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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versión impresa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.28 no.3 Lima jul./set. 2017

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v28i3.13361 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

Evaluación de una Técnica de PCR-Múltiple para la Detección Rápida de Salmonella Typhimurium y Enteritidis en Cuyes (Cavia porcellus) Naturalmente Infectados

Evualuation of a Multiplex-PCR Method for Rapid Detection of Salmonella Typhimurium and Enteritidis in Naturally Infected Guinea Pigs (Cavia porcellus)

 

Gerardo Díaz O.1, Raúl Rosadio A.1, Geraldine Marcelo M.1, Ana Chero O.1, Ronald Jiménez A.2, Iván Reyna W.3, Lenin Maturrano H.1,4,5

1 Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

2 Instituto de Investigaciones Tropicales y de Altura (IVITA El Mantaro),Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

3 Instituto de Investigaciones Tropicales y de Altura (IVITA Huaral),Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

4 Laboratorio de Zootecnia y Producción Agropecuaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

5 E-mail: lenin.maturrano@gmail.com


RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar la capacidad de detección de Salmonella Typhimurium y Enteritidis mediante el método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Múltiple a partir de muestras en pre-enriquecimiento no selectivo (utilizando secuencias blanco de los genes InvA, fliC y prot6E), y hallar su concordancia con el método de detección microbiológica convencional, que consta de pre-enriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, aislamiento en agar diferencial y pruebas bioquímicas. Se analizaron 111 muestras de hígado de cuyes con diagnóstico presuntivo de salmonelosis, provenientes de Chancay (Lima) y El Mantaro (Junín), Perú. Se llegó a detectar Salmonella Typhimurium por PCR Múltiple en 54% (60/111) de las muestras y en 41% (45/111) por análisis microbiológico. Se encontró una concordancia substancial con un valor de Kappa de 0.64. La prueba de McNemar demostró que los resultados de ambas pruebas son estadísticamente diferentes (p<0.05).

Palabras clave: PCR múltiple; detección rápida; análisis microbiológico; Salmonella, cobayo


ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the detection capacity of the Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) method from non-selective pre-enrichment samples (using target sequences of InvA, fliC and prot6E genes) to diagnose Salmonella Typhimurium and Enteritidis and to determine the concordance between the conventional microbiological detection method which consist of non-selective pre-enrichment, selective enrichment, differential agar isolation and biochemical tests. A total of 111 liver samples from guinea pigs with presumptive diagnosis of salmonellosis, collected in Chancay (Lima) and El Mantaro (Junín), Peru were analyzed. Salmonella Typhimurium was detected by multiplex PCR in 54% (60/111) of the samples and by microbiological analysis in 41% (45/111). A substantial concordance was found with a Kappa value of 0.64. The McNemar test showed that the results of both tests were statistically different (p<0.05).

Key words: multiplex PCR; rapid detection; microbiological isolation; Salmonella; guinea pig


INTRODUCCIÓN

El cuy (Cavia porcellus) es una especie nativa de los andes sudamericanos que cuenta con una población aproximada de 13.6 millones (INEI, 2012). Su importancia como animal de producción y sus ventajas económicas son indiscutibles, ya que es una fuente alimenticia de alto valor para las poblaciones del Perú, contribuyendo a la seguridad alimentaria del país (Chauca, 1997).

Diversos problemas sanitarios afectan seriamente la crianza del cuy. Entre ellos, los brotes de salmonelosis pueden afectar entre el 61 y 95% de las granjas (Ramírez, 1972; Matsuura et al., 2010), siendo los serovares Typhimurium y Enteritidis los más aislados (Fox et al., 1984). La importancia de esta enfermedad radica en su rápida evolución, que conlleva a una alta mortalidad y disminución de la productividad (Chauca, 2007).

El método convencional de detección de Salmonella spp es el análisis microbiológico a través de un enriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, aislamiento en agar diferencial y confirmación mediante pruebas bioquímicas y serotipificación (ISO, 2002; FDA, 2007), procedimientos que pueden tomar hasta una semana. Por otro lado, se dispone de un protocolo de PCR-Múltiple para identificar Salmonella Typhimurium y Salmonella Enteritidis aislados de cuyes (Jamshidi et al., 2010; Marcelo, 2015), el cual amplifica simultáneamente fragmentos de 284 pb del gen InvA que codifica una invasina específica del género Salmonella (Rahn et al., 1992), fragmentos de 559 pb del gen fliC que codifica para la flagelina H1 específica del serovar Typhimurium (Soumet et al., 1999) y fragmentos de 185 pb del gen Prot6E que codifica para una fimbria específica del serovar Enteritidis (Clavijo et al., 2006). Asimismo, otros estudios (Matias et al., 2010; Zhang et al., 2011; Mainar-Jaime et al., 2013) han demostrado que se puede identificar Salmonella mediante PCR después del pre-enriquecimiento no selectivo de las muestras.

Es de gran importancia contar con un método de detección de Salmonella Typhimurium y Enteritidis que sea práctico y consuma menos tiempo para poder tomar medidas de control inmediatas, a fin de contrarrestar las considerables pérdidas económicas que trae la presentación de esta enfermedad en la producción de cuyes. Por ello, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la capacidad de detección de Salmonella Typhimurium y Enteritidis de la PCR Múltiple a partir de muestras sometidas a pre-enriquecimiento no selectivo y hallar la concordancia entre esta y el método convencional de análisis microbiológico de detección de Salmonella spp.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Lugar y Tiempo

La toma de muestras se llevó a cabo en la estación experimental «El Mantaro» del Instituto Veterinario de Investigaciones de Trópico y Altura (IVITA) de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos (FMV-UNMSM) (Jauja, Perú), y en un criadero de crianza comercial en Chancay (Huaral, Perú). El procesamiento de las muestras se llevó a cabo en el laboratorio de Genética y Biología Molecular de la FMV-UNMSM en Lima. Ambas etapas se ejecutaron entre octubre de 2015 y abril de 2016.

Toma de Muestras

Se analizaron 111 cuyes (13 del IVITA y 98 del criadero de Chancay), de 1 día a 20 meses de edad, muertos con signos de depresión, pelaje hirsuto, anorexia, caquexia, diarrea y postración; signos desencadenantes de muerte súbita y compatibles con diagnóstico presuntivo de salmonelosis (Chauca, 1997). Los especímenes completos fueron colectados y llevados al laboratorio, siguiendo los lineamientos establecidos por el Servicio Nacional de Sanidad Agraria del Perú (SENASA, 2014), para realizar la necropsia dentro de las 24 h post mortem y tomar como muestras de referencia el parénquima hepático (Matsuura, 2008; Layme, 2009).

Procesamiento de las Muestras

Las muestras fueron analizadas en simultáneo siguiendo dos vías: análisis microbiológico y PCR-múltiple a partir del preenriquecimiento no selectivo (PENS), como se observa en la Figura 1. Para el análisis microbiológico se adaptó el protocolo de la norma ISO-6579:2002 (ISO, 2002) y el manual para análisis bacteriológico de Salmonella (FDA, 2007), siguiendo las etapas de preenriquecimiento no selectivo en Agua Peptonada Tamponada (APT) por 18 h a 37 °C (de donde se obtuvo 1 ml para el análisis por PCR múltiple), enriquecimiento selectivo en medio Rappaport-Vassiliadis (RV) por 24 h a 42 °C, aislamiento diferencial en agar selectivo Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) por 24 h a 37 °C y caracterización bioquímica por Agar Hierro Triple Azúcar (TSI), Agar Lisina Hierro (LIA), Agar Sulfito Indol Motilidad (SIM), Agar Citrato de Simmons y Agar Urea por 24 h a 37 °C.

Para el PCR-múltiple se trabajó con 1 ml de APT obtenido a partir de la etapa de PENS, se extrajo el ADN total con el kit comercial GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific) y se realizó la PCR múltiple siguiendo el protocolo de Jamshidi et al. (2010), con los cebadores indicados en el Cuadro 1. Se utilizó 1X Buffer, 2 mM MgCl , 1 mM dNTP’s, mezcla de 1 µM de cebadores, 1 U Taq polimerasa, 3 µl de ADN y H O hasta un volumen final de 20 µl, siguiendo las condiciones estandarizadas por Marcelo (2015) de 35 ciclos de desnaturalización por 45 s a 95 °C, hibridación por 45 s a 58 °C y elongación por 45 s a 72 °C, con una desnaturalización inicial de 5 min a 95 °C y una elongación final de 7 min a 72 °C. Los productos de la PCR-múltiple fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, con TBE 0.5X como buffer de corrida, a 100 V por 2 h. Se tiñó el gel con bromuro de etidio y se visualizaron las bandas mediante transiluminador de luz ultravioleta. Como controles positivos de la PCR se utilizaron cepas referencia de Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) y Salmonella Enteritidis (ATCC 13076).

Análisis de Datos

Los resultados fueron analizados a partir de una tabla de contingencia 2x2. Se utilizó la prueba de Kappa para determinar el grado de concordancia (Cuadro 2) entre los dos métodos y la prueba de McNemar para determinar si los resultados eran estadísticamente similares a un nivel de significancia del 5% (González y Falcón, 1999).

RESULTADOS

Se analizaron 111 muestras de parénquima hepático de cuyes. Mediante el análisis microbiológico se detectaron 45 animales positivos a Salmonella spp (41%) y mediante la PCR-múltiple se detectaron 60 positivos a Salmonella Typhimurium (54%) (Cuadro 3). El producto de la PCR en el gel electroforesis se observa en la Figura 2.

El índice de Kappa fue de K=0.64, lo que indica un grado de concordancia substancial. Por otro lado, mediante la prueba de McNemar se obtuvo un X2Mc= 9.8, lo cual indica que los resultados de ambos métodos fueron estadísticamente diferentes y no se pueden reemplazar mutuamente.

DISCUSIÓN

La detección de Salmonella spp puede realizarse por diversos métodos, especialmente por PCR y el análisis microbiológico (OIE, 2010; García, 2011), siendo este último el «gold standard» en los laboratorios de referencia (ISO, 2002; FDA, 2007; OIE, 2010).

Tiene como principal desventaja su baja sensibilidad y el tiempo que demanda para obtener resultados (González et al., 2014). Por otro lado, la PCR es una herramienta analítica de mayor sensibilidad que las propias pruebas «gold standard», por lo que su uso está en camino de sustituir los métodos de detección clásicos (OIE, 2008). De lo expuesto se deduce que es crucial contar con un método de detección de Salmonella que sea práctico y consuma menos tiempo para poder tomar medidas de control más rápidas.

Los resultados obtenidos muestran que es posible detectar con éxito Salmonella Typhimurium mediante PCR-múltiple a partir de muestras de hígado de cuyes en preenriquecimiento, lográndose detectarla en 54% (60/111) de los animales, mientras que mediante la microbiología convencional solo se logró detectar Salmonella spp en el 41% (45/111) de los animales; es decir, el PCRmúltiple detectó un 25% más de muestras positivas que la microbiología convencional. Por otro lado, la concordancia hallada entre ambos métodos fue substancial (K=0.64); sin embargo, los resultados de las pruebas fueron estadísticamente diferentes entre sí, lo que significa que no pueden utilizarse indistintamente para detectar Salmonella spp debido a que una tiene mayor sensibilidad que la otra.

Uno de los motivos del mayor porcentaje de detección de Salmonella spp mediante la PCR-múltiple fue que se realizó después del pre-enriquecimiento no selectivo, el cual es necesario para reactivar la Salmonella que contenga la muestra; factor que fue de gran importancia en otros estudios (Eriksson y Aspan, 2007; Kumar et al., 2007; Matias et al., 2010; Zhang et al., 2011; Mainar-Jaime et al., 2013); mas no crucial, ya que otros autores se refieren a la etapa de enriquecimiento selectivo mediante MSRV (Medio Rappaport-Vassiliadis Semi-Solido), principalmente porque diluye las sustancias inhibidoras de la PCR y reduce la carga bacteriana competitiva en la muestra, aunque significa un día más para obtener el resultado (Ferraz-Castagna et al., 2005; Myint et al., 2006; Eriksson y Aspan., 2007; Soria et al., 2012). Por otro lado, las evidencias para la detección mediante PCR directa de muestras sin pre-enriquecimiento son contradictorias y no muy alentadoras, principalmente debido a las bajas cargas y a la presencia de inhibidores (Ocepek et al., 2006; Matias et al., 2010; Marathe et al., 2012).

En el desempeño y concordancia de la PCR en muestras de pre-enriquecimiento respecto al análisis microbiológico convencional se obtienen sensibilidades que varían desde 85 al 98% y una concordancia substancial con índice de kappa de aproximadamente 0.76 (Feder et al., 2001; FerrazCastagna et al., 2005; Myint et al., 2006; Kumar et al., 2007), lo que coincide con el rango hallado en este estudio. Por otro lado, el límite de diagnóstico en muestras artificialmente contaminadas es muy variable, siendo como mínimo 2 UFC/ml y de 103 UFC/ml como máximo, según al protocolo de PCR (Ocepek et al., 2006; Zhang et al., 2011; Kanki et al., 2012; González et al., 2014), llegando en algunos casos a poderse detectar Salmonella spp únicamente mediante PCR (Ahmadi et al., 2010).

Una ventaja importante del protocolo de PCR utilizado en este estudio es que amplifica la secuencia blanco del gen InvA, el cual ha sido ampliamente utilizado en este tipo de estudios (Ferraz-Castagna et al., 2005; Eriksson y Aspan, 2007; Kumar et al., 2007; Ahmadi et al., 2010; Zhang et al., 2011; Soria et al., 2012) y que está validado como estándar para la detección molecular de Salmonella spp (Malorny et al., 2003). Cabe destacar este aspecto, ya que se tuvo una muestra positiva al diagnóstico microbiológico, pero no al molecular, lo cual pudo deberse a errores en el pipeteo o por efecto de algún inhibidor de la PCR. Para evitar estos falsos negativos y tener un mejor control de calidad del protocolo de PCR, se recomienda el uso de controles de amplificación interno (Ferraz-Castagna et al., 2005; OIE, 2008; Zhang et al., 2011).

Las razones de una menor detección de Salmionella spp por el análisis microbiológico convencional se deberían principalmente a la viabilidad de las bacterias, y a la recolección, el transporte y la cantidad de muestra (García, 2011), ya que este método necesita bacterias viables, al contrario de la PCR que solo requiere la presencia de ADN (Pérez et al., 2008).

CONCLUSIÓN

El presente protocolo de PCR-múltiple permite detectar a Salmonella Typhimurium en dos días, a partir de muestras en pre-enriquecimiento no selectivo, tomadas de cuyes muertos con diagnóstico presuntivo de salmonelosis.

La concordancia del PCR-múltiple respecto al análisis microbiológico convencional es substancial (K=0.64), pero los resultados de ambos métodos fueron estadísticamente diferentes y no se pueden reemplazar mutuamente.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad Innóvate Perú, del Proyecto Contrato 362-PNICPPIAP-2014 «Desarrollo de una vacuna para el control y prevención de la salmonelosis en la producción cuyes».

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 14 de noviembre de 2016

Aceptado para publicación: 23 de marzo de 2017

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