo que demuestra la eficacia del pipeline de predicción empleado. Asimismo, proteínas con múltiples regiones transmembrana fueron ignoradas, ya que, en estudios similares, 250 de 600 candidatos vacunales de N. meningitidis B no pudieron ser clonados y expresados por la presencia de más de una hélice transmembrana (Pizza et al., 2000).

Se seleccionaron factores de virulencia conservados en diferentes serotipos virulentos de la misma especie y en especies relacionadas, ya que estos ofrecen una protección cruzada y «universal» (Tettelin et al., 2005). La selección final de los potenciales candidatos vacunales conservados contra la pasteurelosis neumónica fue apoyada por una base de datos de antígenos inmunoprotectivos, experimentalmente verificados (Protegen), y por la remoción de proteínas menores de 150 aminoácidos y mayores de 1000 aminoácidos. Este criterio fue incluido para asegurar que los candidatos puedan ser clonados y expresados exitosamente en estudios posteriores. La búsqueda de homología con proteínas de ratón fue realizada, ya que un candidato vacunal con similitud de secuencias en el hospedero es probablemente poco inmunógeno debido al mimetismo del epítope o a la producción de autoinmunidad en el hospedero (Wilson et al., 2000). Un gran porcentaje de los candidatos vacunales seleccionados estuvieron localizados en la membrana externa (82%). Estos resultados coinciden con el alto porcentaje de proteínas de membrana externa identificadas en el genoma de M. haemolytica A2 Ovino, incluyendo proteínas de captación de hierro y de adherencia (Figura 3). Además, todos los antígenos seleccionados presentaron alta similitud con proteínas homólogas de los tres serotipos virulentos de M. haemolytica (e»99%) y de otras especies patógenas asociadas a neumonía, donde la capacidad inmunoprotectiva de la mayoría ellos ha sido verificada experimentalmente (Sutherland et al., 1989; Potter et al., 1999; Confer et al., 2003; Davies y Lee, 2004).

Entre los potenciales candidatos vacunales seleccionados destaca la leucotoxina A (orf00438), considerado el principal factor de virulencia de M. haemolytica, causante de la lisis de macrófagos y neutrófilos en bovinos y ovinos (Clinkenbeard et al., 1989). Además, existen diversos estudios que han demostrado su capacidad inmunoprotectora (Conlon et al., 1991). En el presente estudio, la leucotoxina A demostró ser homóloga con la proteína Apx IIA de Actinobacillus pleuropneumoniae (e-value = 0; 65% identidad y 80% de similitud), un patógeno de la familia Pasteurellaceae causante de la pleuroneumonía porcina. ApxIIA, al igual que la leucotoxina A, es una exotoxina de la familia RTX, y su importancia como candidato vacunal ha sido demostrado en recientes estudios (Seo et al., 2013).

Asimismo, se seleccionaron proteínas de unión a transferrina tipo B (orf02261) y A (orf02262), que son clasificadas como proteínas de membrana externa reguladas por hierro (IROMPs), las cuales han demostrado ser inmunogénicas en bovinos y, en combinación con sobrenadantes de cultivo, incluyendo leucotoxina, lipopoli sacárido y polisacáridos capsulares, resultaron ser inmunoprotectivos contra la infección experimental por M. haemolytica serotipo A1 (Sreevatsan et al., 1996). En general, estas proteínas son potenciales candidatos vacunales, ya que la adquisición de hierro es imprescindible para M. haemoltyica durante el estadio temprano de la infección; así como para la producción de leucotoxina y otros factores de virulencia (Ogunnariwo et al., 1997).

Se identificó una proteína de membrana externa modificable al calor (orf01914), también conocida como PomA. Esta proteína muestra gran similitud a las proteínas OmpA2 de Haemophilus ducreyi (73%) y OmpA (P5) de Haemophilus influenzae (68%). OmpA es una proteína altamente conservada en bacterias Gram negativas y está involucrada en la adherencia a tejidos de hospederos en varios patógenos asociados a neumonía, incluyendo H. influenza e y P. multocida (Davies y Lee, 2004). Por lo tanto, PomA puede jugar un rol en la adherencia y la colonización de M. haemolytica al tracto respiratorio de su hospedero.

Finalmente, entre las proteínas seleccionadas figuran dos proteínas hipotéticas COI_ 07 28 y M HA_06 90 (orf00685 y orf01126, respectivamente). Comparación y análisis de dominios demostraron que el producto orf00685 probablemente sea una lipoproteína y potencial candidato vacunal. En su lugar, la proteína hipotética MHA_0690 (orf01126), muestra una similitud del 49% con casi toda la secuencia corta de la proteína 26 de membrana externa de H. influenza. A esto hay que agregar que la producción de esta proteína ha demostrado ser efectiva en incrementar el aclaramiento pulmonar y en inducir títulos altos de anticuerpos mucosal y sistémico; además de una respuesta inmune celular (El-Adhami et al., 1999). Por lo tanto, la proteína hipotética MHA _0690 (orf01126), podría ser un potencial antígeno inmunoprotectivo.

CONCLUSIONES

  • Se identificaron 23 potenciales antígenos inmunoprotectivos conservados entre los serotipos virulentos de M. haemolytica, utilizando el genoma de M. haemolytica A2 Ovino, mediante el enfoque genómico de la vacunología reversa.

  • La mayoría de los antígenos identificados están asociados a la membrana externa y tienen alta similitud con factores de virulencia de otros patógenos de la familia Pasteurellaceae involucrados en procesos infecciosos neumónicos, por lo que resultan candidatos vacunales prometedores para el desarrollo futuro de vacunas recombinantes, efectivas y universales, con el fin de prevenir y controlar la pasteurelosis neumónica en alpacas.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad Innóvate Perú del Proyecto Contrato N.°133-FINCyTIB-2013 «Vacunología reversa: desarrollo de una vacuna de nueva generación para el control y/ o prevención del aneumonía pasteurelósica en alpacas».

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 26 de agosto de 2016

Aceptado para publicación: 29 de enero de 2017