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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versão impressa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.28 no.4 Lima out./dez. 2017

 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

Crecimiento poblacional y productividad de la microalga nativa Chlorella peruviana bajo diferentes salinidades

Population growth and productivity of the native microalga Chlorella peruviana under different salinities

 

Mauro Mariano Astocondor1,4, Egma Mayta Huatuco2, Haydee Montoya Terreros3, Ronald Tarazona Delgado1,3

1 Laboratorio de Investigación Dulceacuícola y de Cordados,

2 Laboratorio de Virología Clínica y Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

3 Laboratorio de Simbiosis Vegetal, Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

4 E-mail: mmarianoa@unmsm.edu.pe, mgmarianoa@gmail.com


RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar cinco niveles de salinidad sobre el crecimiento y productividad de Chlorella peruviana Chacon, cepa nativa de la laguna salina Mellisera, Chilca, Perú. Se utilizaron cinco tratamientos de acuerdo al nivel de salinidad: T1, 38‰; T2, 44‰; T3, 59‰; T4, 88‰; y T5, 176‰, con una temperatura de 27±2 °C y una intensidad de luz de 1250±10 lx. Cada tratamiento se realizó por triplicado en matraces de 250, 500 y 1000 ml. Los cultivos se realizaron con medio f/2 (Guillard), aireación constante y fotoperiodo de 24:00 h. Los resultados indicaron que T1 presentó mejores resultados en densidad (42±2.6x106 cel/ml), biomasa seca (397.9±2.3 mg/l) y clorofila (80.2±2.3 mg/l), pero con rendimientos adecuados en los niveles superiores de salinidad. Se concluye que el crecimiento y productividad de C. peruviana presenta una tendencia decreciente con relación al nivel de salinidad.

Palabras clave: ecología; fisiología; producción; cultivo; algas clorofíceas


ABSTRACT

The aim of the study was to evaluate five salinity levels on the growth and productivity of Chlorella peruviana Chacon, a native strain of the Mellisera salt lagoon in Chilca, Peru. Five treatments were used according to the salinity level: T1, 38‰; T2, 44‰; T3, 59‰; T4, 88‰; and T5, 176‰, with a temperature of 27±2 °C and a light intensity of 1250±10 lx. Each treatment was done in triplicate in flasksof 250, 500 and 1000 ml. Cultures were performed with f/2 medium (Guillard), constant aeration and photoperiod of 24:00 h. The results indicated that T1 showed better results in density (42±2.65x106 cel/ml), dry biomass (397.9±2.3 mg/l) and chlorophyll (80.2±2.3 mg/l), but with adequate yields at higher levels of salinity. It is concluded that the growth and productivity of C. peruviana presents a decreasing trend in relation to the level of salinity.

Key words: ecology; physiology; production; cultivation; chlorophyceae algae


INTRODUCCIÓN

El género Chlorella Beijerinck, 1890, comprende el grupo de microalgas Cloroficeas, que se caracterizan por ser cosmopolitas y frecuentes en lagos alcalinos, marinos y lagunas costeras (Hernández y Labbe, 2014). Chlorella es una de las microalgas con abundante contenido de proteína y que desde los tiempos de la II Guerra Mundial (Álvarez y Gallardo, 1989) fue utilizado como suplemento alimenticio por su fácil reproducción y potencial nutritivo, capaz de estimular, aunque de forma parcial, el buen desarrollo de los procesos vitales del organismo humano. Se cultiva de forma intensiva y el sistema por lote es el más utilizado a gran escala por su bajo riesgo de contaminación y fácil implementación (Infante et al., 2012). La creciente popularidad de Chlorella entre los consumidores y las obvias necesidades de producción de alimentos, ponen de manifiesto la importancia de buscar alternativas de producción de este grupo en ambientes marinos y continentales (Emad et al., 2015)

Muchas especies de Chlorella son eurihalinas, pero los límites de tolerancia de las especies varían considerablemente, sobre todo las que se encuentran distribuidas en ecosistemas costeros como las lagunas salinas y pozas efemerales, las cuales están sujetas a cambios de salinidades, donde adquiere importancia su capacidad de adaptación para sobrevivir en tales ambientes (Kirst, 1989; Adenan et al., 2013; Emad et al., 2015).

La producción de biomasa en Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana y Chlorella sp en aguas marinas y continentales no está bien definida y se requiere precisar los límites de salinidad que soportan estas especies, según lo indican algunos investigadores (Spolaore et al., 2006; Mathad y Hiremath, 2009; Krienitz et al., 2015).

Se ha demostrado que el factor salinidad disminuye los procesos metabólicos y la replicación celular y que, además, existe una correlación inversa entre la salinidad y la densidad celular. Por otro lado, el conocimiento de la dinámica de crecimiento de microalgas (tasa de inoculación, densidad celular en el tiempo, máxima tasa de crecimiento, tiempo de generación y producción de biomasa), productividad (producción de biomasa seca y clorofilas) y su manipulación, es indispensable para generar un sistema viable de producción, tanto técnico como económico (Graeff, 2003; Rodrigues y Belli-Filho, 2004; Yamamoto et al., 2004; Rodas et al., 2012).

En la actualidad se considera a C. peruviana una especie nativa poco estudiada, con un alto potencial para ser usado como fuente de alimento vivo para larvas de crustáceos, moluscos y peces e inclusión en dietas comerciales extruidas de inicio para peces, así como en biotecnología algal, como compuestos antivirales para el virus dengue. Los antecedentes que existen de la cepa en mención, aislada de las lagunas salinas costera, se limitan a su hábitat y descripciones taxonómicas (Vincens et al., 1971; Chacón, 1980; Montoya y Espinoza, 1985; Calvo-Pérez y Molinari, 2015).

El objetivo del presente estudio fue evaluar cinco concentraciones de salinidades sobre el crecimiento y productividad de C. peruviana, con el fin de conocer el nivel de salinidad óptimo que permita el mayor crecimiento, producción de biomasa y clorofila en menor tiempo en condiciones de laboratorio con un sistema de cultivo discontinuo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los cultivos se realizaron en el Laboratorio de Investigaciones Dulceacuícolas y de Cordados de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.

Recolecta y Aislamiento de la Cepa

Se utilizó una cepa de microalga Chlorella peruviana G. Chacón proveniente del cepario del laboratorio en mención y cultivado en medio f/2 (Guillard, 1975). La cepa original fue obtenida de muestras del fitoplancton de la laguna salina la «Mellisera» (12°54’ 20’’ LS y 76° 72’52’’ LW) en el distrito de Chilca, Lima, y aislada a partir de un cultivo masivo mediante técnica de rayado en placa y el método de la pipeta capilar para obtener un cultivo axénico.

Cultivo de Microalgas

Para determinar la salinidad óptima en el desarrollo de C. peruviana en cuanto a crecimiento (densidad celular) y productividad (biomasa y clorofila) se planteó evaluar cinco tratamientos de acuerdo al nivel de salinidad: 38‰ (T1), 44‰ (T2), 59‰ (T3), 88‰ (T4), y 176‰ (T5), con una temperatura de 27±2 °C y una intensidad de luz de 1250±10 lx. Asimismo, se consideraron tres repeticiones por tratamiento. Los valores de las salinidades se basaron en las recomendaciones de Kessler y Huss (1992) y Huss et al. (1999). Las concentraciones de sales requeridas se obtuvieron mediante mezcla de agua destilada y sal comercial común (Alveal, 1995), corroboradas con un refractómetro calibrado (ATAGO S/Mill). La salinidad inicial fue de 38‰ debido a que es el promedio de salinidad del lugar de estudio.

Se utilizó el sistema de cultivo discontinuo (no hay adición de nutrientes posterior a la inoculación) con medio f/2 (Guillard, 1975) preparado con agua de mar esterilizado y microfiltrado proveniente del Laboratorio de Cultivos Marinos del Instituto del Mar del Perú.

Para evaluar el efecto de los niveles de salinidad sobre las diversas fases de crecimiento de C. peruviana, se realizaron cultivos en tubos de ensayo con tapa esterilizada y aireación en medio de cultivo f/2 para una primera aclimatación a la variación de los niveles de salinidad. Posteriormente, se cultivaron en matraces de 250 ml por triplicado y aclimatados por 4 días. Para cada tratamiento se hicieron tres réplicas y a cada una de ellas se adicionaron inóculos (5 ml) de 0.27x106 cel/ml (T1), 0.33 x106 cel/ml (T2), 0.37x106 cel/ml (T3), 0.33 x106 cel/ml (T4) y 0.40x106 cel/ml (T5). Seguidamente se cultivaron en matraces de 500 y 1000 ml por siete días. Cada matraz fue sometido a aireación continua mediante una compresora magnética de aire Resum R ACO-003 a una presión de 0.027 MPa. Los cultivos fueron mantenidos bajo condiciones de laboratorio: temperatura (27±2 °C), intensidad de luz (1250±10 lx) y fotoperiodo (24:0 h).

La temperatura fue medida con un termómetro de mercurio convencional (-10 a 120 °C), el pH con un potenciómetro portátil OaktunpHTestr 1, previamente calibrado con amortiguador de 7.0 y 10.0 y la iluminación con un fotómetro Fisher Scientific. Las variables monitoreadas cada 24 horas fueron temperatura, iluminación, pH y densidad celular.

Crecimiento Poblacional Algal

La densidad celular (células/ml) se evaluó diariamente mediante contajes celulares en cámara de Neubauer de 0.1 mm de profundidad hasta alcanzar el inicio de la fase estacionaria (día 20), donde se retiró la aireación de las unidades experimentales a fin de inducir la sedimentación de la biomasa por espacio de tres días. Luego, la biomasa se separó del sobrenadante por decantación y se colocó extendida en placas petri para su secado al sol. La velocidad de crecimiento en la fase exponencial y el tiempo de duplicación fueron calculados según Wood et al. (2005), de la siguiente manera:

-Tasa de crecimiento de la población (r)=Ln (Nt /No)/Δt, donde No = tamaño de la población al inicio de un intervalo de tiempo, Nt = tamaño de la población al final de un intervalo de tiempo, y Δt = intervalo de tiempo (tt –to) en días

-Duplicaciones por día (k) = Log2(Nt/No)/Δt

-Tiempo de duplicación (T2) expresado en horas / división celular (T2) = 0.6931/r, donde r = tasa de crecimiento de la población, 0.6931 = Ln 2

Productividad Microalgal

La biomasa seca fue calculada por el método de centrifugación, según Molina et al. (2003), mientras que el total de clorofilas y las biomasas se calcularon según lo establecido por Nakanishi y Deuchi (2014).Acada fracción volumétrica se le determinó la turbidez; posteriormente, se colocó en un crisol de porcelana, se secó la muestra en un deshidratador a 60 ºC, se atemperó en un desecador a temperatura ambiente y, finalmente, se pesó en una balanza analítica OHAUS de 10 mg de precisión. La identidad de las clorofilas fue analizada por espectrofotómetro UV-2102C UNIC (longitudes de onda de máxima absorción: clorofila a 408 y 662 nm).

Análisis Estadístico

Los datos del contaje celular (cel/ml), biomasa microalgal (mg/l) y clorofila (mg/l) se analizaron mediante análisis de varianza con α=0.05, además de la prueba post hoc Tukey para la formación de subconjuntos homogéneos entre tratamientos. Los datos fueron procesados utilizando los programas Microsoft Excel® 2010 e IBM SPSS® v. 20.

RESULTADOS

La cepa nativa C. peruviana se desarrolló en todas las salinidades evaluadas durante la fase exponencial (Cuadro 1; Figura 1).Así mismo,seobservóunarápidaadaptación de la microalga al cambio de salinidad en los medios de cultivos anéxicos y discontinuos. Los análisis estadísticos (p<0.05) demostraron que los valores promedio de la densidad, biomasa seca y clorofila difieren significativamente entre los niveles de salinidad.

Densidad Celular

La cepa presentó un crecimiento más lento ante mayores niveles de salinidad (Cuadro 1). Los valores promedios de densidad celular crecieron cada día en todos los niveles de salinidad y fueron más elevados en la cepa cultivada a salinidades de 38‰ (42.3±2.6x106 cel/ml) y 44‰ (37.2±2.2x106 cel/ml). En cambio, la densidad celular descendió en un 19.2 y 19.4% respecto a la máxima obtenida en las salinidades de 59 y 88‰. El menor promedio de la densidad celular (16.1±1.4x106 cel/ml) correspondió a la cepa cultivada a la salinidad de 176‰, resultado que fue significativamente inferior (p<0.05) con respecto a la salinidad de 38‰.

Velocidad de Crecimiento

La salinidad mostró un efecto significativo ((F=4.904; p<0.05) sobre la velocidad de crecimiento y tiempo de duplicación en la fase exponencial de la cepa nativa de C. peruviana (Cuadro 2). En la salinidad de 38‰ se observó el mayor crecimiento con valores de r= 0.61, K=0.88 y T2=1.14 h por división celular en los cultivos. Por otro lado, en otros regímenes de salinidad, el crecimiento algal se mantuvo próximo a la velocidad de crecimiento y tiempo de duplicación, con excepción de la salinidad de 17 ‰, donde la población celular creció moderadamente con valores r= 0.20, K=0.28 y T2=3.51 h por división celular.

El análisis de la velocidad de crecimiento mostró que las tasas de crecimiento de población (r) y la duplicación por día (k) se van reduciendo conforme aumenta la salinidad, de modo que se puede afirmar que existe una relación significativa (p<0.05) entre el tiempo de duplicación en horas/división celular (t2) y salinidad.

Productividad: Biomasa y Clorofila

El máximo valor de productividad de biomasa seca se obtuvo con la salinidad de 38‰ con un valor de 397.9 ± 2.3 mg/l (p<0.05). Las salinidades de 44 y 59‰ presentaron valores próximos a la salinidad de 38‰ (390.5 ± 2.3 y 389.6 ± 2.3 mg/l, respectivamente) (Figura 2).

Asimismo, hubo diferencia significativa (p<0.05) entre los valores promedio de la clorofila durante la fase exponencial. Las salinidades de 38 y 44‰ presentaron los mayores contenidos de clorofila total: 80.2 ± 2.3 mg/1 y 76.7± 1.5 mg/l, respectivamente; mientras que con 59% de salinidad se encontró un valor de 75.7 ± 2.4 mg/l, y con la salinidad de 176‰ solo se llegó a obtener 65.8 ± 1.3 mg/l de biomasa seca de clorofila.

DISCUSIÓN

Los resultados confirman que la cepa nativa de C. peruviana de la laguna salina superficial de Chilca es eurihalina, lo que indica que la microalga se adapta rápidamente al cambio de salinidad; en este caso, desde una salinidad de 38‰ hasta 176‰ desde el primer día hasta los 19 días de la siembra del inóculo (Cuadro 1; Figura 1). Esta condición también puede ser atribuida al estado de desarrollo, al sistema de cultivo, cantidad y tipo de alimento y, consecuentemente, a las condiciones de manejo.

De acuerdo a las fuentes de nutrientes del medio de cultivo, se ha demostrado que el medio f/2 (Guillard) mejora el crecimiento y mantiene viable la cepa nativa. Diversos reportes indican que este medio nutritivo en cultivo discontinuo contribuye a una mayor productividad y crecimiento en distintas especies de microalgas, cuando se trata con cultivos en medios no salinos y salinos (Markou et al., 2014; Ramaraj et al., 2015). Chacón (1980) formuló dos medios de cultivo para crecimiento microalgal teniendo como base el agua de las salinas de Chilca y un medio artificial similar a la composición del agua de la laguna. Calvo-Perez y Molinari (2015) indicaron que el medio de cultivo Calderón (Serpa y Calderón, 2005) con NaCl saturado puede ser utilizado para especies microalgales de ambientes hipersalinos, validándolo en C. peruviana al encontrar una alta densidad en sus cultivos, aunque no llegaron a reportar sus valores.

La salinidad del medio de cultivo ejerció una disminución en las densidades celulares. En la laguna salinas de Chilca, situada a 100 msnm, la salinidad es variable, registrándose entre 30.25‰ y 117.22‰ (Chacón, 1980), debido al origen del sistema acuático que se encuentra influenciado por aguas saladas subterráneas. El 38‰ es el promedio de salinidad del sistema, valor que coincidió con la máxima producción de las tasas de crecimiento poblacional de la cepa nativa. Este aspecto es muy importante para una posible aplicación práctica y trabajos específicos en lagunas con salinidades superiores a los del mar, pues allí existe una baja diversidad de organismos por la adaptación a la osmoregulación.

Cabe señalar que diversos autores reportan que ciertas cepas de Chlorella tienen crecimientos óptimos entre 40 y 180‰ de salinidad (Kessler y Huss,1992; Huss et al., 1999; Wehr y Sheath, 2003; Xu et al., 2006; Chinnasamy et al., 2010). De igual forma, Moronta et al. (2006) demostraron que las cepas de C. sorokiniana tuvieron una tendencia decreciente en relación a las salinidades. Es importante considerar que Chlorella es un género de microalgas clorofíceas que se caracteriza por presentar un rápido crecimiento en cultivo celular y por su capacidad de utilizar como sustrato nutricional compuestos orgánicos e inorgánicos (Wehr y Sheath, 2003; Xu et al., 2006; Chinnasamy et al., 2010; Sing y Sharma, 2014).

A diferencia de lo reportado en este trabajo, Emad et al. (2015) reportan que C. vulgaris tuvo crecimientos máximos de 30x106 a 125x106 cel/ml para la salinidad de 25‰ enriquecida con el medio de cultivo f/2. Mora et al. (2005) señala para Chlorella sp, aislada de las aguas de la represa de Tulé (Venezuela) una densidad de 79.51x106 cel/ml en los cultivos controles con agua potable no destilada y con medio f/2; en cambio cuando fue cultivada a 25 y 35‰ de salinidad disminuyó la densidad celular de 1.75x106 a 1.47x106 cel/ml. Moronta et al. (2006) demostraron que las cepas de C. sorokiniana presentan densidades celulares en medio no salino con 59.18x106 cel/ml para los cultivos no axénicos y de 109.11 y 89.70x106 cel/ml en cultivos mixotróficos y heterotróficos, respectivamente. Otros autores, han demostrado que otras cepas de Chlorella aisladas de ambientes marinos y salobres presentan bajas densidades celulares. Así, Illman et al. (2000) encontraron una densidad promedio de 6x106 cel/ml y una biomasa de 460 mg/l a partir del uso del medio f/2; Shah et al. (2003) lograron obtener un crecimiento de 16x106 cel/ml utilizando el sistema f/2; y Cao et al. (2014) mencionan que la mayor biomasa en cultivos con el medio f/2 lo obtienen a una salinidad del 20‰.

En cada especie de Chlorella, la concentración de biomasa debe variar en relación al rango de tolerancias de salinidades y al medio de cultivo (Wehr y Sheath, 2003; Xu et al., 2006; Chinnasamy et al., 2010). Por estos motivos, las especies del género Chlorella han sido ampliamente estudiadas para incluirlas en procesos biotecnológicos que generen productos destinados a las industrias alimenticias, farmacéuticas, de saneamiento ambiental, agropecuarias y energéticas (Chisti, 2007). Específicamente C. sorokiniana posee un gran potencial para la producción de ácidos grasos omega 3, 6 y 9; además de la producción de biocombustibles (Spolaore et al., 2006; Chisti, 2007; Sing y Goyal, 2007). Los valores extremos de salinidades afectan negativamente las tasas de fotosíntesis, respiración y crecimiento de las microalgas marinas (Bermúdez et al., 2002; Helm et al., 2006).

La salinidad del medio de cultivo ejerció una relación negativa en las tasas de crecimiento y tiempo de duplicación en la fase exponencial de la cepa nativa de C. peruviana, debido al hecho que las células disminuyen la duplicación con el aumento de la salinidad, comportamiento observado en otros estudios (Ortiz et al., 2012; Emad et al., 2015).

La mayor biomasa seca y contenido de clorofila en los cultivos fue obtenida en los cultivos de 38‰ de salinidad (Cuadro 3). El efecto de elevadas salinidades sobre la biomasa seca y clorofila se ha reportado en Chlorella sp, cepa nativa aislada de la represa de Tule, Venezuela, con un incremento en biomasa y clorofila de hasta 70% (Mora et al., 2005). Este resultado obedece al hecho que las células disminuyen la velocidad de crecimiento con la salinidad, con lo cual permanecen de mayor tamaño respecto a las células de menor tamaño no sometida a salinidades, las cuales exhiben la menor tasa de duplicación (Latala, 1991; Hiremath y Mathad, 2010).

C. peruviana tiene una alta tolerancia por las aguas salinas y aparenta ser una buena candidata para sistemas de cultivo en agua de mar y salobre. Su cultivo parece factible en salinidades hasta al menos 176‰. Chlorella es considerada como una microalga eurihalina con una mayor tolerancia a las altas concentraciones de sal en el agua que la Chlorella vulgaris (Nakanishi y Deuchi, 2014).

CONCLUSIONES

  • La microalga nativa Chlorella peruviana demostró factibilidad de cultivo y capacidad de crecimiento entre 38 y 176‰ de salinidad, con una óptima a 38‰, mientras que el contenido celular de biomasa seca y de clorofila presenta un máximo en el nivel de 38‰ de salinidad. Sin embargo, es necesario probar salinidades en menores concentraciones para fines comparativos.

  • La salinidad influye negativamente sobre el crecimiento, biomasa y contenido de clorofila de la microalga.

Agradecimientos

El presente estudio fue parcialmente financiado por el proyecto N.° 132-FINCyTIB-2013. Los autores manifiestas su agradecimiento a la Universidad Nacional Mayor de San Marcos por el apoyo en la coordinación de esta investigación.

LITERATURA CITADA

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Recibido: 15 de febrero de 2017

Aceptado para publicación: 27 de julio de 2017

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