http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v28i2.13074

ARTÍCULOS PRIMARIOS

Identificación de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium en cuyes mediante la técnica de PCR múltiple

Identification of Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium in Guinea pigs by the multiplex PCR

 

Geraldine Marcelo M.¹, Raúl Rosadio A.¹, Ana Chero O.¹, Gerardo Díaz O.¹, Aldo Ciprian C.², Lenin Maturrano H.^1,3

¹ Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

² Laboratorio de Patología Clínica, Histología y Embriología, Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, Ayacucho, Perú

³ E-mail: lenin.maturrano@gmail.com

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RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue identificar mediante PCR múltiple la posible existencia de los serovares Salmonella Typhimurium y Enteritidis en 25 cepas de Salmonella spp previamente aisladas de cuyes e identificadas por sus características metabólicas. Mediante el análisis molecular se identificaron todas las cepas como Salmonella Typhimurium, evidenciando la amplificación de los cebadores específicos para los genes invAy fliC pertenecientes al género Salmonella y Salmonella Typhimurium, respectivamente. El presente estudio permitió establecer una metodología rápida para la identificación molecular de Salmonella Typhimurium y Enteritidis aislados de cuyes.

Palabras clave: cuyes, Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, PCR múltiple

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ABSTRACT

The aim of this study was to identify by mutiplex PCR-based assays the possible presence of serovars Salmonella Typhimurium and Enteritidis in 25 strains of Samonella spp that were previously isolated from guinea pigs and identified by their metabolic characteristics. The molecular analysis identified all 25 strains as Salmonella Typhimurium, evidencing the primer amplification of genes invA and fliC of Salmonella spp and Salmonella Typhimurium, respectively. This study established a rapid methodology for molecular identification of Salmonella Typhimurium and Enteritidis isolated from guinea pigs.

Key words: guinea pigs, Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, multiplex PCR

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INTRODUCCIÓN

La salmonelosis es la principal enfermedad infecciosa que afecta la explotación de cuyes, provocando graves pérdidas en la producción debido a los altos índices de mortalidad (Morales et al., 2007; Matsuura, 2010). El género Salmonella presenta más de 2500 serovares, siendo Salmonella Typhimurium y Salmonella Enteritidis los notificados con mayor frecuencia a nivel mundial en animales de sangre caliente (García, 2011; Grimont y Weill, 2007; WHO, 2013).

S. Typhimurium ha sido el serovar de mayor frecuencia en cuyes criados para consumo en el Perú (Garmendia et al., 2000; Matsuura et al, 2010); sin embargo, existen otros serovares como S. Enteritidis que fueron aislados de cuyes de laboratorio o criados como mascotas (Richardson 2000; Garmendia et al., 2000; Parra et al., 2002).

La salmonelosis se presenta en cuyes de cualquier edad, mayormente en las etapas de lactación y destete (Matsuura et al., 2010). La enfermedad se presenta en forma crónica o aguda, siendo esta última la más letal debido a que no se suelen observar signos clínicos aparentes que permitan realizar algún tratamiento (Matsuura et al., 2010). El diagnóstico en cuyes se realiza asociando las manifestaciones clínicas, hallazgos en la necropsia y el aislamiento bacteriano. Los órganos de elección para recuperar la bacteria en animales enfermos son principalmente el hígado y el bazo, pero también se puede aislar de pulmón, ganglio mesentérico, intestino, útero, vesícula biliar y glándula mamaria (Bustamante, 1993; Matsuura, 2010).

Entre los métodos para el diagnóstico de Salmonella spp, el cultivo microbiológico es la prueba más comúnmente empleada para el aislamiento de la bacteria a partir de tejidos y heces (Pachón, 2009), para luego observar las características metabólicas y antigénicas mediante pruebas bioquímicas y serológicas. Actualmente se prefiere el uso de técnicas de diagnóstico molecular debido a su gran rapidez y eficacia, siendo una de ellas la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Myint et al., 2006; Grimont y Weill, 2007). La PCR múltiple, variante de la PCR convencional, es empleada para la detección y amplificación simultánea de distintas secuencias de ADN (en una única reacción). Asimismo, se han desarrollado diversos protocolos de PCR para la detección de Salmonella spp utilizando cebadores específicos para la detección de genes blanco del género Salmonella y los serovares S. Enteritidis y Typhimurium en productos de origen animal destinados al consumo humano (Soumet et al., 1999; Jamshidi et al., 2010).

Uno de los genes utilizados para la identificación del género Salmonella es el invA, que contiene secuencias únicas del género y ha sido probado como un blanco apropiado de PCR, con una potencial aplicación diagnóstica (Rahn et al., 1992). Así mismo, la identificación de la bacteria hasta el nivel de serovar es aún limitada, debido a la gran cantidad de serovares conocidos (Grimont y Weil, 2007). Los cebadores diseñados que permiten identificar a los serovares Typhimurium y Enteritidis son los más utilizados por el problema que causan en la salud humana y animal (CFSPH, 2005).

El gen fliC de la flagelina codifica el mayor componente del flagelo de S. Typhimurium, utilizándose para la identificación de este serovar (Aldridge et al., 2006). Por otro lado, el serovar Enteritidis alberga en su genoma un plásmido único de virulencia de 60 kb (Chu et al., 1999) que posee el gen Prot6E, el cual probablemente codifique una única secuencia de superficie fimbrial específica de S. Enteritidis (Clavijo et al., 2006). De esta manera, el objetivo del presente estudio fue identificar mediante PCR múltiple la posible existencia de los serovares S. Enteritidis y Typhimurium en 25 cepas de Salmonella spp previamente aisladas de cuyes e identificadas por sus características metabólicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Lugar de Estudio

Las muestras fueron obtenidas a partir de casos sospechosos de salmonelosis ocurridas en en un trabajo de investigación previo en explotaciones comerciales de cuyes en el departamento de Lima. El procesamiento y análisis de las muestras fueron realizados en la Sección de Biología y Genética Molecular del Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.

Material Experimental

Cepas en estudio

Se evaluaron 25 cepas previamente caracterizadas, morfológica y metabólicamente, como Salmonella spp, provenientes de animales con signos clínicos y lesiones anatomopatológicas de salmonelosis. Estas cepas fueron aisladas de hígado, vesícula biliar y médula ósea de 25 cuyes, seleccionando indistintamente solo una muestra por animal. Las muestras se encontraban conservadas en caldo cerebro corazón (BHI, por sus siglas en inglés) con glicerol al 20% en tubos de 2 ml a una temperatura de -80 °C.

Cepas de referencia

Se emplearon las cepas de referencia S. TyphimuriumATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076. Además, se utilizaron dos cepas control negativas de Escherichia coli y Proteus spp aisladas en este laboratorio. Las muestras se encontraban conservadas en BHI con glicerol al 20% en tubos de 2 ml a una temperatura de -80 °C.

Reactivación de Cepas

Las 25 cepas de cuyes y las cepas de referencia control negativo y control positivo fueron reactivadas empleando el protocolo descrito por Sánchez y Corrales (2005), con algunas modificaciones:

- Las cepas en glicerol se llevaron a una temperatura de -20 °C y luego de 4°C.

- Se sembraron por agotamiento en pla cas de agar sangre con la ayuda de un asa de siembra y se incubaron a 37 °C por 18 h.

- En paralelo al paso anterior, se sembra ron en placas de agar XLD (agar xilosa, lisina, desoxicolato), para observar el crecimiento típico de las colonias de Salmonella (colonias circulares transpa rentes con un centro negro por la pro ducción de sulfuro de hidrógeno).

- Luego, cada cepa fue inoculada en 1 ml de BHI e incubada a 37 °C por 24 h.

Análisis de Muestras

Para la extracción de ADN se utilizó el Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification (ThermoFisher Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se colocó en tubos microcentrífuga de 1.5 ml y se almacenó a -20 °C.

Para la identificación de las cepas obtenidas de cuyes con salmonelosis, se realizó una PCR múltiple basada en el protocolo de Jamshidi et al., (2010), con algunas modificaciones, empleando tres pares de cebadores que codifican secuencias específicas de los genes invA, fliCy Prot6E, que identifican al género Salmonella, S. Typhimurium y S. Enteritidis, respectivamente (Cuadro 1 ).

La PCR múltiple fue realizada en un volumen final de 20 µl consistiendo en 2.5 µl de 10X PCR buffer (500 mM KCl, 200 mM Tris–HCl), 1 µl de desoxinucleotido trifosfato (0.5 mM), 0.5 µl MgCl₂ (2.5 mM), 0.4 µl por cada cebador, 0.3 µl de Taq DNApolimerasa y 2 µl de ADN. Las condiciones para la amplificación de los genes fueron de una incubación inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 35 ciclos con una desnaturalización a 95 °C por 45 s, hibridación a 58 °C por 45 s, una extensión a 72 °C por 45 s, y una extensión final a 72 °C por 7 min.

Para la verificación de la prueba se utilizaron cepas control de S. Enteritidis (ATCC 13076), S. Typhimurium (ATCC 14028) y como controles negativos a Proteus spp y Escherichia coli. Los productos de la PCR múltiple fueron separados mediante electroforesis en gel al 2% con buffer TBE 0.5X durante 2 h. El tamaño de las distintas bandas se determinó mediante marcadores de peso molecular de 100 pb (DNA ladder, Gene Ruler^TR, Fermentas).

RESULTADOS

El ADN de las 25 cepas de Salmonella spp fue identificado mediante la técnica de PCR múltiple, evidenciándose en todas las muestras dos amplicones de 559 pb y 284 pb correspondientes a los genes fliCe invA, respectivamente. La presencia y visualización de estos amplicones indican que las cepas pertenecen al género S. serovar Typhimurium (Figura 1 ).

DISCUSIÓN

La técnica de PCR múltiple evidenció amplicones de 284 pb (gen invA) y 185 pb (gen fliC) en las 25 cepas de cuyes, coincidentes con el control positivo de S. Typhimurium. Estos datos corroboran los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas previamente. Así mismo, debido a la obtención de amplicones de 559 pb se identificó como S. Typhimurium al total de las muestras evaluadas, diagnóstico que generalmente requeriría de una identificación serológica completa para la determinación de serotipo.

Esos resultados confirman estudios anteriores que indican que S. Typhimurium se encuentra en frecuencias que superan el 95% en relación a otros serovares hallados en cuyes (Bustamante, 1993; Garmendia et al., 2000), ya que S. Enteritidis también se encuentra implicado en cuadros de salmonelosis en cuyes, aunque en una mucho menor frecuencia (Garmendia et al., 2000; Richardson, 2000; Parra et al., 2002).

Los cebadores que amplifican secuencias específicas de genes de virulencia de invA, fliCy Prot6E del género Salmonella y los serovares S. Typhimurium y S. Enteritidis, respectivamente, han sido empleados con éxito en muestras de cuyes y otras especies (Soumet et al., 1999; Atyabi et al., 2012; Marcelo et al., 2015; Moosavy et al., 2015).

CONCLUSIONES

• Se logró identificar S. Typhimurium en todas las cepas aisladas de cuyes con signos de salmonelosis mediante la técnica de PCR múltiple debido la amplificación de los genes invA (género Salmonella) y fliC (serovar S. Typhimurium) de 284 pb y 559 pb, respectivamente.

• Se implementó un protocolo para la identificación específica de Salmonella spp y los serovares Typhimurium y Enteritidis.

Agradecimientos

Los autores expresan su agradecimiento al Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad – Innóvate Perú, fuente financiadora del Proyecto «Desarrollo de una vacuna para el control y prevención de la salmonelosis en la producción de cuyes», Contrato N.° 362PNICP-PIAP-2014.

LITERATURA CITADA

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Fuente financiera: Innovate Perú, Proyecto «Desarrollo de una vacuna para el control y prevención de la salmonelosis en la producción de cuyes». Contrato N°362-PNICP-PIAP-2014

Recibido: 27 de abril de 2016

Aceptado para publicación: 31 de enero de 2017