ARTÍCULOS PRIMARIOS

Aislamiento de Bacterias Ácido Lácticas a partir del Tracto Digestivo del Lechón

Isolation of Lactic Acid Bacteria from the Digestive Tract of the Piglet

 

Héctor Sánchez Súarez^1,3, Fredy Fabián Domínguez¹, Gloria Ochoa Mogollón¹, Rubén Alfaro Aguilera²

1 Departamento Académico de Sanidad Vegetal y Producción Pecuaria, Facultad de Ciencias Agrarias,Universidad Nacional de Tumbes, Perú

2 Departamento de Biología y Bioquímica, Facultad de Salud, Universidad Nacional de Tumbes, Perú

3 E-mail: hsanchezs@untumbes.edu.pe

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RESUMEN

El estudio tuvo como objetivo el aislar e identificar microorganismos nativos lactobacilos del tracto digestivo de lechones con la posibilidad de utilizarlos como inóculos para la mejora de los niveles productivos de lechones. Las muestras fueron sembradas y purificadas en agar Man, Rogosa y Sharpe (MRS). La identificación molecular de las bacterias se hizo mediante secuenciación del gen 16S ARNr. Se idientificaron cuatro especies: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae y Pediococcus pentosaceus.

Palabra clave: bacterias ácido lácticas; lechón; inóculo

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ABSTRACT

The aim of the study was to isolate and identify native lactobacillus microorganisms from the digestive tract of piglets with the possibility of using them for the improvement of the productive performance of piglets. Samples were cultured and purified on Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agar. Molecular identification of the bacteria was done by the sequencing the 16S rRNA gene. Four species were identified: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae and Pediococcus pentosaceus.

Key words: bacteria lactic acid; piglet; inoculum

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INTRODUCCIÓN

El predestete y destete en los cerdos son etapas críticas, donde la alimentación líquida cambia drásticamente a una alimentación sólida (Castillo, 2000), predisponiendo al cerdo a factores del entorno que pueden incidir negativamente en su respuesta inicial al uso eficiente del alimento (Díaz, 2003).

El uso de promotores de crecimiento, entre otros aditivos inocuos, en las etapas críticas de la crianza de cerdos permite superar los problemas que se presentan; pero, por otro lado, aumentan los costos pudiendo limitar el proceso de producción (Bhandari et al., 2010). Debido a esto, se ha estudiado la influencia de diversos microorganismos, en especial de bacterias nativas del género Lactobacillus, así como de sus productos extracelulares, con efecto benéficos sobre el lechón (Cueto-Vigil et al., 2010; Kim et al., 2012). Bajo este contexto, en el presente estudio se aisló e identificó microorganismos nativos lactobacilos del tracto digestivo de lechones con la posibilidad de utilizarlos como inóculos benéficos para lechones.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento de Bacterias Nativas

En una granja porcina de la ciudad de Tumbes, Perú, se seleccionó un lechón de 28 días de edad (destetado a los 21 días), con buen estado de salud y alimentado con concentrado comercial sin antibióticos. Cumpliendo con los estándares de ética de manejo de animales, el lechón fue anestesiado vía endovenosa, con dosis de 3 mg/k pv de ketamina a fin de realizar una laparotomía. Se tomaron muestras con hisopos estériles a partir de la mucosa epitelial del estómago, intestino delgado, intestino grueso y ciego. Las muestras fueron conservadas en tubos cónicos conteniendo caldo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) pH 6.5, y fueron trasladas en cadena de frío al laboratorio.

Se realizaron diluciones seriadas hasta 20-2 y fueron sembradas por superficie en placas Petri con agar MRS pH 6.5 e incubadas a 37 °C por 48 h. Posteriormente, se realizaron purificaciones consecutivas en agar MRS de las colonias bacterianas aisladas, los que fueron confirmados con tinción Gram.

Se aislaron un total de 19 cepas bacterianas. La evaluación de las características fenotípicas (bacilos Gram positivos sin presencia de esporas, catalasa negativa) permitió seleccionar cuatro cepas para su identificación molecular. Estas cepas fueron conservadas en tubos con agar MRS inclinado a 4 °C y congeladas a -20 °C en caldo MRS suplementado con 30% de glicerol.

Identif icación Molecular mediante Secuenciación del Gen 16S ARNr

Extracción de ADN

Se utilizó el método rápido de ebullición para plásmidos pequeños de Escherichia coli (basado en Holmes y Quigley [1981], modificado por Riggs y Mc Lachlan [1986]) con modificaciones). Para esto, las cepas seleccionadas fueron sembradas en tubos de vidrio con 10 ml de caldo MRS e incubadas a 37 ºC por 24 h. Se tomó 1.2 ml de la suspensión bacteriana en un microtubo de 1.5 ml y se centrifugó a 6160 g durante 2 min, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet de células con 500 µl de solución PBS 1X estéril y, luego, centrifugado a 6160 g por 1 min. Se eliminó el sobrenadante y se agregó 200 µl de solución STET (sacarosa 8%, Tritón X-100 5%, EDTA 50 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8.0) y 10 µl de lisozima (20 mg/ml, disuelto en agua destilada). Se incubó en baño de agua térmico a 100 °C por 45 a 55 s y se colocó sobre hielo. Se centrifugó a 10 410 g por 10 min y se transfirió el sobrenadante a otro microtubo que contenía 400 µl de isopropanol frío, dejándose reposar en congelación por 30 min. Luego se centrifugó a 10 410 g por 10 min y se eliminó el sobrenadante. El pellet obtenido fue lavado con etanol al 75% y secado a temperatura ambiente. Finalmente, el pellet de ADN fue disuelto con 200 µl de solución TE (Tris 1M y EDTA 0.1mM) a 65 °C. Las muestras fueron conservadas a -20 °C hasta su utilización.

Análisis por PCR

Se utilizó la técnica de PCR simple para amplificar la región 16S ARNr. Para esto, se utilizaron los cebadores universales 16S ARNr F518 (CCAGCAGCCGCGGTAATACG) y 16S ARNr R800 (TACCAG-GGTATCTA-ATCC), descritos para estudios filogenéticos bacterianos (Lane, 2001). Las reacciones de PCR se realizaron en mezclas de 25 µl, constituida por 2.5 µl de buffer Taq 10X, 1.5 mM de MgCl , 0.2 mM de cada dNTPs (10 mM), 0.5 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen), 0.36 pmol de cada cebador y 2 µl de ADN extraído. El perfil de la PCR se realizó en un termociclador (Thermo Scientific) y consta de un ciclo de 94 °C por 6 min, seguido de 40 ciclos de 94°C por 30 s, 58 °C por 45 s y 72 °C por 1 min, y una extensión final a 72 °C por 4 min.

Los productos de amplificación fueron verificados por electroforesis en geles de agarosa al 1.5%, teñidos con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) y por electroforesis en TAE 1X.

Secuenciación de los productos

Se utilizaron 10 µl de los productos obtenidos por amplificación en la PCR, que fueron colocados en microtubos de 0.2 ml. Además, se prepararon microtubos de 0.2 ml con porciones de 5 µl de cada cebador universal para el gen 16S ARNr. Estos fueron empacados y la secuenciación de las dos cadenas de cada producto amplificado fue hecha por Macrogen, EEUU.

Las secuencias de ADN fueron alineadas con el software libre MEGA 5 y comparadas con las secuencias de 16S ARNr que se encuentra en la base de datos de acceso público del GenBank mediante el software libre BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

RESULTADOS

Las cuatro cepas molecularmente identificadas fueron Lactobacillus brevis, Lactobacillus johnsonii, Enterococcus hirae y Pediococcus pentosaceus, clasificadas dentro del orden Lactobacillales, las que también son denominadas bacterias ácido lácticas (Cuadro 1, Figura 1).

DISCUSIÓN

La flora microbiana natural del tracto digestivo proporciona las condiciones necesarias para el eficiente uso de los nutrientes recibidos con los alimentos (Cranwell, 1985; Rosmini et al., 2004). Dentro de esta flora microbiana, las bacterias son las más predominantes y colonizan específicamente cada porción del tracto intestinal, permitiendo una asociación simbiótica con el hospedero (Hong et al., 2011). Esto podría permitir el uso de bacterias benéficas aisladas de la misma especie productiva, debido a su alta especificidad para su hospedero, resultando en una mejora de la salud general de los animales.

En el presente estudio se logró aislar e identificar molecularmente mediante el gen 16S a cuatro especies de bacterias ácido lácticas, que comprenden entre otros, a los géneros Lactococcus, Streptococcus y Leuconostoc (Partanen y Mroz, 1999; Collado y Sanz, 2007; Cueto et al., 2010; Mallo et al., 2010). Diversos estudios demuestran que la presencia de lactobacilos en el tracto digestivo del cerdo mejora su rendimiento productivo (Konstantinov et al., 2008; Lamendela et al., 2011; Loft et al., 2014; Deusch et al., 2015). Para este fin, estas bacterias utilizan diferentes mecanismos de acción relacionados con la estimulación de la inmunidad, producción de sustancias inhibitorias, así como competencia por la adhesión en los receptores del epitelio intestinal y por nutrientes (Castillo, 2000; Pluske, 2003; Champagne et al., 2005; de Lange et al., 2010; Klose et al., 2010; Blajman et al., 2015).

Estudios dirigidos por Gebert et al. (2011) demuestran que la colonización temprana del tracto gastrointestinal con la cepa 1E1 de Lactobacillus brevis mejora el sistema inmune y reduce el establecimiento de patógenos en lechones lactantes. Pediococcus pentosaceus DPC6006 fue aislada, seleccionada in vitro con base a criterios probióticos y ensayada in vivo en lechones, demostrando que reduce la cantidad de microorganismos indeseables del tracto digestivo (Gardiner et al., 2004). Asimismo, se reporta a Enterococcus sp como una bacteria comensal del intestino de muchos mamíferos, entre ellos, gatos, perros, ratas, cerdos y terneros (Etheridge et al., 1988; Jergens et al., 1991). En forma similar, Larsson et al. (2014) mencionan que E. hirae coloniza específicamente el epitelio intestinal de lechones, generando diarreas. En otros casos, aislados bacterianos de E. hirae a partir de fluidos del rumen de Bos primigenius, presentaron propiedades bactericidas y antiinflamatorias (Arokiyaraj et al., 2014).

Wang et al. (2014) demostraron que la administración de L. johnsonii XS4 en dietas para cerdas al final de la gestación y durante la lactancia tuvieron efectos positivos sobre el rendimiento, en tanto que BuhnikRosenblau et al. (2012) sugieren que esta bacteria tiene una alta especificidad por sus hospederos. Esta especie bacteriana es considerada potencialmente probiótica y de gran interés para la industria alimentaria y farmacéutica (La Ragione et al., 2004; Pridmore et al., 2004).

Considerando la información obtenida, estos inóculos podrían ser evaluados experimentalmente en lechones para determinar su potencial en la mejora productiva porcina.

 

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Recibido: 19 de octubre de 2016

Aceptado para publicación: 3 de abril de 2017